本发明涉及生物制药领域，特别涉及一种米贝尔霉素制备方法。
背景技术：
米尔贝霉素是一种具有十六环内酯的化合物，作为一种新的生物农药，具有广谱、高效、低毒的特性，和阿维菌素一起被誉为活性最高的杀虫剂。同时米尔贝霉素也是合成米尔贝肟的直接原料，米尔贝肟则是一种新型的本合成大环内酯类驱虫药物，对控制和预防大部分寄生虫疾病都有良好效果。因此，高纯度米尔贝霉素的制备生产对农业、医药行业与动物保健行业具有十分积极的作用。
在现有的米尔贝霉素生产方法中多采用甲醇等有机溶剂对湿菌渣直接浸提，存在以下不足：发酵液过滤后得到的湿菌渣未经过干燥处理，容易发生霉变，影响产品质量；提取和制备过程使用到甲醇等毒性溶剂，不利于对操作者的保护；步骤繁杂，使用有机溶剂种类多且消耗量大，安全风险大；同时整个工艺流程需要耗费大量的有机溶剂，且所制得的米尔贝霉素的纯度较低且收率不理想。
作为改进，谢捷等于2014年在《浙江工业大学学报》第42卷(第4期)第413-417页上发表了“大孔树脂分离纯化米尔贝霉素工艺研究”，用7bv的70％乙醇溶液进行洗涤，然后用4bv的90％乙醇溶液以1.5bv/h流速进行洗脱；申请号为201410815127.9的中国专利公开了一种高纯度米尔贝霉素的生产方法，将含米尔贝霉素α1和α3的发酵液的菌渣用第一溶媒水溶液进行提取，提取液经非极性大孔树脂层析纯化，将解吸液超滤，并纳滤浓缩小体积后加入水通过第二溶媒反萃，得到的萃取液浓缩后，在8～13℃用第三溶媒水溶液洗涤，得到的第三溶媒水溶液浓缩后再次加水和用第二溶媒反萃。反萃液浓缩，降温结晶，潮晶用无水乙醇溶解，过滤膜后滴加到纯化水中再次结晶，分离晶体，减压干燥得到高纯度米尔贝霉素的类白色粉末；虽然上述两个工艺制备所得的米尔贝霉素的纯度得到了一定的提高，但是米尔贝霉素的收率均较低。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服了上述缺陷，提供一种米尔贝霉素纯度高且收率高的米贝尔霉素制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
本发明提供一种米贝尔霉素制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将米尔贝霉素湿菌渣干燥成水分含量为4～6％的米尔贝霉素干菌渣；
步骤2：向步骤1的米尔贝霉素干菌渣添加乙醇进行浸提，然后过滤，得到米尔贝霉素浸提乙醇液；
步骤3：用正己烷、正庚烷或正辛烷中的任意一种溶剂与水对步骤2的米尔贝霉素浸提乙醇液进行萃取得萃取液，并将萃取液进行浓缩，制得待上柱液；
步骤4：将步骤3的待上柱液用柱层析法进行分离纯化，以100～200目柱层析硅胶为固定相，以丙酮-正己烷、丙酮-正庚烷或丙酮-正辛烷中的任意一种为洗脱液，得米尔贝霉素有效组分，然后浓缩得到米尔贝霉素。
本发明还提供一种米贝尔霉素制备方法，包括以下步骤：
步骤1：利用板框过滤器将米尔贝霉素发酵液进行固液分离，制得米尔贝霉素湿菌渣，将米尔贝霉素湿菌渣用闪蒸干燥机干燥成水分含量为4～6％的米尔贝霉素干菌渣，控制进风温度为105～120℃、出风温度为70～80℃；
步骤2：向步骤1每1kg米尔贝霉素干菌渣中添加3～4l体积浓度为92～97％的乙醇进行搅拌浸提4～5h，然后过滤，得到米尔贝霉素浸提乙醇液；
步骤2与步骤3之间：向步骤2所得米尔贝霉素浸提乙醇液中添加活性炭进行搅拌脱色30～40min，得到脱色后的米尔贝霉素浸提乙醇液；
步骤3：用正庚烷与水对脱色后的米尔贝霉素浸提乙醇液进行萃取得萃取液，并将萃取液进行浓缩，制得待上柱液；
步骤4：将步骤3的待上柱液用柱层析法进行分离纯化，以100～200目柱层析硅胶为固定相，以丙酮-正庚烷为洗脱液，洗脱的方法为梯度洗脱，具体包括以下步骤：
步骤a：先用3％丙酮-正庚烷作为洗脱液进行洗脱至米尔贝霉素的色谱纯度为60％，3％丙酮-正庚烷表示丙酮与正庚烷的体积比为3∶97；
步骤b：当米尔贝霉素的色谱纯度为60％后，用3.5％丙酮-正庚烷作为洗脱液进行洗脱，直至米尔贝霉素的色谱纯度为80％，3.5％丙酮-正庚烷表示丙酮与正庚烷的体积比为3.5∶96.5；
步骤c：当米尔贝霉素的色谱纯度为80％后，用4.0％丙酮-正庚烷作为洗脱液进行洗脱，直至米尔贝霉素的色谱纯度为90％以上，得米尔贝霉素有效组分，然后浓缩得到米尔贝霉素，其中4.0％丙酮-正庚烷表示丙酮与正庚烷的体积比为4∶96。
本发明的有益效果在于：(1)将米尔贝霉素湿菌渣干燥成低水分含量的干菌渣再进行浸提，相对湿菌渣直接浸提可以节约98.5％的浸提试剂量，有效降低了有机溶剂的使用量，降低生产成本，且有助于菌渣中米尔贝霉素被提取完全，提高米尔贝霉素的收率；(2)将米尔贝霉素菌渣干燥有助于米尔贝霉素菌渣的保存，减小霉变杂质的产生，经试验证明菌渣干燥后浸提，可将浸提液中米尔贝霉素的纯度提高至70～75％，方便后续层析纯化以提高最终的纯度；(3)提取纯化过程采用乙醇和正庚烷，这两种溶剂对人体无害，相对毒性大的甲醇而言，更加安全；(4)本方法萃取后再进行层析纯化，可以在相转移过程中将部分杂质通过水层去除，这可以在一定程度上提高层析柱的上柱量，也能提高洗脱后的米尔贝霉素纯度，从而提高产品收率；(5)通过采用柱层析的方法进行分离纯化，选用上述试剂为洗脱液达到很好的纯化效果；(6)本发明的提取纯化方法，相对传统的树脂分离方法而言，简化了步骤，减小了米尔贝霉素在各步骤中的损耗，同时操作方便，且制备出的米尔贝霉素的纯度高(94％以上)且收率高(81％以上)。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详予说明。
本发明最关键的构思在于：利用将米尔贝霉素菌渣干燥及层析方法对米尔贝霉素进行纯化以制备出纯度高且收率高的米尔贝霉素。
本发明提供一种米贝尔霉素制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将米尔贝霉素湿菌渣干燥成水分含量为4～6％的米尔贝霉素干菌渣；
步骤2：向步骤1的米尔贝霉素干菌渣添加乙醇进行浸提，然后过滤，得到米尔贝霉素浸提乙醇液；
步骤3：用正己烷、正庚烷或正辛烷中的任意一种溶剂与水对步骤2的米尔贝霉素浸提乙醇液进行萃取得萃取液，并将萃取液进行浓缩，制得待上柱液；
步骤4：将步骤3的待上柱液用柱层析法进行分离纯化，以100～200目柱层析硅胶为固定相，以丙酮-正己烷、丙酮-正庚烷或丙酮-正辛烷中的任意一种为洗脱液，得米尔贝霉素有效组分，然后浓缩得到米尔贝霉素。
本发明的工作原理为：将米尔贝霉素干燥减小水分含量以减小提取所需的试剂，同时存放时可以有效避免产生霉变杂质的产生，有利于后续层析纯化；硅胶层析主要是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得以分离，其中有微孔，对不同化合物的吸附能力不同，然后选用合适的洗脱剂进行洗脱从而达到分离；整个工艺的流程为：菌渣干燥、浸提、萃取然后层析纯化，萃取后再层析纯化，可以在相转移过程中将部分杂质通过水层去除，这可以在一定程度上提高层析柱的上柱量，也能提高洗脱后的米尔贝霉素纯度，从而提高产品收率；若直接进行层析纯化，由于杂质量较大只能控制降低层析上柱量，以保证层析纯化效果，同时也不利于纯化后纯度的提高，从而不利于产品收率的提高。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：((1)将米尔贝霉素湿菌渣干燥成低水分含量的干菌渣再进行浸提，相对湿菌渣直接浸提可以节约98.5％的浸提试剂量，有效降低了有机溶剂的使用量，降低生产成本，且有助于菌渣中米尔贝霉素被提取完全，提高米尔贝霉素的收率；(2)将米尔贝霉素菌渣干燥有助于米尔贝霉素菌渣的保存，减小霉变杂质的产生，经试验证明菌渣干燥后浸提，可将浸提液中米尔贝霉素的纯度提高至70～75％，方便后续层析纯化以提高最终的纯度；(3)提取纯化过程采用乙醇和正庚烷，这两种溶剂对人体无害，相对毒性大的甲醇而言，更加安全；(4)本方法萃取后再进行层析纯化，可以在相转移过程中将部分杂质通过水层去除，这可以在一定程度上提高层析柱的上柱量，也能提高洗脱后的米尔贝霉素纯度，从而提高产品收率；(5)通过采用柱层析的方法进行分离纯化，选用上述试剂为洗脱液达到很好的纯化效果；(6)本发明的提取纯化方法，相对传统的树脂分离方法而言，简化了步骤，减小了米尔贝霉素在各步骤中的损耗，同时操作方便，且制备出的米尔贝霉素的纯度高(94％以上)且收率高(81％以上)。
进一步的，步骤4中以丙酮-正庚烷为洗脱液，洗脱的方法为梯度洗脱，具体包括以下步骤：
步骤a：先用3％丙酮-正庚烷作为洗脱液进行洗脱至米尔贝霉素的色谱纯度为60％，3％丙酮-正庚烷表示丙酮与正庚烷的体积比为3∶97；
步骤b：当米尔贝霉素的色谱纯度为60％后，用3.5％丙酮-正庚烷作为洗脱液进行洗脱，直至米尔贝霉素的色谱纯度为80％，3.5％丙酮-正庚烷表示丙酮与正庚烷的体积比为3.5∶96.5；
步骤c：当米尔贝霉素的色谱纯度为80％后，用4.0％丙酮-正庚烷作为洗脱液进行洗脱，直至米尔贝霉素的色谱纯度为90％以上，4.0％丙酮-正庚烷表示丙酮与正庚烷的体积比为4∶96。
由上述描述可知，由于柱层析硅胶中除了吸附有米尔贝霉素还吸附有与米尔贝霉素结构相似的杂质，由于丙酮是极性溶剂，正庚烷为非极性溶剂，丙酮体积浓度过高则可能导致吸附在柱层析硅胶上的不同物质全部被洗脱下来，达不到分离纯化的效果，而正庚烷的体积浓度过高则吸附在柱层析硅胶上的不同物质无法洗脱，也达不到洗脱的效果，而采用上述比例的丙酮-正庚烷进行梯度洗脱，有利于先将杂质洗脱，再将有效成分洗下，即有利于洗脱掉杂质但较好保留有效成分，分离纯化效果好，提高米尔贝霉素的纯度及收率。
进一步的，在步骤2与步骤3之间，还包括将步骤2所得米尔贝霉素浸提乙醇液进行脱色，得到脱色后的米尔贝霉素浸提乙醇液。
由上述描述可知，对浸提乙醇液进行脱色，可以去除一些有颜色的杂质，减小杂质对层析纯化的干扰，进一步提高层析纯度，进而提高最终制得的米尔贝霉素的纯度。
进一步的，所述脱色包括向步骤2所得米尔贝霉素浸提乙醇液添加活性炭，搅拌30～40min。
由上述描述可知，用活性炭进行搅拌脱色，脱色方法简单，活性炭的脱色效果好且成本低，还方便后续与液体的分离。
进一步的，步骤2的具体操作为：向步骤1每1kg米尔贝霉素干菌渣中添加3～4l体积浓度为92～97％的乙醇进行搅拌浸提4～5h，然后过滤，得到米尔贝霉素浸提乙醇液。
由上述描述可知，采用体积浓度为92～97％的乙醇进行浸提，能同时兼顾成本与米尔贝霉素的收率，收率较高且成本较低，浓度太低则会降低米尔贝霉素的收率，浓度太高则成本需大幅度提升且浓度再提高对收率改善甚微，搅拌浸提4～5h确保米尔贝霉素菌渣与乙醇充分接触，进一步提高最终的米尔贝霉素的收率。
进一步的，还包括米尔贝霉素湿菌渣的制备，具体操作为：将米尔贝霉素发酵液进行固液分离，制得米尔贝霉素湿菌渣。
进一步的，所述步骤1的具体操作为：将米尔贝霉素湿菌渣用闪蒸干燥机干燥成含量为4～6％的米尔贝霉素干菌渣，控制进风温度为105～120℃、出风温度为70～80℃。
由上述描述可知，采用闪蒸干燥机对米尔贝霉素湿菌渣进行干燥，快速高效且不破坏米尔贝霉素菌渣中的米尔贝霉素。
本发明还提供一种米贝尔霉素制备方法，包括以下步骤：
步骤1：利用板框过滤器将米尔贝霉素发酵液进行固液分离，制得米尔贝霉素湿菌渣，将米尔贝霉素湿菌渣用闪蒸干燥机干燥成水分含量为4～6％的米尔贝霉素干菌渣，控制进风温度为105～120℃、出风温度为70～80℃；
步骤2：向步骤1每1kg米尔贝霉素干菌渣中添加3～4l体积浓度为92～97％的乙醇进行搅拌浸提4～5h，然后过滤，得到米尔贝霉素浸提乙醇液；
步骤2与步骤3之间：向步骤2所得米尔贝霉素浸提乙醇液中添加活性炭进行搅拌脱色30～40min，得到脱色后的米尔贝霉素浸提乙醇液；
步骤3：用正庚烷与水对脱色后的米尔贝霉素浸提乙醇液进行萃取得萃取液，并将萃取液进行浓缩，制得待上柱液；
步骤4：将步骤3的待上柱液用柱层析法进行分离纯化，以100～200目柱层析硅胶为固定相，以丙酮-正庚烷为洗脱液，洗脱的方法为梯度洗脱，具体包括以下步骤：
步骤a：先用3％丙酮-正庚烷作为洗脱液进行洗脱至米尔贝霉素的色谱纯度为60％，3％丙酮-正庚烷表示丙酮与正庚烷的体积比为3∶97；
步骤b：当米尔贝霉素的色谱纯度为60％后，用3.5％丙酮-正庚烷作为洗脱液进行洗脱，直至米尔贝霉素的色谱纯度为80％，3.5％丙酮-正庚烷表示丙酮与正庚烷的体积比为3.5∶96.5；
步骤c：当米尔贝霉素的色谱纯度为80％后，用4.0％丙酮-正庚烷作为洗脱液进行洗脱，直至米尔贝霉素的色谱纯度为90％以上，得米尔贝霉素有效组分，然后浓缩得到米尔贝霉素，其中4.0％丙酮-正庚烷表示丙酮与正庚烷的体积比为4∶96。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：(1)将米尔贝霉素湿菌渣干燥成低水分含量的干菌渣再进行浸提，相对湿菌渣直接浸提可以节约98.5％的浸提试剂量，有效降低了有机溶剂的使用量，降低生产成本，且有助于菌渣中米尔贝霉素被提取完全，提高米尔贝霉素的收率；(2)将米尔贝霉素菌渣干燥有助于米尔贝霉素菌渣的保存，减小霉变杂质的产生，经试验证明菌渣干燥后浸提，可将浸提液中米尔贝霉素的纯度提高至70～75％，方便后续层析纯化以提高最终的纯度；(3)提取纯化过程采用乙醇和正庚烷，这两种溶剂对人体无害，相对毒性大的甲醇而言，更加安全；(4)本方法萃取后再进行层析纯化，可以在相转移过程中将部分杂质通过水层去除，这可以在一定程度上提高层析柱的上柱量，也能提高洗脱后的米尔贝霉素纯度，从而提高产品收率；(5)通过采用柱层析的方法进行分离纯化，选用上述试剂为洗脱液达到很好的纯化效果；(6)本发明的提取纯化方法，相对传统的树脂分离方法而言，简化了步骤，减小了米尔贝霉素在各步骤中的损耗，同时操作方便，且制备出的米尔贝霉素的纯度高(94％以上)且收率高(81％以上)。
实施例1
一种米贝尔霉素制备方法(以800kg米尔贝霉素湿菌渣生产为例)，包括以下步骤：
步骤1：利用板框过滤器将米尔贝霉素发酵液进行固液分离，制得米尔贝霉素湿菌渣800kg，测定湿菌渣中米尔贝霉素的含量，将米尔贝霉素湿菌渣用闪蒸干燥机干燥成水分含量为4～6％的米尔贝霉素干菌渣，控制进风温度为105～120℃、出风温度为70～80℃；
步骤2：向步骤1每1kg米尔贝霉素干菌渣中添加3l体积浓度为92％的乙醇进行搅拌浸提4h，然后过滤，得到米尔贝霉素浸提乙醇液；
步骤2与步骤3之间：向步骤2所得米尔贝霉素浸提乙醇液中添加活性炭进行搅拌脱色30min，得到脱色后的米尔贝霉素浸提乙醇液；
步骤3：用正庚烷与水对脱色后的米尔贝霉素浸提乙醇液进行萃取得萃取液，并将萃取液进行浓缩，制得待上柱液；
步骤4：将步骤3的待上柱液用柱层析法进行分离纯化，以100～200目柱层析硅胶为固定相，以丙酮-正庚烷为洗脱液，洗脱的方法为梯度洗脱，具体包括以下步骤：
步骤a：先用3％丙酮-正庚烷作为洗脱液进行洗脱至米尔贝霉素的色谱纯度为60％，3％丙酮-正庚烷表示丙酮与正庚烷的体积比为3∶97；
步骤b：当米尔贝霉素的色谱纯度为60％后，用3.5％丙酮-正庚烷作为洗脱液进行洗脱，直至米尔贝霉素的色谱纯度为80％，3.5％丙酮-正庚烷表示丙酮与正庚烷的体积比为3.5∶96.5；
步骤c：当米尔贝霉素的色谱纯度为80％后，用4.0％丙酮-正庚烷作为洗脱液进行洗脱，直至米尔贝霉素的色谱纯度为90％以上，得米尔贝霉素有效组分，然后浓缩得到米尔贝霉素，其中4.0％丙酮-正庚烷表示丙酮与正庚烷的体积比为4∶96。采用hplc法测定产品中米尔贝霉素的纯度。
米尔贝霉素湿菌渣的米尔贝霉素含量、层析后米尔贝霉素含量、所制得的米尔贝霉素收率及纯度详见表1。
实施例2
一种米贝尔霉素制备方法(以800kg米尔贝霉素湿菌渣生产为例)，本实施例的操作方法与实施例1相同，不同之处在于，步骤2为向步骤1每1kg米尔贝霉素干菌渣中添加4l体积浓度为97％的乙醇进行搅拌浸提5h，然后过滤，得到米尔贝霉素浸提乙醇液；
步骤2与步骤3之间：向步骤2所得米尔贝霉素浸提乙醇液中添加活性炭进行搅拌脱色40min，得到脱色后的米尔贝霉素浸提乙醇液。
米尔贝霉素湿菌渣的米尔贝霉素含量、层析后米尔贝霉素含量、所制得的米尔贝霉素收率及纯度详见表1。
实施例3
一种米贝尔霉素制备方法(以800kg米尔贝霉素湿菌渣生产为例)，本实施例的操作方法与实施例1相同，不同之处在于，步骤2为向步骤1每1kg米尔贝霉素干菌渣中添加3.5l体积浓度为95％的乙醇进行搅拌浸提4.5h，然后过滤，得到米尔贝霉素浸提乙醇液；
步骤2与步骤3之间：向步骤2所得米尔贝霉素浸提乙醇液中添加活性炭进行搅拌脱色35min，得到脱色后的米尔贝霉素浸提乙醇液。
米尔贝霉素湿菌渣的米尔贝霉素含量、层析后米尔贝霉素含量、所制得的米尔贝霉素收率及纯度详见表1。
实施例4
一种米贝尔霉素制备方法(以800kg米尔贝霉素湿菌渣生产为例)，本实施例的操作方法与实施例1相同，不同之处在于，步骤2为向步骤1每1kg米尔贝霉素干菌渣中添加3.5l体积浓度为95％的乙醇进行搅拌浸提4.5h，然后过滤，得到米尔贝霉素浸提乙醇液；
步骤2与步骤3之间：向步骤2所得米尔贝霉素浸提乙醇液中添加活性炭进行搅拌脱色35min，得到脱色后的米尔贝霉素浸提乙醇液。
米尔贝霉素湿菌渣的米尔贝霉素含量、层析后米尔贝霉素含量、所制得的米尔贝霉素收率及纯度详见表1。
表1实施例1～4中米尔贝霉素湿菌渣的米尔贝霉素含量、层析后米尔贝霉素含量、所制得的米尔贝霉素收率及纯度详见表1。
实施例5
本实施例的操作方法同实施例1，不同之处在于，改变洗脱试剂，
洗脱液a为实施例1中的3.0％丙酮-正庚烷洗脱液、3.5％丙酮-正庚烷洗脱液、4.0％丙酮-正庚烷洗脱液；
洗脱液b为谢捷等于2014年在《浙江工业大学学报》第42卷(第4期)第413-417页的“大孔树脂分离纯化米尔贝霉素工艺研究”7bv的70％乙醇溶液进行洗涤，然后用4bv的90％乙醇溶液以1.5bv/h流速进行洗脱；
洗脱液c为申请号为201410815127.9的中国专利公开了一种高纯度米尔贝霉素的生产方法的：70％乙醇溶液进行洗脱，得到的结果如表2，
表2
实施例6
(1)米尔贝霉素湿菌渣干燥后进行浸提的优势见表3，
表3菌渣含水量对浸提乙醇的消耗量及浸提收率的影响
由上表可知，干燥后，乙醇使用量节省98.5％，浸提得到的浸提液中米尔贝霉素纯度提高至70％～75％。
(2)米尔贝霉素湿菌渣干燥后对堆放过程中杂质的影响见表4，
表4米尔贝霉素湿菌渣干燥后对堆放过程中杂质的影响
由上表可知，干燥菌渣，可以降低堆放过程中杂质的生成。
综上所述，本发明提供的米贝尔霉素制备方法，将米尔贝霉素湿菌渣干燥成低水分含量的干菌渣再进行浸提，相对湿菌渣直接浸提可以节约98.5％的浸提试剂量，有效降低了有机溶剂的使用量，降低生产成本，且有助于菌渣中米尔贝霉素被提取完全，提高米尔贝霉素的收率；将米尔贝霉素菌渣干燥有助于米尔贝霉素菌渣的保存，减小霉变杂质的产生，经试验证明菌渣干燥后浸提，可将浸提液中米尔贝霉素的纯度提高至70～75％，方便后续层析纯化以提高最终的纯度；提取纯化过程采用乙醇和正庚烷，这两种溶剂对人体无害，相对毒性大的甲醇而言，更加安全；本方法萃取后再进行层析纯化，可以在相转移过程中将部分杂质通过水层去除，这可以在一定程度上提高层析柱的上柱量，也能提高洗脱后的米尔贝霉素纯度，从而提高产品收率；通过采用柱层析的方法进行分离纯化，选用上述试剂为洗脱液达到很好的纯化效果；本发明的提取纯化方法，相对传统的树脂分离方法而言，简化了步骤，减小了米尔贝霉素在各步骤中的损耗，同时操作方便，且制备出的米尔贝霉素的纯度高(94％以上)且收率高(81％以上)。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。