一种用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备及使用方法与流程

文档序号:12699701阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:

(1)设计特异性引物和探针:以副猪嗜血杆菌的infB基因序列为靶序列,设计特异性引物和探针,副猪嗜血杆菌上游引物基因序列如序列表中SEQ ID NO:1所示,副猪嗜血杆菌下游引物基因序列如序列表中SEQ ID NO:2所示,所述的探针基因序列如序列表中SEQ ID NO:3所示;

(2)对上述特异性引物和探针进行合成,制得合成探针;

(3)基因芯片的制备:用TE Buffer溶解合成探针,在醛基化基片上接触式点样,点样完毕后将基因芯片干燥。

2.根据权利要求1所述的用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述的特异性引物浓度为10μM/L。

3.根据权利要求1所述的用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备方法,其特征在于,步骤(3)中所述的探针浓度为5μM/L-20μM/L。

4.根据权利要求1所述的用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备方法,其特征在于,步骤(3)中接触式点样的环境参数为相对湿度55%-65%,温度15℃-30℃。

5.根据权利要求1所述的用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,干燥过程是静置于80℃烘箱干燥2小时。

6.一种如权利要求1-5任一所述的用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的使用方法,其特征在于,包括以下步骤:

(1)提取待测副猪嗜血杆菌细菌的基因组DNA;

(2)杂交用PCR产物的制备:采用不对称PCR,先预混合反应体系中除下游引物以外的所有成分,然后在暗室中加入下游引物,混匀后置于PCR仪进行扩增。所述的反应体系为:5μl 5×Buffer,1μl上游引物,2μl下游引物,2.0μl dNTP,1.0μl模板DNA,0.3μl Prime STAR,13.7μl ddH2O,总体积为25μl;PCR扩增反应条件为:94℃预变性5min,94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,30次循环,72℃延伸5min;

(3)杂交用PCR产物与用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片杂交:将杂交用PCR产物置于PCR仪上98℃变性10min后,立即取出冰浴5min,取杂交用PCR产物40μl和杂交缓冲液160μl加入离心管中,混匀后取该混合液加到基因芯片的点样区,将基因芯片放入杂交盒内,置于49℃水浴锅中避光杂交2h;

(4)杂交后基因芯片的洗涤与干燥:将杂交后基因芯片放置在玻片架上,立即用洗液洗涤三次,每次2min,离心干燥;

(5)洗涤后基因芯片的结果分析:将洗涤后基因芯片置于激光共聚焦扫描仪上扫描,分析Cy3荧光信号的强度和比值。

7.根据权利要求6所述的用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的使用方法,其特征在于,dNTP的浓度为10mmol/μl。

8.根据权利要求6所述的用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的使用方法,其特征在于,所述的基因芯片三次洗涤所用洗液依次分别为1×SSC/0.2%SDS,0.1×SSC/0.2%SDS,0.1×SSC。

9.根据权利要求6所述的用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的使用方法,其特征在于,所述的基因芯片杂交结果判定的依据如下:

(1)模板DNA的PCR扩增效果良好;

(2)信号强度中位值≥1000,结合杂交扫描图像,杂交斑点清晰;

(3)检测基因芯片的杂交结果判断时引入样点信号阈值概念SNR,且SNR≥1.5。

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