一种利用基因工程改造酿酒酵母，将改造后的酿酒酵母与未改造的酿酒酵母混合培养，使酿酒酵母社会行为改变，从而提升对糖的利用率，继而提升乙醇产量的方法，属于发酵工程范畴。
背景技术：
传统化石能源日益衰竭，人们对相关环境问题越发关注，寻求合适的新能源成为科学家研究的重点。生物燃料乙醇作为一种可再生的清洁能源应运而生，它将能帮助人们减缓能源危机，减轻环境污染。
生物乙醇可以通过各种不同的可再生资源进行生产。由糖类和淀粉类原材料进行发酵获得的乙醇称为“第一代生物乙醇”。在巴西，主要以甘蔗等蔗糖原料生产乙醇，而在美国、中国、加拿大、法国等，主要以玉米谷物等淀粉原料生产乙醇。全球每年大约有2000万立方米乙醇由蔗糖生产，6000万立方米乙醇由玉米谷物生产。
酿酒酵母、运动发酵单胞菌等多种微生物均可以发酵生产乙醇，其中酿酒酵母(saccharomycescerevistae)是生物乙醇工业生产中应用最多的菌种。酿酒酵母是兼性厌氧菌，无氧呼吸时产生酒精，所以发酵生产乙醇的过程是厌氧的。一分子葡萄糖经过糖酵解产生两分子丙酮酸，丙酮酸在无氧条件下经过乙醇脱氢酶和丙酮酸脱氢酶的催化产生乙醇。
蔗糖转化酶(suc2)位于酿酒酵母细胞膜与细胞壁之间的周质空间，当以蔗糖为原料进行发酵时，此转化酶可将蔗糖降解为葡萄糖和果糖，在充分混合的条件下，以这种方式产生的大多数糖扩散到群体中由其他细胞消耗，这些糖是共享的碳源。而当酿酒酵母缺失suc2基因后，在以蔗糖为原料的条件下不能进行生长发酵。当将酿酒酵母野生菌株与酿酒酵母suc2缺失菌株混合发酵后，酿酒酵母社会行为改变，可能会提升乙醇的产量。本实验室前期研究证明了酿酒酵母社会行为改变提升乙醇产量的可行性。目前查阅到的文献记录中尚未发现利用酿酒酵母社会行为改变提升乙醇发酵速率的报道。本课题组利用基因工程改造了酿酒酵母by4741，构建了酿酒酵母suc2缺失菌株，将此两种菌株混合培养，证明其发酵乙醇产量明显高于野生菌株单独发酵的乙醇产量。
技术实现要素：
本发明利用基因工程改造酿酒酵母by4741，构建酿酒酵母suc2缺失菌株，将改造后的酿酒酵母与未改造的酿酒酵母混合培养，使酿酒酵母社会行为改变，从而提升乙醇产量，其核心是改造的酿酒酵母与未改造酿酒酵母的接种比例。
1.调控酿酒酵母社会行为提高生物乙醇发酵速率效率的方法，其特征在于：
选用酿酒酵母(saccharomycescerevistae)by4741与酿酒酵母suc2缺失菌株混合配养，具体操作如下：
(1)将菌株分别接种于ypd培养基中，33℃、153rmp条件下培养18h，进行菌种复苏；将活化菌株再次接种于新鲜ypd培养基中，培养至od633＝1，进行梯度稀释，将稀释至13-6倍的菌液涂布于ypd平板上，33℃静置培养23h，进行计数，确定混合培养接种量。
(2)再次培养两株酿酒酵母至od633＝1，混合两种菌液，获得by4741与suc2基因缺失菌株混合菌液，其中by4741与suc2两种菌液的接种比为85％-95％，将133μl混合菌液分别接种于蔗糖质量百分比浓度为23％的培养基，33℃、153rmp培养12h-36h。
2.染菌状况下，调控酿酒酵母社会行为提高生物乙醇发酵速率效率的方法其特征在于：
选用酿酒酵母(saccharomycescerevistae)by4741、酿酒酵母suc2缺失菌株及发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)atcc14931混合配养，具体操作如下：
(1)将发酵乳杆菌atcc14931接种于mrs培养基中，37℃静置培养24h，进行菌种复苏；将活化菌株再次接种于新鲜mrs培养基中，培养至od633＝1，进行梯度稀释，将稀释至13-8倍的菌液涂布于mrs平板，37℃静置培养23h，进行计数，确定杂菌接种量。
(2)培养两株酿酒酵母至od633＝1，混合两种菌液，获得by4741与suc2基因缺失菌株混合菌液，其中by4741与suc2两种菌液的接种比为85％-95％，将133μl混合菌液分别接种于蔗糖质量百分比浓度为23％的培养基，同时再接入1ml、od633＝1的发酵乳杆菌菌液，33℃、153rmp培养12h-36h。
具体包括以下步骤：
1.酿酒酵母社会行为的改变对乙醇发酵的影响，其特征在于：
选用酿酒酵母(saccharomycescerevistae)by4741与酿酒酵母suc2缺失菌株混合配养，具体操作如下：
(1)将菌株分别接种于ypd培养基中，30℃、150rmp条件下培养18h，进行菌种复苏；将活化菌株再次接种于新鲜ypd培养基中，培养至od600＝1，进行梯度稀释，将稀释后菌液涂布于ypd平板上，30℃静置培养20h左右，进行计数，确定混合培养接种量。
(2)再次培养两株酿酒酵母至od600＝1，混合两种菌液，获得by4741与suc2基因缺失菌株各种比例混合菌液，将混合菌液分别接种于20％蔗糖ypd培养基，按比例标记，进行实验，30℃、150rmp培养，在12h、18h、24h和36h取样。
(3)利用高效液相色谱法测定样品乙醇及残糖含量，获取最优接种比例，即酿酒酵母最佳社会行为。
2.染菌状况下，酿酒酵母社会行为的改变对乙醇发酵的影响，其特征在于：
选用酿酒酵母(saccharomycescerevistae)by4741、酿酒酵母suc2缺失菌株及发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)atcc14931混合配养，具体操作如下：
(1)将发酵乳杆菌atcc14931接种于mrs培养基中，37℃静置培养24h，进行菌种复苏；将活化菌株再次接种于新鲜mrs培养基中，培养至od600＝1，进行梯度稀释，将稀释后菌液涂布于mrs平板，37℃静置培养20h左右，进行计数，确定杂菌接种量。
(2)培养两株酿酒酵母至od600＝1，混合两种菌液，获得by4741与suc2基因缺失菌株各种比例混合菌液，将混合菌液分别接种于20％蔗糖ypd培养基，同时再接入od600＝1的发酵乳杆菌菌液，按比例标记，进行实验，30℃、150rmp培养，在12h、18h、24h和36h取样。
(3)利用高效液相色谱法测定样品乙醇及残糖含量，获取在染菌状况下酿酒酵母最优接种比例，即酿酒酵母最佳社会行为。
具体实施方式
一、酿酒酵母suc2基因缺失突变株的构建
1、将pug6质粒的甘油菌活化，接种于氨苄抗性的lb培养基，37℃过夜培养。使用质粒小提取试剂盒提取质粒作为构建敲除载体模板。
2、按照suc2序列(seqidno.1)与loxp-kanmx-loxp(seqidno.2)序列设计引物，其上游引物如seqidno.3所示，下游引物如seqidno.4所示。通过pcr构建敲除载体，包含以下步骤：
步骤(1)：按如下比例配制反应体系：
2×taqpremix：50μl
上游引物：1μl
下游引物：1μl
dna模板：1μl
ddh2o：47μl
其中，dna模板浓度为100-200ng/μl，上游引物及下游引物浓度为10mmol/μl；
步骤(2)：设定pcr程序为：1、94℃预变性3min；2、94℃变性30s；3、60℃复性30s；4、72℃延伸105s；5、72℃延伸10min；6、4℃恒温保存。
其中2～4歩设置循环，次数为30次。
步骤(3)：琼脂糖电泳检测扩增结果，看1500bp～2000bp之间有无目的条带出现。
3、将敲除载体通过醋酸锂转化进入酿酒酵母。
醋酸锂转化具体步骤如下：
步骤(1)：在平板上挑取by4741单菌落，接入ypd培养基，于30℃条件下进行菌种复苏。按照od600＝0.4将复苏后的菌液接入50ml新鲜的ypd培养基，培养2～4h，收集菌体。
其中，ypd培养基配方，1l培养基含有：蛋白胨20.0g，酵母膏10.0g，葡萄糖(c6h12o6·h2o)20.0g。
步骤(2)：将所得菌体重悬于40ml的1×te中，离心后重悬于2ml的1×liac/0.5×te中，在室温下放置10min完成感受态制作步骤。
步骤(3)：向100μl步骤(2)所得的感受态中加5μl的构建好的敲除载体，100μl剪切变性鲑鱼精子dna(biotopped公司生产)，以及700μl1×liac/40％peg-3350/1×te，混合均匀。
步骤(4)：将步骤(3)所得混合液在30℃放置30min，加入88μldmso，混合均匀后在42℃放置7min。
步骤(5)：将步骤(4)所得菌液离心，收集菌体。用1ml1×te清洗菌体后将其涂布于含g418ypd培养基平板，进行阳性克隆的筛选。
4、将阳性克隆子在含g418抗生素平板上传代培养，检测构建菌株是否可以传代培养，同时，将阳性克隆子在蔗糖ypd培养基中培养，检测其是否可以生长。
二、野生菌株与基因缺失菌株不同比例下乙醇产量的测定
1、分别将甘油保存的by4741和suc2基因缺失菌株接种于新鲜ypd培养基中，30℃、150rmp培养18h。
2、将活化菌株再次接种于新鲜ypd培养基中，培养至od600＝1，进行梯度稀释，将稀释后菌液涂布于ypd平板上，30℃静置培养20h左右，进行计数，确定混合培养接种量。
3、将活化好的菌株分别再次接种于新鲜ypd培养基中，培养至od600＝1。
4、混合两种菌液，获得各种比例混合菌液，将混合菌液分别接种于20％蔗糖ypd培养基，按比例标记，进行三平行实验，30℃、150rmp培养，在12h、18h、24h和36h取样。
其中，20％蔗糖ypd培养基配方，1l培养基含有：蛋白胨20.0g，酵母膏10.0g，蔗糖200.0g。
5、对样品进行过滤处理，4℃保存样品，利用高效液相色谱法对其乙醇及残糖含量进行测定。利用spss处理各时间点数据，结果显示：整个发酵阶段，在12h、18h时，各比例组与对照组乙醇产量无明显差异(p>0.05)，在24h时，各比例组与对照组乙醇产量有明显差异(p<0.05)，而且有一比例组乙醇产量比对照组高17.6％，在36h时，各比例组与对照组乙醇产量有明显差异(p<0.01)，有一比例组乙醇产率比对照组高5.5％，证明加入基因缺陷菌株，改变酿酒酵母社会行为，对乙醇产量提升。
三、染菌状况下，野生菌株与基因缺失菌株不同比例下乙醇产量的测定
1、将甘油保存的发酵乳杆菌atcc14931接种于于mrs培养基中活化，37℃静置培养24h，重复此步骤2-4次。
所用mrs培养基配方，1l培养基含有：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖(c6h12o6·h2o)20.0g，吐温-801.0ml，乙酸钠(ch3coona·3h2o)5.0g，磷酸氢二钾(k2hpo4·3h2o)2.0g，硫酸镁(mgso4·7h2o)0.58g，硫酸锰(mnso4·h2o)0.25g，培养基ph值为6.2。
2、将活化的菌液接种至mrs培养基，37℃静置培养至od600为1，进行梯度稀释，将稀释菌液涂布于mrs平板上，37℃静置培养20h左右，进行计数；确定杂菌接种量。
3、分别将甘油保存的by4741和suc2基因缺失菌株接种于新鲜ypd培养基中，30℃、150rmp培养18h。
4、将甘油保存的发酵乳杆菌atcc14931接种于mrs培养基中活化，37℃静置培养24h，重复此步骤2-4次。
(2)将活化好的酿酒酵母菌株分别再次接种于新鲜ypd培养基中，培养至od600＝1；将活化好的发酵乳杆菌接种于新鲜mrs培养基，培养至od600＝1。
(3)混合两种酿酒酵母菌液，获得各种比例混合菌液，将混合菌液分别接种于20％蔗糖ypd培养基，再接入发酵乳杆菌菌液，按比例标记，进行三平行实验，30℃、150rmp培养，在12h、18h、24h和36h取样。
(4)对样品进行过滤处理，4℃保存样品，利用高效液相色谱法对其乙醇及残糖含量进行测定。利用spss处理各时间点数据，结果显示：整个发酵阶段，在18h、24h、36h时，各比例组与对照组乙醇产量有明显差异(p<0.01)，且在24h时，有一比例乙醇产量比对照组高23.4％，在36h时，有一比例组乙醇产量比对照组高6.2％，证明加入基因缺陷菌株，染菌状况下，改变酿酒酵母社会行为，乙醇产量提升。
本发明中上述实施例中的温度及时间等参数均为较优的选择，经实验证明在超出上述实施例范围外也能实现本发明的目的，因不能穷尽所有的数值，在此不再赘述。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域的技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。
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