一种U6、miR92a及miR21的三重RT‑qPCR检测方法及试剂盒与流程

本发明属于生物检测领域，涉及u6、mir92a及mir21三种mirna进行单管三重逆转录的检测方法及逆转录后进行单管双重定量的检测方法及试剂盒。

背景技术：

微rna(mirna)是一类非编码单链小分子rna，长度为20～24个核苷酸，位于基因组的非编码区，具有高度保守性，时序性和组织特异性。mirna在发育、细胞增殖、凋亡、脂类代谢、激素分泌及肿瘤发生等多种生理和病理过程中发挥重要作用。

mir21是较早发现的人类mirna之一，在多种生物及哺乳动物多种组织中的广泛存在。大量研究表明，mir21可作为原癌基因在多种肿瘤中高表达并参与细胞的增生、分化、凋亡等过程，在肿瘤的发生发展中具有重要作用。因此，检测mir21的含量对肿瘤的诊断、治疗和预后等具有重要意义。

mir92a可调控人体细胞中参与细胞分化、凋亡、迁移、免疫等过程中的相关基因表达；另一方面多种肿瘤和疾病，如心血管系统疾病中，存在mir92a的表达异常情况。因此mir92a含量可作为一种生物标志物，为相关疾病的诊疗提供参考，检测mir92a含量具有重要基础和临床意义。

由于mirna序列短、没有poly(a)尾巴、在细胞内的表达水平比较低，且许多同源mirna(如let-7家族)序列相似度高，仅差1～2个碱基，使设计的分析探针杂交效率低。为了提高杂交反应的亲合性和检测灵敏度，丹麦exiqon公司的锁核酸(lockednucleicacid，lna)技术被应用于mirna的分析研究。目前，基于锁核酸(lna)等技术的支撑，科学家研究出了多种有效的mirna检测方法，如northernblotting、微阵列法(mirnaarray)、克隆和测序法、实时荧光定量pcr(rt-qpcr)法等。

rt-qpcr更加简单方便，不需标记、操作简单、成本较低、并且灵敏度极高；能在短时间内获得结果，可检测多个mirna的表达，需要的rna量较少，因而被广泛用于组织中mirna表达谱的构建。

目前mirna逆转录成cdna的方法主要有三种：引物延伸逆转录法；引物加尾法；茎环引物逆转录法。延伸及加尾两种方法操作简单，一种引物可逆转录多种mirna，但后续的定量依赖经过修饰的定量引物，特异性不高；茎环引物克服了mirna序列短的缺点，引入茎环序列，进一步增加了rna-dna链互补配对的碱基数，提高了其热稳定性，逆转录效率增加。但逆转录反应后，逆转录酶对后续的qpcr有明显的抑制作用。qpcr采用的信号检测模式主要有两种：sybrgreen荧光染料法和taqman探针法，后者特异性更好。

目前，茎环引物逆转录法中，每种mirna都需要设计一个特异的反转录引物。若需要对样本中的多个mirna进行定量，逆转录需分管进行，步骤繁琐，从反转录到定量pcr，工作量较大。另外，对mirna进行定量时，往往需要一个内参基因，单管单重定量时，反应条件不稳定，加样有误差，定量不准确，且耗时耗力，较为繁琐。此外茎环引物及定量引物在同一体系中，引物二聚体严重，易引起过度扩增。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr检测方法，使u6、mir92a及mir21的三重逆转录在同一反应管中进行，使得多个mirna逆转录时，步骤更简洁，转录效率和特异性更高；且mir21和u6、mir92a和u6分别进行单管双重定量，使得mir21和mir92a的定量检测误差更小，步骤更简便，定量结果更准确，可靠。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是提供一种u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr检测方法及试剂盒，实现对u6、mir92a及mir21的快速准确定量，应用极为方便。

一个方面，本发明提供了用于u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的逆转录茎环引物组。

所述的逆转录茎环引物组包括以下3条引物序列：引物stem-loopprimer21，其核苷酸序列如seqidno：1所示：5’-ctcaactgctctgctccagtcgcggattcagttgagtcaacat-3’；引物stem-loopprimer92a，其核苷酸序列如seqidno：2所示：5’-gtcgtatccagtcgtcgctccgactcgcgctggatacgacacaggccg-3’；引物stem-loopprimeru6，其核苷酸序列如seqidno：3所示：5’-gtcgtatccagctctgctccagtcgcggattctggatacgacaaaata-3’。

另一个方面，本发明提供了一种u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的定量检测引物组和定量检测探针组。

所述的定量检测引物组和定量检测探针组是：定量检测引物组1和定量检测探针组1；和/或定量检测引物组2和定量检测探针组2。

所述的定量检测引物组1包括以下4条定量检测引物：定量pcr上游引物m2102，其核苷酸序列如seqidno：4所示：5’-ccccggtagcttatcagactg-3’；定量pcr下游引物m2103，其核苷酸序列如seqidno：5所示：5’-ctcaactgctctgctccagt-3’；定量pcr上游引物u602，其核苷酸序列如seqidno：6所示：5’-ctcgcttcggcagcaca-3’；定量pcr下游引物u603，其核苷酸序列如seqidno：7所示：5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’；

所述的定量检测探针组1包括以下2条定量检测探针：探针m2104，其序列为seqidno：8(5’-gttgactcaactgaatccgcg-3’)所示的核苷酸序列或其互补的核苷酸序列；探针u604，其序列为seqidno：9(5’-agaagattagcatggcccct-3’)所示的核苷酸序列或其互补的核苷酸序列；

探针m2104和探针u604的核苷酸序列的5’端标记有不同的荧光基团，所述的荧光基团分别选自fam、hex、vic中的一种；探针m2104和探针u604的核苷酸序列的3’端标记有猝灭基团mgb。

所述的定量检测引物组2包括以下4条定量检测引物：定量pcr上游引物序列m9202，其核苷酸序列如seqidno：10所示：5’-ccctgtattgcacttgtcc-3’；定量pcr上游引物序列m9203，其核苷酸序列如seqidno：11所示：5’-gtcgtatccagtcgtcgc-3’；定量pcr上游引物u602，其核苷酸序列如seqidno：6所示：5’-ctcgcttcggcagcaca-3’；定量pcr下游引物u603，其核苷酸序列如seqidno：7所示：5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’；

所述的定量检测探针组2包括以下2条定量检测探针：

探针m9204，其序列为seqidno：12(5’-cggcctgtgtcgtatcca-3’)所示的核苷酸序列或其互补的核苷酸序列；探针u604，其序列为seqidno：9(5’-agaagattagcatggcccct-3’)所示的核苷酸序列或其互补的核苷酸序列；

探针m9204和探针u604的核苷酸序列的5’端标记有不同的荧光基团，所述的荧光基团分别选自fam、hex、vic中的一种；探针m2104和探针u604的核苷酸序列的3’端标记有猝灭基团mgb。

另一个方面，本发明提供了一种u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr检测试剂盒。

所述的试剂盒包括本发明所述的逆转录茎环引物组、定量检测引物组和定量检测探针组。

所述的试剂盒还包括酶系、pcr反应试剂和定量标准品。

所述的酶系包括mmlvdna聚合酶、tfldna聚合酶和stoffel片段；

所述的pcr反应试剂包括：

ph8.3～8.5的tris-h2so4，ph7.9的3-(n-吗啉基)丙磺酸，柠檬酸钠，(nh4)2so4，mgso4，聚氧乙烯月桂醚，乙酰化牛血清白蛋白和dntp。

所述的定量标准品为：定量标准品1和/或定量标准品2；根据mirna及茎环引物序列，分别合成mir21质粒、mir92a质粒和u6质粒。mir21质粒含有如seqidno：13(5'-ctcaactgctctgctccagtcgcggattcagttgagtcaacatcagtctgataagcta-3’)所示核苷酸序列；mir92a质粒含有如seqidno：14(5'-gtcgtatccagtcgtcgctccgactcgcgctggatacgacacaggccgggacaagtgcaata-3’)所示核苷酸序列；u6质粒含有如seqidno：15(5'-aacgcttcacgaatttgcgtgtcatccttgcgcaggggccatgctaatcttctctgtatcgttccaattttagtatatgtgctgccgaagcgagcac-3')所示核苷酸序列。计算质粒拷贝数，u6、mir92a和mir21质粒分别稀释至e⁵、e⁴、e³、e²拷贝数/μl。将同浓度的u6、mir21质粒混合，即得到同时含u6、mir21质粒且u6、mir21质粒浓度分别为5e⁴、5e³、5e²、5e拷贝数/μl的定量标准品1；将同浓度的u6、mir92a质粒混合，即得到同时含u6、mir92a质粒且u6、mir92a质粒浓度分别为5e⁴、5e³、5e²、5e拷贝数/μl的定量标准品2。

再一个方面，本发明提供了一种u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的检测方法，所述的检测方法指利用本发明所述的u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的逆转录引物组、定量检测引物组和定量检测探针组，及所述的酶系、pcr反应体系和定量标准品，使用rt-qpcr技术对u6、mir92a及mir21进行定量分析；

所述的检测方法包括以下步骤：

(1)提取mirna：取待测全血样本，提取样本的mirna；

(2)逆转录mirna：

a、以步骤(1)提取的mirna作为模板，各逆转录茎环引物使用不同浓度，按以下配比配制premix：

b、将上述premix温和混匀，70℃预热5分钟，立即转入冰上5分钟，得到premix-1；

c、按以下配比配制rtmix：

其中，rt-pcr反应液包括：ph8.3～8.5的tris-h2so442～65mm、ph7.9的3-(n-吗啉基)丙磺酸9～32mm、柠檬酸钠2～4.3mm、(nh4)2so49～23mm、mgso43.5～9mm、质量百分比为0.10％～0.5％的聚氧乙烯月桂醚、质量体积比为0.01％～0.1％的乙酰化牛血清白蛋白；

d、将步骤(2)-c配制的rtmix与步骤(2)-b中得到的premix-1混合，普通pcr仪进行逆转录，得到逆转录的cdna；

其中，逆转录时使用的pcr反应程序为：25℃，5分钟；42℃，60分钟；70℃，15分钟；4℃，保存；

(3)双重定量pcr：

a、分别以步骤(2)-d得到的cdna、以及定量标准品为模板，按以下配比配制mir21和u6单管双重定量及mir92a和u6单管双重定量反应体系：

其中，定量pcr反应液包括：ph8.3～8.5的tris-h2so442～65mm、ph7.9的3-(n-吗啉基)丙磺酸10～30mm、柠檬酸钠2～4.3mm、(nh4)2so49～23mm、mgso43.5～9mm、质量百分比为0.10％～0.5％的聚氧乙烯月桂醚、质量体积比为0.01％～0.1％的乙酰化牛血清白蛋白、dntp0.2～0.5mm、定量检测引物组600～1000nm和定量检测探针组150～300nm；

酶混合液包括：等体积的tfldna聚合酶和stoffel片段。

b、单管双重定量反应体系配制好后，利用定量pcr仪进行扩增，所用的定量程序为：第一步：37℃，5分钟；94℃～96℃8～12分钟；第二步：94℃～95℃15～30秒，62℃～68℃15～50秒，68℃～72℃20～40秒，4～8个循环；第三步：93℃～95℃15～20秒，62℃，15～30，68℃～72℃，20秒，10个循环；第四步：93℃～95℃，15秒，52℃～62℃，15秒，68℃～72℃，30～60秒，40个循环；

c、定量分析：

mir21和u6单管双重定量分析：在定量pcr仪的不同荧光通道分别读取mir21和u6的扩增曲线；根据5e⁴、5e³、5e²、5e拷贝数/μl定量标准品1的扩增结果，分别绘制mir21和u6的标准曲线；利用该标准曲线，计算步骤(2)-d得到的cdna中mir21和u6的定量值；以mir21的定量值除以u6的定量值，即得本待测全血样本中mir21的相对含量。

mir92a和u6的单管双重定量分析：在定量pcr仪的不同荧光通道分别读取mir92a和u6的扩增曲线；根据5e⁴、5e³、5e²、5e拷贝数/μl定量标准品2的扩增结果，分别绘制mir92a和u6的标准曲线；利用该标准曲线，计算步骤(2)-d得到的cdna中mir92a和u6的定量值；以mir92a的定量值除以u6的定量值，即得本待测全血样本中mir92a的相对含量。

在一个优选的实施方案中，所述的rt-pcr反应液包括：ph8.3的tris-h2so442mm、ph7.9的3-(n-吗啉基)丙磺酸9mm、柠檬酸钠2mm、(nh4)2so49mm、mgso43.5mm、质量百分比为0.10％的聚氧乙烯月桂醚、质量体积比为0.01％的乙酰化牛血清白蛋白；

在另一个优选的实施方案中，所述的rt-pcr反应液包括：ph8.5的tris-h2so465mm、ph7.9的3-(n-吗啉基)丙磺酸32mm、柠檬酸钠4.3mm、(nh4)2so423mm、mgso49mm、质量百分比为0.5％的聚氧乙烯月桂醚、质量体积比为0.1％的乙酰化牛血清白蛋白；

在另一个优选的实施方案中，所述的rt-pcr反应液包括：ph8.5的tris-h2so448mm、ph7.9的3-(n-吗啉基)丙磺酸18mm、柠檬酸钠3mm、(nh4)2so420mm、mgso47mm、质量百分比为0.10％的聚氧乙烯月桂醚、质量体积比为0.1％的乙酰化牛血清白蛋白；

在一个优选的实施方案中，所述的定量pcr反应液包括：ph8.3的tris-h2so442mm、ph7.9的3-(n-吗啉基)丙磺酸9mm、柠檬酸钠2mm、(nh4)2so49mm、mgso43.5mm、质量百分比为0.10％的聚氧乙烯月桂醚、质量体积比为0.01％的乙酰化牛血清白蛋白、dntp0.2mm、定量检测引物组600nm和定量检测探针组150nm；

在另一个优选的实施方案中，所述的定量pcr反应液包括：ph8.5的tris-h2so465mm、ph7.9的3-(n-吗啉基)丙磺酸32mm、柠檬酸钠4.3mm、(nh4)2so423mm、mgso49mm、质量百分比为0.5％的聚氧乙烯月桂醚、质量体积比为0.1％的乙酰化牛血清白蛋白、dntp0.5mm、定量检测引物组1000nm和定量检测探针组300nm；

在另一个优选的实施方案中，所述的定量pcr反应液包括：ph8.5的tris-h2so448mm、ph7.9的3-(n-吗啉基)丙磺酸18mm、柠檬酸钠3mm、(nh4)2so420mm、mgso47mm、质量百分比为0.10％～0.5％的聚氧乙烯月桂醚、质量体积比为0.01％～0.1％的乙酰化牛血清白蛋白、dntp0.2mm、定量检测引物组800nm和探定量检测针组200nm；

在一个优选的实施方案中，所述的定量程序为：第一步：37℃，5分钟；94℃8分钟；第二步：94℃15秒，62℃15秒，68℃20秒，4个循环；第三步：93℃15秒，62℃15秒，68℃20秒，10个循环；第四步：93℃15秒，52℃15秒，68℃30秒，40个循环；

在另一个优选的实施方案中，所述的定量程序为：第一步：37℃，5分钟；96℃12分钟；第二步：95℃30秒，68℃50秒，72℃40秒，8个循环；第三步：95℃20秒，62℃30秒，72℃20秒，10个循环；第四步：95℃15秒，62℃15秒，72℃，60秒，40个循环；

在另一个优选的实施方案中，所述的定量程序为：第一步：37℃，5分钟；95℃，10分钟；第二步：95℃，15秒，65℃，15秒，72℃，20秒，5个循环；第三步：95℃，15秒，62℃，15秒，72℃，20秒，10个循环；第四步：95℃，15秒，52℃，15秒，72℃，40秒，40个循环。

与现有技术相比，本发明的有效效果为：

1、本发明提供了mir21、mir92a、u6的逆转录茎环引物。这三个逆转录茎环引物可在同一反应管中逆转录扩增mir21、92a和u6，实现了单管三重逆转录，使得mir21、92a和u6的逆转录步骤大大简化，克服了现有技术中茎环引物逆转录时，一种茎环引物只能逆转录一种cdna，扩增多基因时，需分别扩增，分管操作步骤繁琐的缺点。

2、本发明提供的mir21、mir92a、u6的逆转录茎环引物，增加了rna-dna链互补配对的碱基，提高了其热稳定性，逆转录效率增加。

3、本发明优化了逆转录酶的使用方法，降低了对后续定量pcr的抑制。

4、本发明提供了高灵敏和高特异性的定量检测引物序列和定量检测探针、与之相匹配的pcr反应程序和条件，并提供了mir21和u6、mir92a和u6进行单管双重定量的检测方法，避免了现有技术中qpcr单管单重定量时的操作误差，使得定量结果更准确，定量结果更可靠。同时，单管双重定量使得定量步骤更加简洁，缩短检测时间的同时还节省了检测试剂和检测费用。

5、本发明提供的mir21和u6、mir92a和u6单管双重定量的检测方法，可检测到5e拷贝数/μl定量标准品中的mir21和mir92a，检测灵敏度和特异性高。

6、本发明引入了stoffel片段和tfldna聚合酶的双聚合酶的扩增方法。其中stoffel片段为去除5’-3’外切酶活性结构域的taqdna聚合酶，去除5’-3’外切酶活性的同时，恢复了少量3’-5’外切酶的校正活性，弥补了tfldna聚合酶特异性不足的缺陷。而tfldna聚合酶则提供切除taqman探针的5’-3’外切酶活性。另一方面，stoffel片段和tfldna聚合酶耐抑制剂能力都较强，使得根据本发明的rt-qpcr反应体系中可以加入更多的模版，灵敏度提升。

7、本发明引入的tris-3-(n-吗啉基)丙磺酸-柠檬酸钠缓冲液替代常规的tris-hcl缓冲液，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，避免了普通rt-qpcr方法特异性不高的缺点。

附图说明

图1从左到右依次为5e⁴、5e³、5e²、5e拷贝数/μl定量标准品1的扩增结果曲线，fam通道为mir21通道，hex通道为u6通道。

图2mir21和u6单管双重定量绘制的mir21和u6标准曲线及待测样本定量值，fam通道为mir21通道，hex通道为u6通道。

图3从左到右依次为5e⁴、5e³、5e²、5e拷贝数/μl定量标准品2的扩增结果曲线，fam通道为mir92a通道，hex通道为u6通道。

图4mir92a和u6单管双重定量绘制的mir92a和u6标准曲线及待测样本定量值，fam通道为mir92a通道，hex通道为u6通道。

图5从左到右依次为对比例1的5e⁴、5e³、5e²、5e拷贝数/μl定量标准品1的mir21的扩增结果曲线。

图6从左到右依次为对比例1的5e⁴、5e³、5e²、5e拷贝数/μl定量标准品2的mir92a的扩增结果曲线。

具体实施方式

以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学试验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1一种u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的检测试剂盒

该试剂盒包括：u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的逆转录茎环引物组。

逆转录茎环引物组包括：

引物stem-loopprimer21：5’-ctcaactgctctgctccagtcgcggattcagttgagtcaacat-3’；

引物stem-loopprimer92a：5’-gtcgtatccagtcgtcgctccgactcgcgctggatacgacacaggccg-3’；

引物stem-loopprimeru6：5’-gtcgtatccagctctgctccagtcgcggattctggatacgacaaaata-3’。

实施例2一种u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的检测试剂盒

该试剂盒包括：(1)实施例1所述的u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的逆转录茎环引物组；(2)u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的定量检测引物组和定量检测探针组。

定量检测引物组包括：

定量检测引物组1和定量检测探针组1；

和定量检测引物组2和定量检测探针组2。

定量检测引物组1包括：

定量pcr上游引物m2102：5’-ccccggtagcttatcagactg-3’；定量pcr下游引物m2103：5’-ctcaactgctctgctccagt-3’；定量pcr上游引物u602：5’-ctcgcttcggcagcaca-3’；定量pcr下游引物u603：5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’；

定量检测探针组1包括：

探针m2104：5’-gttgactcaactgaatccgcg-3’和探针u604：5’-agaagattagcatggcccct-3’；

探针m2104的核苷酸序列的5’端标记有fam荧光基团，探针u604的核苷酸序列的5’端标记有hex荧光基团，所述的荧光基团为；探针m2104和探针u604的核苷酸序列的3’端标记有猝灭基团mgb。

定量检测引物组2包括：

定量pcr上游引物序列m9202：5’-ccctgtattgcacttgtcc-3’；定量pcr下游引物序列m9203：5’-gtcgtatccagtcgtcgc-3’；定量pcr上游引物u602：5’-ctcgcttcggcagcaca-3’；定量pcr下游引物u603：5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’；

定量检测探针组2包括：

探针m9204：5’-cggcctgtgtcgtatcca-3’和探针u604：5’-agaagattagcatggcccct-3’；

探针m9204核苷酸序列的5’端标记有fam荧光基团，探针u604的核苷酸序列的5’端标记有hex荧光基团；探针m2104和探针u604的核苷酸序列的3’端标记有猝灭基团mgb。

实施例3一种u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的检测试剂盒

该试剂盒包括：

(1)实施例1中的逆转录茎环引物组；

(2)实施例2中的定量检测引物组和定量检测探针组；

(2)酶系：mmlvdna聚合酶、tfldna聚合酶和stoffel片段；

(3)pcr反应试剂：ph8.5的tris-h2so4，ph7.9的3-(n-吗啉基)丙磺酸，柠檬酸钠，(nh4)2so4，mgso4，聚氧乙烯月桂醚，乙酰化牛血清白蛋白和dntp。

(4)定量标准品：定量标准品1和定量标准品2。

根据mirna及茎环引物序列，在上海捷瑞生物工程有限公司合成mir21质粒、mir92a质粒和u6质粒。mir21质粒含有如seqidno：14(5'-ctcaactgctctgctccagtcgcggattcagttgagtcaacatcagtctgataagcta-3’)所示核苷酸序列；mir92a质粒含有如seqidno：15(5'-gtcgtatccagtcgtcgctccgactcgcgctggatacgacacaggccgggacaagtgcaata-3’)所示核苷酸序列；u6质粒含有如seqidno：16(5'---aacgcttcacgaatttgcgtgtcatccttgcgcaggggccatgctaatcttctctgtatcgttccaattttagtatatgtgctgccgaagcgagcac---3')所示核苷酸序列。dna/rnacopynumbercalculator计算质粒拷贝数，u6、mir92a和mir21质粒分别稀释至e5、e4、e3、e2拷贝数/μl。将同浓度的u6、mir21质粒混合，即得到同时含u6、mir21质粒且u6、mir21质粒浓度分别为5e⁴、5e³、5e²、5e拷贝数/μl的定量标准品1；将同浓度的u6、mir92a质粒混合，即得到同时含u6、mir92a质粒且u6、mir92a质粒浓度分别为5e⁴、5e³、5e²、5e拷贝数/μl的定量标准品2。

实施例4

一种u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr检测方法

所述的检测方法包括以下步骤：

1、提取mirna：待测人全血样本，编号分别为s1-s24，各取200μl，提取mirna(采用exiqonmirna提取试剂盒，货号：300112)；

2、逆转录mirna：

a、以步骤(1)提取的mirna作为模板，各逆转录茎环引物使用不同浓度，按以下配比配制premix：

b、将上述premix温和混匀，70℃预热5分钟，立即转入冰上5分钟，得到premix-1；

c、按以下配比配制rtmix：

试剂工作浓度或添加量

rt-pcr反应液8.5μl

200u/μlmmlvdna聚合酶(深圳菲鹏生物)0.5μl；

其中，rt-pcr反应液包括：ph8.5的tris-h2so448mm、ph7.9的3-(n-吗啉基)丙磺酸18mm、柠檬酸钠3mm、(nh4)2so420mm、mgso47mm、质量百分比为0.10％的聚氧乙烯月桂醚、质量体积比为0.1％的乙酰化牛血清白蛋白；

d、将步骤(2)-c配制的rtmix与步骤(2)-b中得到的premix-1混合，普通pcr仪进行逆转录，得到逆转录的cdna；

其中，逆转录时使用的pcr反应程序为：25℃，5分钟；42℃，60分钟；70℃，15分钟；4℃，保存；

(3)双重定量pcr：

a、分别以步骤(2)-d得到的cdna、以及定量标准品1为模板，按以下配比配制mir21和u6单管双重定量反应体系：

其中，定量pcr反应液包括：ph8.5的tris-h2so448mm、ph7.9的3-(n-吗啉基)丙磺酸18mm、柠檬酸钠3mm、(nh4)2so420mm、mgso47mm、质量百分比为0.10％～0.5％的聚氧乙烯月桂醚、质量体积比为0.01％～0.1％的乙酰化牛血清白蛋白、dntp0.2mm、定量pcr上游引物m2102200nm、定量pcr下游引物m2103200nm、定量pcr上游引物u602200nm、定量pcr下游引物u603200nm、探针m2104100nm和探针u604100nm；

酶混合液包括：1μl的tfldna聚合酶(美国abi公司，2u/μl)和1μl的stoffel片段(cetus公司，5u/μl)。

分别以步骤(2)-d得到的cdna、以及定量标准品2为模板，按以下配比配制mir92a和u6单管双重定量反应体系：

其中，定量pcr反应液包括：ph8.5的tris-h2so448mm、ph7.9的3-(n-吗啉基)丙磺酸18mm、柠檬酸钠3mm、(nh4)2so420mm、mgso47mm、质量百分比为0.10％～0.5％的聚氧乙烯月桂醚、质量体积比为0.01％～0.1％的乙酰化牛血清白蛋白、dntp0.2mm、定量pcr上游引物m9202200nm、定量pcr下游引物m9203200nm、定量pcr上游引物u602200nm、定量pcr下游引物u603200nm、探针m9204100nm和探针u604100nm；

酶混合液包括：1μl的tfldna聚合酶(美国abi公司，2u/μl)和1μl的stoffel片段(cetus公司，5u/μl)。

b、单管双重定量反应体系配制好后，利用定量pcr仪进行扩增，所用的定量程序为：第一步：37℃，5分钟；95℃，10分钟；第二步：95℃，15秒，65℃，15秒，72℃，20秒，5个循环；第三步：95℃，15秒，62℃，15秒，72℃，20秒，10个循环；第四步：95℃，15秒，52℃，15秒，72℃，40秒，40个循环；

c、定量分析：

mir21和u6单管双重定量分析：在定量pcr仪的fam荧光通道读取mir21的扩增曲线，在hex荧光通道读取u6的扩增曲线；根据5e⁴、5e³、5e²、5e拷贝数/μl定量标准品1的扩增结果(图1，从左到右依次为5e⁴、5e³、5e²、5e拷贝数/μl定量标准品1的扩增结果曲线)，分别绘制mir21和u6的标准曲线(结果见图2)；利用标准曲线，计算步骤(2)-d得到的cdna中mir21和u6的定量值(结果见图2及表1)；以mir21的定量值除以u6的定量值，即得本待测全血样本中mir21的相对含量，s1-s24样本的mir21相对含量结果见表1。

表1

mir92a和u6单管双重定量分析：在定量pcr仪的fam荧光通道读取mir92a的扩增曲线，在hex荧光通道读取u6的扩增曲线；根据5e⁴、5e³、5e²、5e拷贝数/μl定量标准品的扩增结果(图3，从左到右依次为5e4、5e3、5e2、5e拷贝数/μl定量标准品2的扩增结果曲线)，分别绘制mir92a和u6的标准曲线，结果见图4；利用标准曲线，计算步骤(2)-d得到的cdna中mir92a和u6的定量值(结果见图4及表2)；以mir92a的定量值除以u6的定量值，即得本待测全血样本中mir92a的相对含量，s1-s24样本的mir92a相对含量结果见表2。

表2

对比例1一种u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的检测方法

以5e⁴、5e³、5e²、5e拷贝数/μl定量标准品1和定量标准品2为模板，以taqdna聚合酶(5u/μl，neb公司)为酶混合液，分别进行mir21和u6单管双重定量和mir92a和u6单管双重定量pcr，方法同实施例4。mir21扩增结果见图5，mir92a扩增结果见图6。由图1和图5、图3和图6对比分析可知，当模板量为5μl时，使用taqdna聚合酶虽然可以扩增，但是两个通道会相互抑制，扩增效率明显降低；而使用stoffel片段、tfldna聚合酶，可以正常扩增，说明本发明所述的酶混合液对模板的耐受能力更强，扩增效率更高。

对比例2一种u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr的检测方法

以5e⁴、5e³、5e²、5e拷贝数/μl定量标准品1和定量标准品2为模板，分别进行mir21和u6单管双重定量和mir92a和u6单管双重定量pcr，方法基本同实施例4，仅将定量pcr反应液中的ph8.5的tris-h2so448mm、ph7.9的3-(n-吗啉基)丙磺酸18mm和柠檬酸钠3mm换成ph8.5的tris-hcl66mm。扩增结果显示，采用本发明所述的tris-h2so4、3-(n-吗啉基)丙磺酸、柠檬酸钠组成的缓冲液，扩增效果更好，扩增结果稳定性更好。

sequencelisting

<110>广州海力特生物科技有限公司

<120>一种u6、mir92a及mir21的三重rt-qpcr检测方法及试剂盒

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