本发明生物技术涉及领域，具体涉及一种骨化二醇发酵的补料培养基、发酵的补料方法及其发酵方法
背景技术：
维生素d类药物中的骨化二醇(25—羟基维生素d3)是自然存在人体内的维生素d3的活性代谢产物，应用广泛。其主要用于治疗老年人骨质疏松症等各种慢性骨紊乱，以及与慢性肾衰竭有关的代谢性骨疾病，低钙血病。此外，骨化二醇近年还作为饲料添加剂用于饲料行业。
骨化二醇的制备有化学合成和生物发酵两种方法；化学合成反应步骤繁多、需要昂贵试剂、反应过程中会产生外消旋体，需要进行复杂的拆分过程，不仅大大影响收率，而且难以拆分完全，而且化学合成生产骨化二醇会对环境产生较大的污染。而微生物发酵的方式能够利用微生物细胞内的酶特异性的解决骨化二醇的手性结构问题，其生产条件温和，收率高，成本低廉，环境友好，成为一种有效替代化学合成的方法。但是微生物发酵的方式实施过程中也存在一些问题，在发酵过程中，发酵时间长，可能会出现营养供应不足的情况，同时，由于发酵的时间长，发酵液蒸发量大，体积减少较多，使得发酵液粘度增加、氧传递受限，菌丝体过早出现断裂、自溶，发酵液的ph值出现升高的情况，这又会影响菌丝体内酶的活性，造成的结果就是底物维生素d3的残留较多，产物骨化二醇的产量增长缓慢，发酵时间长，导致发酵效率不高。
技术实现要素：
有鉴于此，本申请提供了一种骨化二醇发酵的补料培养基、发酵的补料方法及其发酵方法，所述补料方法和所述发酵方法中包括向发酵液中加入所述补料培养基和水，提供了补料培养基配方、补料时间和补料速率，并且将氨基酸作为补料培养基组分，满足了骨化二醇发酵对营养成分的需求，满足了骨化二醇发酵溶氧需求，降低了动力成本，提高了发酵效率。
解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是一种骨化二醇发酵的补料培养基，所述补料培养基包括：有机氮源0.2～3.0g/l00ml、无机氮源0.2～3.0g/l00ml、碳源0.5～3.0g/l00ml、无机盐a0.1～1.0g/l00ml、无机盐b0.1～1.0g/l00ml、微量元素0.0002～0.0006g/l00ml。
优选的，所述补料培养基包括：有机氮源0.2～1.0g/l00ml、无机氮源0.2～1.0g/l00ml、碳源0.5～1.0g/l00ml、无机盐a0.1～0.3g/l00ml、无机盐b0.1～0.3g/l00ml、微量元素0.0002～0.0004g/l00ml。
优选的，所述补料培养基包括：有机氮源0.5g/l00ml、无机氮源0.2g/l00ml、碳源0.5g/l00ml、无机盐a0.2g/l00ml、无机盐b0.2g/l00ml、微量元素0.0003g/l00ml。
优选的，所述有机氮源选自蛋白胨、黄豆粉、花生粉、玉米浆和酵母膏中的一种或多种，所述无机氮源选自硫酸铵、硝酸铵、尿素和氨中的一种或多种，所述碳源选自葡萄糖、麦芽糖、淀粉、糊精和蔗糖中的一种或多种，所述无机盐a选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或多种，所述无机盐b选自硫酸镁、硫酸钠和硫酸钾中的一种或多种，所述微量元素选自氯化铁、硫酸铜和氯化锰中的一种或多种。
优选的，所述有机氮源为蛋白胨。
优选的，所述的无机氮源为硫酸铵。
优选的，所述碳源为葡萄糖。
优选的，所述无机盐a为磷酸二氢钠。
优选的，所述无机盐b为硫酸镁。
优选的，所述的微量元素为氯化锰和氯化铁。
优选的，所述补料培养基还包括：氨基酸。
优选的，所述补料培养基还包括：氨基酸0.1～2.0g/l00ml。
优选的，所述补料培养基还包括：氨基酸0.2～1.0g/l00ml。
优选的，所述氨基酸为选自缬氨酸、脯氨酸、半胱氨酸和苏氨酸中的一种或多种。
优选的，所述氨基酸为缬氨酸。
本发明还提供了一种骨化二醇发酵的补料方法，所述方法包括：
提供发酵液，向所述发酵液中加入补料培养基和水，发酵，得到料液，所述料液中包括所述骨化二醇；以重量份计，所述补料培养基包括：有机氮源0.2～3.0份、无机氮源0.2～3.0份、碳源0.5～3.0份、无机盐a0.1～1.0份、无机盐b0.1～1.0份、微量元素0.0002～0.0006份。
优选的，向所述发酵液中加入补料培养基具体为：向所述发酵液中加入补料培养基，直至料液中菌丝体浓度为15％～35％(v/v)时，停止加入所述补料培养基。
优选的，向所述发酵液中加入补料培养基具体为：向所述发酵液中加入补料培养基，直至料液中菌丝体浓度为20％～30％(v/v)时，停止加入所述补料培养基。
优选的，向所述发酵液中加入补料培养基具体为：向所述发酵液中加入补料培养基，直至料液中菌丝体浓度为25％(v/v)时，停止加入所述补料培养基。
优选的，菌丝体浓度的测定条件为:料液经离心分离后进行测定。
优选的，离心分离转速为4000转/分钟。
优选的，离心分离时间为10分钟。
优选的，以发酵液的体积计，向所述发酵液中加入补料培养基的速率为2％/24h～10％/24h。
优选的，以发酵液的体积计，向所述发酵液中加入补料培养基的速率为2％/24h～5％/24h。
优选的，向所述发酵液中加入水具体为：当发酵液中的溶氧低于30％(m/v)时，向所述发酵液中加入水。
优选的，以发酵液的体积计，向所述发酵液中加入水的速率为1％/h～10％/h。
优选的，以发酵液的体积计，向所述发酵液中加入水的速率为2％/h～5％/h。
优选的，以发酵液的体积计，向所述发酵液中加入水的速率为3％/h。
本发明还提供了一种骨化二醇的发酵方法，所述方法包括：
1)提供种子液和发酵培养基；
2)种子液接入所述发酵培养基，发酵，得到发酵液；
3)向步骤2)得到的发酵液中加入补料培养基和水，发酵，得到料液；所述补料培养基包括：有机氮源0.2～3.0份、无机氮源0.2～3.0份、碳源0.5～3.0份、无机盐a0.1～1.0份、无机盐b0.1～1.0份、微量元素0.0002～0.0006份；
4)所述步骤3)得到的料液经后处理，得到骨化二醇。
优选的，提供所述种子液具体为：将保藏编号为cgmccno.7935菌株接种到种子培养基，种子培养得到种子液。
优选的，提供所述种子液具体为：将保藏编号为cgmccno.7935菌株接种到种子培养基，转速280r/min，温度29℃，培养3天，得到一级种子液；所述一级种子液接种到种子培养基，转速260r/min，温度29℃，空气流量0.9立方米/小时，压力0.05mpa，培养2天，得到二级种子液；所述二级种子液接种到所述种子培养基，转速180r/min，温度29℃，空气流量18立方米/小时，压力0.05mpa，培养1天，得到所述种子液。
优选的，所述保藏编号为cgmccno.7935菌株由保藏编号为cgmccno.7935的菌种接种到斜面培养基培养得到。
优选的，所述斜面培养基由葡萄糖1.5g/l00ml，蛋白胨1.0g/l00ml，玉米浆0.3g/l00ml，氯化钠0.4g/l00ml，琼脂1.5g/l00ml和余量的水组成。
优选的，所述斜面培养基ph值为7.0。
优选的，所述种子培养基由蛋白胨1.5g/l00ml、玉米浆1.5g/l00ml、葡萄糖1.5g/l00ml、黄豆粉0.4g/l00ml、氯化钠0.5g/l00ml、磷酸二氢钾0.2g/l00ml和余量的水组成。
优选的，所述种子培养基ph值为7.5。
优选的，所述发酵培养基由蛋白胨1.5g/l00ml、玉米浆1.5g/l00ml、葡萄糖1.5g/l00ml、黄豆粉0.4g/l00ml、氯化钠0.5g/l00ml、磷酸二氢钾0.2g/l00ml和余量的水组成。
优选的，所述发酵培养基ph值为7.5。
优选的，所述步骤2)具体为：种子液接入所述发酵培养基，发酵，得到发酵液；所述发酵过程加入倍他环糊精和维生素d3。
优选的，所述步骤2)具体为：种子液接入所述发酵培养基，转速80r/min搅拌，发酵，得到发酵液；所述发酵条件为：发酵温度为28℃，发酵空气流量为90立方米/小时，发酵压力0.05mpa。
优选的，所述后处理为萃取，浓缩，柱层析和结晶。
生物保藏说明：保藏编号为cgmccno.7935的菌种为假诺卡氏菌，自编号为siia2243，其拉丁文名pseudonocardiaautotrophica，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2013年07月17日。
本申请与现有技术相比，其详细说明如下：
本发明提供的补料培养基提供了氮源、氮源、碳源、无机盐、微量元素、氨基酸，氮源包括有机氮源和无机氮源，无机氮源不易为菌丝体转化为菌体蛋白，配合氨基酸的加入，尤其是选择缬氨酸补料培养基组分，作为不会刺激菌丝生长，并进一步保证了氨基化的需求；碳源选自葡萄糖、麦芽糖、淀粉、糊精和蔗糖中的一种或多种，葡萄糖的在生长代谢与能量提供方面具有重要作用，发酵液中麦芽糖的存在诱导麦芽糖酶和麦芽糖通透酶的合成，在相关酶的作用下麦芽糖和d-木糖发生分解和构型变化，进而参与到糖代谢过程中，改变微生物环境，降低发酵粘度，促进细胞增殖；无机盐提供了磷源和硫源，保证了营养成分丰富；微量元素作为成分存在，进一步保证了菌丝生长和产物骨化二醇合成对营养成分的需求。
本发明提供的骨化二醇补料方法和骨化二醇发酵方法中，通过补入补料培养基和水，并控制补料培养基配方、加入补料培养基的时间和速率，加入水的时间和速率，补料培养基配方、补料时间和补料速率相辅相成，第一，满足了发酵中后期由于菌丝生长和产物骨化二醇合成对营养成分的需求，避免菌丝体过早出现断裂、自溶以及发酵液的ph值升高的情况出现，进而缩短发酵时间，提高发酵效率；第二，避免了体积减少较多，降低发酵液粘度，降低了动力成本，改善了氧传递过程，满足了骨化二醇发酵溶氧需求，提高发酵效率；第三、间歇式连续的加入补料培养基和水，避免因一次大量加入引起环境改变给菌丝生长的影响。
本发明提供的骨化二醇补料方法和骨化二醇发酵方法操作简单、成本低。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明提供了一种骨化二醇发酵的补料培养基，所述补料培养基包括：有机氮源0.2～3.0g/l00ml、无机氮源0.2～3.0g/l00ml、碳源0.5～3.0g/l00ml、无机盐a0.1～1.0g/l00ml、无机盐b0.1～1.0g/l00ml、微量元素0.0002～0.0006g/l00ml。
本发明还了提供一种骨化二醇发酵的补料方法，所述方法包括：
提供发酵液，向所述发酵液中加入补料培养基和水，发酵，得到料液，所述料液中包括所述骨化二醇；以重量份计，所述补料培养基包括：有机氮源0.2～3.0份、无机氮源0.2～3.0份、碳源0.5～3.0份、无机盐a0.1～1.0份、无机盐b0.1～1.0份、微量元素0.0002～0.0006份。
本发明还提供了一种骨化二醇的发酵方法，所述方法包括：
1)提供种子液和发酵培养基；
2)种子液接入所述发酵培养基，发酵，得到发酵液；
3)向步骤2)得到的发酵液中加入补料培养基和水，发酵，得到料液；所述补料培养基包括：有机氮源0.2～3.0份、无机氮源0.2～3.0份、碳源0.5～3.0份、无机盐a0.1～1.0份、无机盐b0.1～1.0份、微量元素0.0002～0.0006份；
4)所述步骤3)得到的料液经后处理，得到骨化二醇。
优选的，提供所述种子液具体为：将保藏编号为cgmccno.7935菌株接种到种子培养基，种子培养得到种子液。更优选的，提供所述种子液具体为：将保藏编号为cgmccno.7935菌株接种到种子培养基，转速280r/min，温度29℃，培养3天，得到一级种子液；所述初级种子液接种到种子培养基，转速260r/min，温度29℃，空气流量0.9立方米/小时，压力0.05mpa，培养2天，得到二级种子液；所述二级种子液接种到所述种子培养基，转速180r/min，温度29℃，空气流量18立方米/小时，压力0.05mpa，培养1天，得到所述种子液。
优选的，所述保藏编号为cgmccno.7935菌株由保藏编号为cgmccno.7935的菌种接种到斜面培养基培养得到。优选的，所述斜面培养基由葡萄糖1.5g/l00ml，蛋白胨1.0g/l00ml，玉米浆0.3g/l00ml，氯化钠0.4g/l00ml，琼脂1.5g/l00ml和余量的水组成；所述斜面培养基ph值为7.0。优选的，所述种子培养基由蛋白胨1.5g/l00ml、玉米浆1.5g/l00ml、葡萄糖1.5g/l00ml、黄豆粉0.4g/l00ml、氯化钠0.5g/l00ml、磷酸二氢钾0.2g/l00ml和余量的水组成；所述种子培养基ph值为7.5。
优选的，所述发酵培养基由蛋白胨1.5g/l00ml、玉米浆1.5g/l00ml、葡萄糖1.5g/l00ml、黄豆粉0.4g/l00ml、氯化钠0.5g/l00ml、磷酸二氢钾0.2g/l00ml和余量的水组成；所述发酵培养基ph值为7.5。
优选的，所述步骤2)具体为：种子液接入所述发酵培养基，发酵，得到发酵液；所述发酵过程加入倍他环糊精和维生素d3。优选的，所述步骤2)具体为：种子液接入所述发酵培养基，转速80r/min搅拌，发酵，得到发酵液；所述发酵条件为：发酵温度为28℃，发酵空气流量为90立方米/小时，发酵压力0.05mpa，。
优选的，所述后处理为萃取，浓缩，柱层析和结晶。
实施例1
1)
a)斜面菌种：
斜面培养基由葡萄糖1.5g/l00ml，蛋白胨1.0g/l00ml，玉米浆0.3g/l00ml，氯化钠0.4g/l00ml，琼脂1.5g/l00ml和余量的水组成；斜面培养基ph值为7.0。
将保藏编号为cgmccno.7935的菌种接种到斜面培养基培养得到保藏编号为cgmccno.7935菌株。
b)种子液：
种子培养基由蛋白胨1.5g/l00ml、玉米浆1.5g/l00ml、葡萄糖1.5g/l00ml、黄豆粉0.4g/l00ml、氯化钠0.5g/l00ml、磷酸二氢钾0.2g/l00ml和余量的水组成；所述种子培养基ph值为7.5。
将保藏编号为cgmccno.7935菌株接种到100ml种子培养基500ml三角烧瓶中，摇瓶转速280r/min，温度29℃，培养3天，得到一级种子液；火焰保护下所述一级种子液接种到已灭菌的装有30升种子培养基的50升发酵罐中，转速260r/min，温度29℃，空气流量0.9立方米/小时，压力0.05mpa，培养2天，得到二级种子液；取30升所述中级种子液接种到灭菌管道压入到已灭菌的装有300升所述种子培养基的500升发酵罐中，搅拌轴转速180r/min，温度29℃，空气流量18立方米/小时，压力0.05mpa，培养1天，得到所述种子液。
c)所述发酵培养基由蛋白胨1.5g/l00ml、玉米浆1.5g/l00ml、葡萄糖1.5g/l00ml、黄豆粉0.4g/l00ml、氯化钠0.5g/l00ml、磷酸二氢钾0.2g/l00ml和余量的水组成；所述发酵培养基ph值为7.5。
2)取300升上述得到种子液接入装有3000升所述发酵培养基的5000升发酵罐中，搅拌轴转速80r/min搅拌，发酵，得到发酵液；所述发酵过程加入溶解有27kg倍他环糊精的溶液300升和溶解有4.5kg维生素d3的溶液100升；所述发酵条件为：发酵温度为28℃，发酵空气流量为90立方米/小时，发酵压力0.05mpa，发酵时间为3天。
3)提供上述得到的发酵液，向所述发酵液中加入补料培养基和水，发酵，得到料液，所述料液中包括所述骨化二醇；以重量份计，所述补料培养基包括：有机氮源0.5g/l00ml、无机氮源0.2g/l00ml、碳源0.5g/l00ml、无机盐a0.2g/l00ml、无机盐b0.2g/l00ml、微量元素0.0003g/l00ml和氨基酸1.0g/l00ml；所述有机氮源为蛋白胨，所述无机氮源为硫酸铵，所述碳源为葡萄糖，所述无机盐a为磷酸二氢钠，所述无机盐b为硫酸镁，所述微量元素为氯化锰和氯化铁，所述氨基酸为缬氨酸。
4)上述得到的料液经后处理，得到骨化二醇；所述后处理为萃取，浓缩，柱层析和结晶。
其中，所述步骤3)中，向所述发酵液中加入补料培养基具体为：向所述发酵液中加入补料培养基，直至料液中菌丝体浓度为25％(v/v)时，停止加入所述补料培养基；菌丝体浓度的测定条件为:料液经转速为4000转/分钟离心分离10分钟后进行测定；以发酵液的体积计，向所述发酵液中加入补料培养基的速率为2％/24h。向所述发酵液中加入水具体为：当发酵液中的溶氧低于30％(m/v)时，向所述发酵液中加入水；以发酵液的体积计，向所述发酵液中加入水的速率为3％/h。
试验结果：所述步骤3)中发酵时间为7天，取料液hplc分析骨化二醇含量为0.94mg/ml。
实施例2
本实施例与实施例1的区别仅在于所述补料培养基包括：有机氮源0.5g/l00ml、无机氮源0.2g/l00ml、碳源0.5g/l00ml、无机盐a0.2g/l00ml、无机盐b0.2g/l00ml、微量元素0.0003g/l00ml；所述有机氮源为蛋白胨，所述无机氮源为硫酸铵，所述碳源为葡萄糖，所述无机盐a为磷酸二氢钠，所述无机盐b为硫酸镁，所述微量元素为氯化锰和氯化铁。
试验结果：所述步骤3)中发酵时间为10天，取料液hplc分析骨化二醇含量为0.75g/ml。
实施例3～7
本实施例与实施例1的区别仅在于补料培养基组分所述有机氮源、所述无机氮源、所述碳源、所述无机盐a、所述无机盐b、所述微量元素和所述氨基酸的选择，补料培养基组分选择及试验结果：所述步骤3)中发酵时间、取料液hplc分析骨化二醇含量见表1。
表1
由实施例1～2、3～7可知，所述补料培养基中，优选的，有机氮源选自蛋白胨、黄豆粉、花生粉、玉米浆和酵母膏中的一种或多种，更优选的，所述有机氮源为蛋白胨；优选的，所述无机氮源选自硫酸铵、硝酸铵、尿素和氨中的一种或多种，更优选的，所述的无机氮源为硫酸铵；优选的，所述碳源选自葡萄糖、麦芽糖、淀粉、糊精和蔗糖中的一种或多种，更优选的，所述碳源为葡萄糖；优选的，所述无机盐a选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或多种，更优选的，所述无机盐a为磷酸二氢钠；优选的，所述无机盐b选自硫酸镁、硫酸钠和硫酸钾中的一种或多种，更优选的，所述无机盐b为硫酸镁；优选的，所述微量元素选自氯化铁、硫酸铜和氯化锰中的一种或多种，更优选的，所述的微量元素为氯化锰和氯化铁；优选的，所述补料培养基还包括氨基酸，更优选的，所述氨基酸为选自缬氨酸、脯氨酸、半胱氨酸和苏氨酸中的一种或多种；最优选的，所述氨基酸为缬氨酸。
实施例8～10
本实施例与实施例1的区别仅在于所述补料培养基中组分所述有机氮源、所述无机氮源、所述碳源、所述无机盐a、所述无机盐b、所述微量元素和所述氨基酸的含量，组分含量及试验结果：所述步骤3)中发酵时间、取料液hplc分析骨化二醇含量见表2。
表2
由实施例1～2、8～10可知，所述补料培养基中，优选的，有机氮源0.2～3.0g/l00ml、无机氮源0.2～3.0g/l00ml、碳源0.5～3.0g/l00ml、无机盐a0.1～1.0g/l00ml、无机盐b0.1～1.0g/l00ml、微量元素0.0002～0.0006g/l00ml；更优选的，所述补料培养基包括：有机氮源0.2～1.0g/l00ml、无机氮源0.2～1.0g/l00ml、碳源0.5～1.0g/l00ml、无机盐a0.1～0.3g/l00ml、无机盐b0.1～0.3g/l00ml、微量元素0.0002～0.0004g/l00ml；最优选的，所述补料培养基包括：有机氮源0.5g/l00ml、无机氮源0.2g/l00ml、碳源0.5g/l00ml、无机盐a0.2g/l00ml、无机盐b0.2g/l00ml、微量元素0.0003g/l00ml；所述补料培养基还包括：氨基酸；优选的，氨基酸0.1～2.0g/l00ml；更氨基酸0.2～1.0g/l00ml。
实施例11～14
本实施例与实施例1的区别仅在于所述步骤3)中，向所述发酵液中加入补料培养基，停止加入所述补料培养基时，料液中菌丝体浓度；以发酵液的体积计，向所述发酵液中加入补料培养基的速率；以发酵液的体积计，向所述发酵液中加入水的速率。料液中菌丝体浓度、所述发酵液中加入补料培养基的速率、向所述发酵液中加入水的速率及试验结果：所述步骤3)中发酵时间、取料液hplc分析骨化二醇含量见表3。
表3
由实施例1、11～14可知，向所述发酵液中加入补料培养基具体为：向所述发酵液中加入补料培养基，直至料液中菌丝体浓度为15％～35％(v/v)时，停止加入所述补料培养基；优选的，直至料液中菌丝体浓度为20％～30％(v/v)时，停止加入所述补料培养基；更优选的，直至料液中菌丝体浓度为25％(v/v)时，停止加入所述补料培养基。以发酵液的体积计，向所述发酵液中加入补料培养基的速率为2％/24h～10％/24h。优选的，为2％/24h～5％/24h。以发酵液的体积计，向所述发酵液中加入水的速率为1％/h～10％/h，优选的，为2％/h～5％/h；更优选的，为3％/h。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。