本发明属于生物发酵工程技术领域，具体涉及一种高浓度虫草多糖的发酵方法。
背景技术：
蛹虫草为子囊菌亚门ascomycota、肉座菌目hypocreales、麦角菌科
clavicipitaceae、虫草属(cordyceps)的模式种。学名为cordycepsmilitaris，又名北冬虫夏草、北蛹虫草、虫草等，由子座(即草部分)与菌核(即虫的尸体部分)两部分组成的复合体，世界性分布但天然资源数量很少。中医认为，虫草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚、腰膝酸痛、病后虚弱、久咳痰血、盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。大量的现代药理研究表明蛹虫草不仅具有特殊的营养价值，而且有明显的药用价值。其中虫草多糖是虫草体内含量最丰富、最重要的生物活性物质之一，因具有抗肿瘤、抗氧化、抗辐射及提高机体免疫功能、促进肾上腺的作用、增加人体胰岛素的分泌、降低糖尿病人的血糖水平等广泛的药理作用而倍受关注。虫草多糖是一种高度分枝的半乳甘露聚糖，能够活化巨噬细胞刺激抗体产生，促进淋巴细胞转化，提高血清igg的抗体含量和机体的免疫功能，增强机体自身抗癌抑癌的能力，临床已用于治疗恶性肿瘤。此外，虫草多糖还能改善呼吸系统，抗心律失常、抗心肌缺血、扩张外周血管、降压、降血脂、抑制血小板聚集等。目前世界范围内对蛹虫草及虫草多糖的需求增长迅速，而野生的蛹虫草中虫草多糖的含量不高，再加上人们的疯狂采摘，价格日益昂贵，蛹虫草多糖的广泛应用受到药源资源的严重制约，而且通过化学合成的途径工艺复杂且产量极低。采用液体发酵的方法生产蛹虫草多糖具有生产周期短、劳动力节省、受外部环境影响小等优点，而且研究发现从蛹虫草子实体、菌丝体及发酵液中得到的虫草多糖在生化结构上基本是相同的，因此被认为是一种有效的替代从天然蛹虫草提取多糖的生产方法。但目前蛹虫草多糖的发酵水平不高，产量偏低限制了其工业化生产的发展。与真菌多糖领域的大量研究相比，国内外对蛹虫草多糖的研究报道屈指可数，而且多集中在最近几年，主要集中在发酵及产物提取分离等工艺层面上。
如专利文献cn101067005(申请号200710052357)，公开了一种用大米生产虫草多糖方法，其包括配料、接种、培养、获取虫草多糖及辐照灭菌后包装步骤。所述配料中，各原料的配比是：按重量计，大米45.0-49.0％，玉米和豆饼混合粉0.9-2％，营养液49.0-54.1％；营养液配方为土豆180-220g，白糖18-22g，蛋白胨13-18g，磷酸二氢钾1.5-2.2g，硫酸镁0.8-1.2g，水900-1100g。目前，尚未有从蛹虫草多糖生物代谢的角度分析的研究，对蛹虫草多糖发酵水平的提高有限，发酵周期长，成本高，整体的生产效率较低，发酵生产出的虫草多糖浓度不够高，还不能远满足现代工业化发酵生产的需要。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供一种高浓度虫草多糖的发酵方法，极大的优化了蛹虫草多糖发酵的工艺条件，有效缩短了发酵周期和生产成本，提高整体的生产效率以及发酵生产出的虫草多糖的浓度，为现代工业化虫草多糖的发酵生产的提供有力支持。
本发明的技术方案为：一种高浓度虫草多糖的发酵方法，包括如下步骤：
（1）将蛹虫草菌种接种到pd液体发酵培养基中，进行活化培养，然后按体积百分数10-15%的接种量接到种子发酵培养基中，进行种子培养，种子培养条件为：温度20-25℃，摇床培养2-4天，得种子液；
（2）将步骤（1）制得种子液按5-10%体积比接种于液体发酵培养基中，在温度20-25℃的条件下，液体发酵培养1-6天，然后加入活性发酵液，使裂壶藻发酵蛋白产物的浓度为0.15-0.85mg/ml，然后继续培养2-9天，分离，得到蛹虫草菌丝体和发酵液；
（3）从步骤（2）制得的发酵液中提取蛹虫草胞外多糖，从步骤（2）制得的蛹虫草菌丝体中提取蛹虫草胞内多糖，混合蛹虫草胞外多糖和蛹虫草胞内多糖，即得虫草多糖；
所述步骤（1）中的种子发酵培养基，每升组分如下：
3g葡萄糖、1.5g酵母粉上清液、0.1gmgso4、0.03gcacl2、0.1gkh2po4、0.1gk2hpo4，2-5颗直径3-6mm的玻璃珠；
所述步骤（2）中的液体发酵培养基，每升组分如下：
3g乳糖、2g糖蜜、2g豆粕粉、1.5g蛋白胨，0.1gmgso4、0.03gcacl2、0.1gkh2po4、0.1gk2hpo4；
所述活性发酵液为裂壶藻发酵产物，其制备方法为：
取经过清洗的裂壶藻原料，设定酶解条件为料液比1∶10（m/v）、纤维素酶cellulaseaccf-4740添加量2%、温度55℃、ph4.5、反应时间1.3h，进行酶解，纤维素酶水解结束后，沸水浴灭酶15min，9000r/min离心，收集上清液得到裂壶藻纤维素酶水解液；裂壶藻酶解液灭酶活后，调节ph值至6.2-6.6，高压蒸汽灭菌（121℃，20min），然后接种体积分数1%的mrs培养基活化的戊糖片球菌液到裂壶藻酶解液，37℃恒温培养箱静置，进行发酵；发酵结束后，9000r/min离心，收集上清液得到裂壶藻发酵产物，即为制备的活性发酵液。
进一步的，所述步骤（1）中的活化培养条件为：摇床转速100-160r/min，温度20-25℃，暗培养活化3-5天。
进一步的，步骤（2）中所述的分离是在15000r/min条件下离心分离5-10min。
进一步的，所述步骤（3）中提取蛹虫草胞外多糖的方法，步骤如下：
取步骤（2）制得的发酵液，加入4倍体积的95%乙醇，混匀后4℃静置5h，12000rpm离心10min，取沉淀，用6ml浓度为1mnaoh溶液60℃溶解1h，制得蛹虫草胞外多糖。
进一步的，所述步骤（3）中提取蛹虫草胞内多糖的方法，步骤如下：
将步骤（2）制得的蛹虫草菌丝体65℃烘干，研成粉末，按每克蛹虫草菌丝体粉末加6ml浓度为1m的naoh溶液，60℃浸提2h，然后12000r/min离心5min，取上清液，制得蛹虫草胞内多糖。
海洋微藻作为一类原始而十分重要的海洋生物资源，富含多不饱和脂肪酸、多糖、多肽等多种生物活性物质，现主要用于制备生物能源及水产养殖饲料，关于用于发酵的活性物质制备的报道更为少见。裂壶藻是一类富含多不饱和脂肪酸的微藻，常被用来生产高纯度二十二碳六烯酸（docosahexaenoicacid，dha）的保健品、婴幼儿乳制品添加剂等。裂壶藻经提取多不饱和脂肪酸后所产生的藻渣其蛋白质含量可高达40%以上，然而目前这些藻渣大多被当成饲料或肥料处理，蛋白资源未得到充分开发与利用。将裂壶藻发酵蛋白产物应用于蛹虫草的液体发酵生产，用以提高虫草多糖产量等次生代谢产物产量的研究国内外尚未见报道。
本发明的有益效果在于：
1、本发明将裂壶藻发酵蛋白产物应用于蛹虫草多糖的液体发酵生产，胞内多糖产量可达2.31g/l，胞外多糖产量可达8.37g/l，分别比现有技术提高了1.9倍和7.6倍以上；本发明大大提高了整体蛹虫草的虫草多糖有效成分的生产量，具有很好的工业化应用前景；
2、本发明采用液体好氧发酵方法，一般为5-7天，相对于现有技术，产量高，周期短，无需静置培养及诱导合成产物等过程，生产效率较高，所生产的蛹虫草多糖可直接用于免疫力调节、抗肿瘤、降血糖等药物的制备；
3、本发明所述裂壶藻发酵蛋白产物的原料来源广泛，成本较低，制备方法也相对简单，可规模提取生产，对蛹虫草虫草多糖类物质的发酵生产具有很好的促进和提升效果；
4、本发明所采用的蛹虫草液体发酵工艺简单，环保无毒，原材料成本低廉，而且全发酵过程可控，不受外部环境条件限制，适合工业化生产及推广应用。
5、本发明对液体发酵培养基和种子发酵培养基的配方进行了优化，能够大幅度提高蛹虫草多糖的产量。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种高浓度虫草多糖的发酵方法，包括如下步骤：
（1）将蛹虫草菌种接种到pd液体发酵培养基中，进行活化培养，然后按体积百分数15%的接种量接到种子发酵培养基中，进行种子培养，种子培养条件为：温度25℃，摇床培养2天，得种子液；
（2）将步骤（1）制得种子液按10%体积比接种于液体发酵培养基中，在温度25℃的条件下，液体发酵培养1天，然后加入活性发酵液，使裂壶藻发酵蛋白产物的浓度为0.85mg/ml，然后继续培养2天，分离，得到蛹虫草菌丝体和发酵液；
（3）从步骤（2）制得的发酵液中提取蛹虫草胞外多糖，从步骤（2）制得的蛹虫草菌丝体中提取蛹虫草胞内多糖，混合蛹虫草胞外多糖和蛹虫草胞内多糖，即得虫草多糖；
所述步骤（1）中的种子发酵培养基，每升组分如下：
3g葡萄糖、1.5g酵母粉上清液、0.1gmgso4、0.03gcacl2、0.1gkh2po4、0.1gk2hpo4，2-5颗直径3-6mm的玻璃珠；
所述步骤（2）中的液体发酵培养基，每升组分如下：
3g乳糖、2g糖蜜、2g豆粕粉、1.5g蛋白胨，0.1gmgso4、0.03gcacl2、0.1gkh2po4、0.1gk2hpo4；
所述活性发酵液为裂壶藻发酵产物，其制备方法为：
取经过清洗的裂壶藻原料，设定酶解条件为料液比1∶10（m/v）、纤维素酶cellulaseaccf-4740添加量2%、温度55℃、ph4.5、反应时间1.3h，进行酶解，纤维素酶水解结束后，沸水浴灭酶15min，9000r/min离心，收集上清液得到裂壶藻纤维素酶水解液；裂壶藻酶解液灭酶活后，调节ph值至6.2-6.6，高压蒸汽灭菌（121℃，20min），然后接种体积分数1%的mrs培养基活化的戊糖片球菌液到裂壶藻酶解液，37℃恒温培养箱静置，进行发酵；发酵结束后，9000r/min离心，收集上清液得到裂壶藻发酵产物，即为制备的活性发酵液。
进一步的，所述步骤（1）中的活化培养条件为：摇床转速160r/min，温度25℃，暗培养活化3天。
进一步的，步骤（2）中所述的分离是在15000r/min条件下离心分离5min。
进一步的，所述步骤（3）中提取蛹虫草胞外多糖的方法，步骤如下：
取步骤（2）制得的发酵液，加入4倍体积的95%乙醇，混匀后4℃静置5h，12000rpm离心10min，取沉淀，用6ml浓度为1mnaoh溶液60℃溶解1h，制得蛹虫草胞外多糖。
进一步的，所述步骤（3）中提取蛹虫草胞内多糖的方法，步骤如下：
将步骤（2）制得的蛹虫草菌丝体65℃烘干，研成粉末，按每克蛹虫草菌丝体粉末加6ml浓度为1m的naoh溶液，60℃浸提2h，然后12000r/min离心5min，取上清液，制得蛹虫草胞内多糖。
本实施例提供的一种高浓度虫草多糖的发酵方法，极大的优化了蛹虫草多糖发酵的工艺条件，有效缩短了发酵周期和生产成本，提高整体的生产效率以及发酵生产出的虫草多糖的浓度，为现代工业化虫草多糖的发酵生产的提供有力支持。
实施例2
一种高浓度虫草多糖的发酵方法，包括如下步骤：
（1）将蛹虫草菌种接种到pd液体发酵培养基中，进行活化培养，然后按体积百分数10%的接种量接到种子发酵培养基中，进行种子培养，种子培养条件为：温度20℃，摇床培养2天，得种子液；
（2）将步骤（1）制得种子液按5%体积比接种于液体发酵培养基中，在温度20℃的条件下，液体发酵培养6天，然后加入活性发酵液，使裂壶藻发酵蛋白产物的浓度为0.85mg/ml，然后继续培养2-9天，分离，得到蛹虫草菌丝体和发酵液；
（3）从步骤（2）制得的发酵液中提取蛹虫草胞外多糖，从步骤（2）制得的蛹虫草菌丝体中提取蛹虫草胞内多糖，混合蛹虫草胞外多糖和蛹虫草胞内多糖，即得虫草多糖；
所述步骤（1）中的种子发酵培养基，每升组分如下：
3g葡萄糖、1.5g酵母粉上清液、0.1gmgso4、0.03gcacl2、0.1gkh2po4、0.1gk2hpo4，2-5颗直径3-6mm的玻璃珠；
所述步骤（2）中的液体发酵培养基，每升组分如下：
3g乳糖、2g糖蜜、2g豆粕粉、1.5g蛋白胨，0.1gmgso4、0.03gcacl2、0.1gkh2po4、0.1gk2hpo4；
所述活性发酵液为裂壶藻发酵产物，其制备方法为：
取经过清洗的裂壶藻原料，设定酶解条件为料液比1∶10（m/v）、纤维素酶cellulaseaccf-4740添加量2%、温度55℃、ph4.5、反应时间1.3h，进行酶解，纤维素酶水解结束后，沸水浴灭酶15min，9000r/min离心，收集上清液得到裂壶藻纤维素酶水解液；裂壶藻酶解液灭酶活后，调节ph值至6.2-6.6，高压蒸汽灭菌（121℃，20min），然后接种体积分数1%的mrs培养基活化的戊糖片球菌液到裂壶藻酶解液，37℃恒温培养箱静置，进行发酵；发酵结束后，9000r/min离心，收集上清液得到裂壶藻发酵产物，即为制备的活性发酵液。
进一步的，所述步骤（1）中的活化培养条件为：摇床转速100r/min，温度25℃，暗培养活化5天。
进一步的，步骤（2）中所述的分离是在15000r/min条件下离心分离10min。
进一步的，所述步骤（3）中提取蛹虫草胞外多糖的方法，步骤如下：
取步骤（2）制得的发酵液，加入4倍体积的95%乙醇，混匀后4℃静置5h，12000rpm离心10min，取沉淀，用6ml浓度为1mnaoh溶液60℃溶解1h，制得蛹虫草胞外多糖。
进一步的，所述步骤（3）中提取蛹虫草胞内多糖的方法，步骤如下：
将步骤（2）制得的蛹虫草菌丝体65℃烘干，研成粉末，按每克蛹虫草菌丝体粉末加6ml浓度为1m的naoh溶液，60℃浸提2h，然后12000r/min离心5min，取上清液，制得蛹虫草胞内多糖。
实施例3
一种高浓度虫草多糖的发酵方法，包括如下步骤：
（1）将蛹虫草菌种接种到pd液体发酵培养基中，进行活化培养，然后按体积百分数12.7%的接种量接到种子发酵培养基中，进行种子培养，种子培养条件为：温度23℃，摇床培养3天，得种子液；
（2）将步骤（1）制得种子液按7%体积比接种于液体发酵培养基中，在温度22℃的条件下，液体发酵培养3天，然后加入活性发酵液，使裂壶藻发酵蛋白产物的浓度为0.5mg/ml，然后继续培养4天，分离，得到蛹虫草菌丝体和发酵液；
（3）从步骤（2）制得的发酵液中提取蛹虫草胞外多糖，从步骤（2）制得的蛹虫草菌丝体中提取蛹虫草胞内多糖，混合蛹虫草胞外多糖和蛹虫草胞内多糖，即得虫草多糖；
所述步骤（1）中的种子发酵培养基，每升组分如下：
3g葡萄糖、1.5g酵母粉上清液、0.1gmgso4、0.03gcacl2、0.1gkh2po4、0.1gk2hpo4，2-5颗直径3-6mm的玻璃珠；
所述步骤（2）中的液体发酵培养基，每升组分如下：
3g乳糖、2g糖蜜、2g豆粕粉、1.5g蛋白胨，0.1gmgso4、0.03gcacl2、0.1gkh2po4、0.1gk2hpo4；
所述活性发酵液为裂壶藻发酵产物，其制备方法为：
取经过清洗的裂壶藻原料，设定酶解条件为料液比1∶10（m/v）、纤维素酶cellulaseaccf-4740添加量2%、温度55℃、ph4.5、反应时间1.3h，进行酶解，纤维素酶水解结束后，沸水浴灭酶15min，9000r/min离心，收集上清液得到裂壶藻纤维素酶水解液；裂壶藻酶解液灭酶活后，调节ph值至6.2-6.6，高压蒸汽灭菌（121℃，20min），然后接种体积分数1%的mrs培养基活化的戊糖片球菌液到裂壶藻酶解液，37℃恒温培养箱静置，进行发酵；发酵结束后，9000r/min离心，收集上清液得到裂壶藻发酵产物，即为制备的活性发酵液。
进一步的，所述步骤（1）中的活化培养条件为：摇床转速125r/min，温度22℃，暗培养活化4天。
进一步的，步骤（2）中所述的分离是在15000r/min条件下离心分离7min。
进一步的，所述步骤（3）中提取蛹虫草胞外多糖的方法，步骤如下：
取步骤（2）制得的发酵液，加入4倍体积的95%乙醇，混匀后4℃静置5h，12000rpm离心10min，取沉淀，用6ml浓度为1mnaoh溶液60℃溶解1h，制得蛹虫草胞外多糖。
进一步的，所述步骤（3）中提取蛹虫草胞内多糖的方法，步骤如下：
将步骤（2）制得的蛹虫草菌丝体65℃烘干，研成粉末，按每克蛹虫草菌丝体粉末加6ml浓度为1m的naoh溶液，60℃浸提2h，然后12000r/min离心5min，取上清液，制得蛹虫草胞内多糖。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。本发明中所未详细描述的技术细节，均可通过本领域中的任一现有技术实现。特别的，本发明中所有未详细描述的技术特点均可通过任一现有技术实现。