3R-吲哚甲基-6R-酰胺侧链氨基酸修饰的哌嗪-2,5-二酮，其合成，活性和应用的制作方法

本发明涉及(3r,6r)-3-(aa-氨基正己酰基氨基正丁基)-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮。涉及它们的制备方法、涉及它们的抗肿瘤活性，涉及它们的抗肿瘤转移活性,以及涉及它们的抗炎活性活性，因而本发明涉及它们在制备抗肿瘤药物，抗肿瘤转移药物和抗炎药物中的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

肿瘤严重威胁人类的健康。除了自身对肿瘤患者的预后恶劣之外，肿瘤并发的转移进一步恶化患者的预后。例如，超过90％以上肿瘤患者都是死于转移。由于现有抗肿瘤药物没有抗肿瘤转移作用，所以肿瘤化疗的临床疗效不理想。发明抗肿瘤转移的药物是临床的迫切需求。此前，发明人曾公开s,s-,r,r-,r,s-和s,r-四种构型的的二酮哌嗪在0.5μm浓度可抑制hcclm3(高转移人肝癌细胞)迁移和侵袭。后来发明人又公开r,r-构型的二酮哌嗪在5μmol/kg剂量下可抑制c57bl/6小鼠的肿瘤向肺转移。可是最低有效剂量为5μmol/kg。为了降低最低有效剂量，发明人对r,r-构型的二酮哌嗪的丁氨基展开了各种修饰。经过3年探索，发现用l-gln和l-asn酰化的氨基己酸酰化r,r-构型的二酮哌嗪的丁氨基不仅可使抗肿瘤转移的最低有效剂量降至0.5μmol/kg，而且可使抗肿瘤和抗炎的最低有效剂量都降至0.5μmol/kg。因为药物的毒副作用都可以随剂量降低而消失，所以有效剂量降低10倍表明了这种结构修饰有突出的技术效果。根据这些发现，发明人提出了本发明。

技术实现要素：

本发明的第一个内容是提供下式的(3r,6r)-3-(aa-氨基正己酰基氨基正丁基)-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(aa为l-gln残基和l-asn残基)。

本发明的第二个内容是提供(3r,6r)-3-(aa-氨基正己酰基氨基正丁基)-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(aa为l-gln残基和l-asn残基)的合成方法，该方法包括：

(1)d-boc-lys(cbz)与d-trp-obzl缩合得boc-lys(cbz)-trp-obzl；

(2)boc-lys(cbz)-trp-obzl在氯化氢的乙酸乙酯溶液中脱boc得lys(cbz)-trp-obzl；

(3)lys(cbz)-trp-obzl含5％碳酸氢钠水溶液的乙酸乙酯中环合生成(3r,6r)-3-(苄氧羰基氨基正丁基)-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(1)；

(4)化合物1氢解脱苄氧羰基得到(3r,6r)-3-(氨基正丁基基)-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(2)；

(5)氨基正己酸甲酯与cbz-aa(aa为gln残基和asn残基)缩合得cbz-aa-氨基正己酸甲酯(3a,b)；

(6)化合物3a,b皂化脱除甲酯得到cbz-aa-氨基正己酸(4a,b)；

(7)化合物2与化合物4a,b缩合得(3r,6r)-3-(cbz-aa-氨基正己酰基氨基正丁基)-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(5a,b)；

(8)化合物5a,b在二甲基甲酰胺中氢解脱cbz保护得到(3r,6r)-3-(aa-氨基正己酰基氨基正丁基)-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(6a,b)。

本发明的第三个内容是评价(3r,6r)-3-(aa-氨基正己酰基氨基正丁基)-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(aa为l-gln残基和l-asn残基)抑制c57bl/6小鼠抗肺癌转移活性。

本发明的第四个内容是评价(3r,6r)-3-(aa-氨基正己酰基氨基正丁基)-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(aa为l-gln残基和l-asn残基)对icr小鼠炎症的抑制作用。

本发明的第五个内容是评价(3r,6r)-3-(aa-氨基正己酰基氨基正丁基)-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(aa为l-gln残基和l-asn残基)对s180小鼠肿瘤生长的抑制应用。

附图说明

图1(3r,6r)-3-(aa-氨基正己酰基氨基正丁基)-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(6a,b)的合成路线.3a-6a中aa为l-gln残基；3b-6b中aa为l-asn残基；i)二环己基碳二亚胺(dcc),1-羟基苯并三唑(hobt),n-甲基吗啉(nmm),四氢呋喃(thf)；ii)氯化氢的乙酸乙酯溶液；iii)乙酸乙酯,5％碳酸氢钠；iv)二甲基甲酰胺(dmf),pd/c,h2；v)二环己基碳二亚胺(dcc),1-羟基苯并三唑(hobt),n-甲基吗啉(nmm),n,n-二甲基甲酰胺(dmf)；vi)甲醇，naoh(2m)。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备boc-lys(cbz)-trp-obzl

将7.7g(20mmol)boc-lys(cbz)混悬于100ml无水四氢呋喃(thf)中，在冰浴下依次往悬浮液中加2.7g(20mmol)1-羟基苯并三氮唑(hobt)及5.0g(25mmol)二环己基碳二亚胺(dcc)，然后搅拌30min。之后，加8.0g(25mmol)trp-obzl。反应化合物逐滴加入n-甲基吗啉(nmm)调节ph至9。反应混合物先在冰浴下搅拌1h，再室温搅拌12h。反应化合物过滤，滤液减压浓缩，残留物用150ml乙酸乙酯溶液溶解。得到的乙酸乙酯溶液依次用5％khso4水溶液洗3次，饱和nacl水溶液洗3次。乙酸乙酯层用无水na2so4干燥12h，过滤，滤液减压浓缩至干。得到的黄色糖浆物经硅胶柱层析纯化(ch2cl2/ch3oh,100:1)得到12.0g(88％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/e):657[m+h]⁺。

实施例2制备lys(cbz)-trp-obzl

在冰浴与搅拌下3.8g(5mmol)boc-lys(cbz)-trp-obzl与52ml氯化氢的乙酸乙酯溶液(4m)缓慢混合。得到的溶液在冰浴中搅拌5h。之后，反应混合物减压浓缩。残留物用50ml无水乙酸乙酯溶解，得到的溶液减压浓缩。该操作重复三次。残留物用无水乙醚充分洗，得到3.41g(93％)标题化合物，为黄色粉末。esi-ms(m/e):557[m+h]⁺。

实施例3制备(3r,6r)-3-(苄氧羰基氨基正丁基)-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(1)

将3.45g(6.2mmol)lys(cbz)-trp-obzl用150ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液用浓度为5％的碳酸氢钠水溶液洗三次之后，乙酸乙酯溶液室温搅拌12h使无色固体充分析出。滤出1.8g(51％)标题化合物。esi-ms(m/e):449[m+h]⁺。

实施例4制备(3r,6r)-3-(氨基正丁基)-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(2)

往1.9g(4.2mmol)(3r,6r)-3-(苄氧羰基丁氨基)-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(1)与20ml无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)的溶液中加200mgpd/c，通入h2，室温搅拌反应48h。滤去pd/c，滤液减压浓缩得1.2g(92％)标题化合物，为无色粉末。esi-ms(m/e)：315[m+h]⁺.

实施例5制备氨基正己酸甲酯

往40ml甲醇中滴加5.6ml二氯亚砜，活化30min后，加入2.62g(20mmol)氨基正己酸，室温搅拌12h。反应化合物37℃温水浴搅拌下用水泵将反应液减压抽干，加入干燥甲醇溶解后用水泵减压抽干，重复3次；加入无水乙醚混悬，37℃温水浴搅拌下减压抽干，重复3次，得到2.72g(95％)标题化合物。esi-ms(m/e):145[m+h]⁺

实施例6制备cbz-gln-氨基正己酸甲酯(3a)

采用实施例1的方法从1400mg(5.0mmol)cbz-gln和720mg(5.0mmol)氨基正己酸甲酯得到1640mg(81％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/e):408[m+h]⁺。

实施例7制备cbz-asn-氨基正己酸甲酯(3b)

采用实施例1的方法从1330mg(5.0mmol)cbz-asn和720mg(5.0mmol)氨基正己酸甲酯得到1560mg(91％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/e):394[m+h]⁺。

实施例8制备cbz-gln-氨基正己酸(4a)

将1.22g(3.0mmol)boc-gln-氨基正己酸甲酯(3a)用20mlch3oh溶解。得到的溶液在冰浴搅拌下加入naoh水溶液(2m)调节ph值至12，冰浴搅拌反应6h。冰浴搅拌下，反应液用饱和khso4溶液调节ph值至7，得到溶液减压浓缩。残留物用5％khso4水溶液调节ph值至2。得到的溶液用乙酸乙酯萃取3次，再将乙酸乙酯溶液用饱和nacl水溶液洗至中性。乙酸乙酯层用无水na2so4干燥12h，过滤，滤液减压浓缩至干。得到1.38g标题化合物,为淡黄色糖浆。esi-ms(m/e):394[m+h]⁺。

实施例9制备制备cbz-asn-氨基正己酸(4e)

采用实施例8的方法将1.17g(3.0mmol)cbz-asn-氨基正己酸甲酯(3b)得到1.44g标题化合物,为淡黄色糖浆。esi-ms(m/e):380[m+h]⁺。

实施例10制备(3r,6r)-3-(cbz-gln-氨基正己酰基氨基正丁基)-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(5a)

采用实施例1的方法从1380mg淡黄色糖浆的cbz-gln-氨基正己酸(4a)和940mg(3.0mmol)(3r,6r)-3-丁氨基-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(2)得到810mg(39％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/e):690[m+h]⁺；¹hnmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝10.887(s,1h),8.063(s,1h),7.953(s,1h),7.865(t,j＝5.4hz,1h),7.577(m,2h),7.335(m,8h),7.035(m,2h),6.927(t,j＝7.5hz,1h),6.786(s,1h),5.017(s,2h),4.112(m,1h),3.932(m,1h),3.501(m,1h),3.250(dd,j1＝3.9hz,j2＝14.4hz,1h),3.015(m,3h),2.764(m,2h),1.993(m,7h),1.839(m,1h),1.712(m,1h),1.425(m,4h),1.200(m,5h),0.963(m,3h),0.581(m,3h)。

实施例11制备(3r,6r)-3-(cbz-asn-氨基正己酰基氨基正丁基)-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(5b)

采用实施例1的方法从1440mg淡黄色糖浆的cbz-asn-氨基正己酸(4b)和940mg(3.0mmol)(3r,6r)-3-丁氨基-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(2)得到560mg(28％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/e):676[m+h]⁺；¹hnmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝10.884(s,1h),8.060(s,1h),7.947(s,1h),7.828(m,1h),7.577(m,2h),7.314(m,8h),6.976(m,4h),5.018(s,2h),4.279(q,j＝5.1hz,1h),4.113(m,1h),3.502(m,1h),3.251(dd,j1＝14.4hz,j2＝3.9hz,1h),3.007(m,3h),2.7652(m,2h),2.395(m,2h),2.005(t,j＝7.2hz,2h),1.412(m,4h),1.202(m,2h),0.963(m,3h),0.579(m,3h)。

实施例12制备(3r,6r)-3-(gln-氨基正己酰基氨基正丁基)-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(6a)

按照实施例3的方法从300mg(0.4mmol)(3r,6r)-3-(cbz-gln-氨基正己酰基氨基正丁基)-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(5a)得到180mg(76％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/e):556[m+h]⁺；mp:117–118℃；¹hnmr(500mhz,dmso-d6):δ/ppm＝10.862(s,1h),8.011(d,j＝2hz,1h),7.918(d,j＝2.5hz,1h),7.785(t,j＝6.0hz,1h),7.556(m,2h),7.296(d,j＝8hz,1h),7.243(s,1h),7.019(m,2h),6.925(m,1h),6.683(s,1h),4.106(m,1h),3.501(m,1h),3.238(dd,j1＝4.0hz,j2＝14.5hz,1h),3.030(m,4h),2.755(m,2h),2.086(m,1h),2.016(t,j＝7.5hz,2h),1.744(m,1h),1.545(m,1h),1.485(m,2h),1.404(m,2h),1.211(m,2h),0.980(m,3h),0.599(m,3h)。

实施例13制备(3r,6r)-3-(asn-氨基正己酰基氨基正丁基)-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(6b)

按照实施例4的方法从300mg(0.4mmol)(3r,6r)-3-(cbz-asn-氨基正己酰基氨基正丁基)-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(5b)得到200mg(82％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/e):542[m+h]⁺；mp:119–121℃；¹hnmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝10.873(s,1h),8.032(s,1h),7.932(s,1h),7.836(m,1h),7.579(m,2h),7.375(s,1h),7.305(d,j＝8.1hz,1h),7.043(m,2h),6.932(t,j＝7.2hz,1h),6.829(s,1h),4.115(m,1h),3.509(m,1h),3.438(m,1h),3.250(dd,j1＝3.9hz,j2＝14.4hz,1h),3.033(m,3h),2.764(m,2h),2.397(dd,j1＝15.0hz,j2＝4.2hz,1h),2.152(dd,j1＝15.0hz,j2＝9.0hz,1h),2.016(m,4h),1.433(m,4h),1.223(m,2h),0.977(m,3h),0.609(m,3h)。

实施例14制备(3r,6r)-3-(boc-氨基己酰基丁氨基)-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(7)

采用实施例1的方法从0.97g(4.2mmol)boc-氨基己酸和1.9g(3.5mmol)(3r,6r)-3-丁氨基-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(2)得到0.641g(21％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/e):528[m+h]⁺；¹hnmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝10.872(s,1h),8.035(d,j＝1.8hz,1h),7.928(d,j＝1.8hz,1h),7.560(m,2h),7.303(d,j＝5.7hz,1h),7.034(m,2h),6.925(t,j＝7.5hz,1h),6.763(t,j＝5.1hz,1h),4.108(m,1h),3.499(m,1h),3.246(dd,j1＝14.4hz,j2＝4.2hz,1h),3.009(dd,j1＝14.4hz,j2＝4.2hz,1h),2.890(q,j＝6.6hz,2h),2.750(q,j＝6.6hz,2h),2.002(t,j＝7.2hz,2h),1.465(m,2h),1.350(m,12h),1.205(m,3h),0.951(m,3h),0.553(m,3h)。

实施例15制备(3r,6r)-3-(氨基己酰基丁氨基)-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(8)

采用实施例3的方法从2.21g(4mmol)(3r,6r)-3-(boc-氨基己酰基丁氨基)-6-(吲哚-3-甲基)-哌嗪-2,5-二酮(7)得到1.45g(82％)标题化合物，为无色粉末。esi-ms(m/e):428[m+h]⁺；¹hnmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝11.003(s,1h),8.086(s,1h),7.999(s,1h),7.748(s,1h),7.578(s,j＝8.1hz,1h),7.314(m,j＝8.1hz,1h),7.023(m,2h),6.926(m,1h),4.117(m,1h),3.502(m,1h),3.269(m,1h),3.041(m,1h),2.736(m,4h),2.030(m,2h),1.542(m,4h),1.260(m,2h),0.981(m,3h),0.590(m,3h)。

实施例16测定化合物6a,b的抗肿瘤转移活性

本测定模型用lewis小鼠肺癌细胞(llc,购自atcc)接种,选用dmem培养基(含10％经灭活的胎牛血清,1×10⁵u/l青霉素和100mg/l链霉素),按照贴壁细胞培养方法每两天传代一次，富集细胞。待细胞生长状态良好并处于对数生长期时消化细胞，用生理盐水调整细胞密度至1×10⁷个/ml。胎盘蓝染色，使活细胞计数>95％。取近交系c57bl/6雄性小鼠(spf级,体重20±2g)，左手固定小鼠。用75％乙醇对小鼠右前肢腋窝皮肤消毒。右手持1ml无菌注射器往小鼠腋部皮下注射llc肿瘤细胞悬液，每只小鼠注射0.2ml。小鼠接种10天后，长出直径约4-5mm的肿瘤即为瘤源。接种10天的lewis肺癌荷瘤小鼠乙醚麻醉，脱颈椎处死。用75％乙醇浸泡10min，消毒，在超净工作台上剥离瘤体。选择生长良好的肿瘤组织在无菌平皿中剪碎，置于玻璃制造的组织匀浆器内。按瘤块重比生理盐水体积为1比3(g比ml)的比例加温度为4℃的生理盐水，轻轻研磨制成细胞悬液。细胞悬液过200目细胞筛制单细胞悬液。用生理盐水调单细胞悬液的细胞密度至1.5×10⁷个/ml。胎盘蓝染色，使活细胞计数>95％。左手固定近交系c57bl/6雄性小鼠，用75％的乙醇对小鼠右前肢腋窝皮肤消毒。右手持1ml无菌注射器于小鼠腋部皮下注射瘤细胞悬液，每只注射0.2ml。接种10天后小鼠长出直径4-5mm的肿瘤，按测得的肿瘤体积将接种小鼠随机分组。每组12只小鼠。接种肿瘤的第11天小鼠或口服公认的抗肿瘤转移肽rgds的生理盐水溶液(剂量为20μmol/kg/天)或口服化合物6a-e的生理盐水溶液(剂量为0.5μmol/kg/天)或口服化合物8的生理盐水溶液(剂量为5μmol/kg/天)或口服生理盐水(剂量为10ml/kg/天)，每天给1次药，连续给药12天，每隔两天测量并记录肿瘤体积。最后一次给药的次日测量瘤体积，乙醚麻醉脱颈椎处死，取小鼠的肿瘤称重，取小鼠的肺并计算肿瘤肺部转移的瘤节数。用t检验对数据进行统计分析。结果见表1。在0.5μmol/kg剂量下化合物6a,b不仅有效地抑制肿瘤肺转移，而且活性与剂量比它们高40倍的rgds及剂量比它们高10倍的化合物8没有显著性差异。这些数据表明，本发明有显著的技术效果。

表1化合物6a,b的抗肿瘤转移活性

a)与生理盐水比p<0.01,与rgds及化合物8比p>0.05；n＝11

实施例17测定化合物6a,b的抗肿瘤生长活性

测定前将阿霉素,化合物8和化合物6a,b都用生理盐水溶解,用于s180小鼠给药。在无菌环境中取接种于雄性icr小鼠10天生长旺盛的s180腹水瘤液，用生理盐水稀释成(1:2)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞。按细胞浓度＝4大方格内活细胞数/4×10⁴×稀释倍数＝细胞数/ml计算细胞密度，按细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％计算细胞存活率。将存活率大于90％的瘤液用匀浆法制成密度为2.0×10⁷个/ml的细胞悬液。该细胞悬液接种于小鼠右腋皮下(0.2ml/只)，制造s180荷瘤小鼠。接种24h后s180荷瘤小鼠每日腹腔注射阿霉素的生理盐水溶液(剂量为2μmol/kg/天g)或每日口服化合物8的生理盐水溶液(剂量为5μmol/kg/天)或每日口服化合物6a,b的生理盐水溶液(剂量为0.5μmol/kg/天)。每天给药一次，连续给药12天。最后一次给药的次日测量瘤体积，乙醚麻醉脱颈椎处死，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤钝性剥离肿瘤并称重。用瘤重(均值±sdg)表示疗效，数据用t检验和方差分析。结果见表2。在0.5μmol/kg剂量下化合物6a,b不仅有效地抑制肿瘤生长，而且活性与剂量比它们高10倍的化合物8没有显著性差异。这些数据表明，本发明有显著的技术效果。

表2化合物6a,b对s180小鼠肿瘤生长的影响

a)与生理盐水比p<0.01,与化合物8比p>0.05；n＝12.

实施例18测定化合物6a,b的抗炎活性

因为二甲苯引起的小鼠耳肿胀被公认为急性炎症模型，所以本发明在二甲苯引起的小鼠耳肿胀模型上测定化合物6a,b的治疗作用。因为阿司匹林是治疗急性炎症的阳性药，所以本发明选择阿司匹林为阳性对照药。icr雄性小鼠(体重20±2g)在温度为22℃的环境静息2天,自由饮水和进食。之后，随机分为生理盐水组(剂量为0.2ml/只)，阿司匹林组(剂量为1.11mmol/kg)，化合物8组(剂量为5μmol/kg)及化合物6a,b组(剂量为0.5μmol/kg)，每组12只小鼠。测定时小鼠按所在组或口服生理盐水，或口服阿司匹林，或口服化合物8，或口服化合物6a,b。给药30min后,往小鼠的左耳廓均匀涂抹30μl二甲苯,2h后小鼠接受乙醚麻醉，断颈处死,剪下左右两耳,用7mm的打孔器在两耳的相同位置取圆形耳片,称重,求出两耳肿胀差值作为肿胀度。即肿胀度＝左耳圆片重量–右耳圆片重量。结果见表2。在0.5μmol/kg剂量下化合物6a,b不仅有效地抑制二甲苯引起的小鼠耳肿胀，而且活性与剂量比它们高10倍的化合物8没有显著性差异。这些数据表明，本发明有显著的技术效果。

表3化合物6a,b对二甲苯引起的小鼠耳肿胀的影响

a)与生理盐水比p<0.01,与化合物8比p>0.05；n＝12。