儿童急性淋巴细胞白血病基因分型的试剂盒的制作方法

本发明涉及生物医学领域，具体涉及儿童急性淋巴细胞白血病基因分型的试剂盒。
背景技术：
：白血病是造血系统的恶性增殖性疾病，是严重威胁小儿生命和健康的疾病之一。其中，急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblasticleukemia，all)是最常见的类型，占儿童白血病的75％-80％。目前公认儿童all是多基因、多信号通路改变的一种异质性肿瘤。初诊时精确的诊断分型是保证临床合理化治疗、取得良好预后的基础。目前国际上对儿童all的诊断分型通用的是细胞形态学(morphology)、免疫学(immunology)、细胞遗传学(cytogenetics)和分子生物学(molecularbiology)分型，即micm分型。根据micm分型结果，一般分为如下七个亚型：bcr-abl1+all、e2a-pbx1+all、超二倍体all、mll基因重排+all、othersb-all、t-all和tel-aml1+all。然而，在micm分型指导下，大约25％的all患儿至今未能检出染色体数目或结构异常；即使相同亚型的患儿，采用相同的治疗方案，也可出现不同的治疗效果。可见，具有相同形态学、免疫学、细胞遗传学和融合基因特征的儿童all，还具有更微观水平的其他区别。因此，探索更加精确合理、简便快捷并易于临床推广应用的分型方法已成为儿童all个性化治疗的迫切需要。采用简捷高效的gexp多重基因表达遗传分析技术(multiplexgeneexpressionprofilergeneticanalysissystem，gexp)检测57个与临床亚型密切相关的分型基因，可准确将儿童all分成上述七个亚型，与micm常规分型的符合率达到94％(具体内容已在中国发明专利文献cn104059970b中公开)。该方法具有实验成本低且检测周期短等优点，但操作步骤较繁琐、灵敏度较低且反应体系较不稳定。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是如何对儿童急性淋巴细胞白血病进行基因分型。为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于儿童急性淋巴细胞白血病基因分型检测的试剂盒。该试剂盒适用于采用gexp多重基因表达遗传分析系统，通过3个扩增反应对56个儿童急性淋巴细胞白血病的分型基因(其中pbx1基因在gexp系统中设计两对引物，实则57对引物)进行检测。所述试剂盒为试剂盒甲或试剂盒乙。本发明所提供的试剂盒甲可包括引物对组a、引物对组b和引物对组c，其特征在于：所述试剂盒甲还包括udg酶和dutp。每个引物对组对应于1个gexp扩增反应。所述引物对组a可含有如下20个引物对：20个正向引物的序列分别为：序列1至序列20均去除自5’末端起的18个核苷酸后所形成的20个序列；与所述20个正向引物相匹配的反向引物的序列依次分别为：序列21至序列40均去除自5’端末端起的19个核苷酸后所形成的20个序列。所述引物对组b可含有如下18个引物对：18个正向引物的序列分别为：序列41至序列58均去除自5’末端起的18个核苷酸后所形成的18个序列；与所述18个正向引物相匹配的反向引物的序列依次分别为：序列59至序列76均去除自5’端末端起的19个核苷酸后所形成的18个序列。所述引物对组c可含有如下19个引物对：19个引物对的正向引物的序列分别为：序列77至序列95均去除自5’末端起的18个核苷酸后所形成的19个序列；与所述19个正向引物相匹配的反向引物的序列依次分别为：序列96至序列114均去除自5’端末端起的19个核苷酸后所形成的19个序列。在实际操作中，为了保证gexp系统检测的高准确性，所述试剂盒甲中，所述引物对组a、所述引物对组b和所述引物对组c中均还可包括如下3个内参引物对和2个质控引物对：所述3个内参引物对的正向引物的序列分别可为：序列115至序列117均去除自5’末端起的18个核苷酸后所形成的3个序列；与所述3个内参引物对的正向引物相匹配的反向引物的序列依次分别可为：序列118至序列120均去除自5’端末端起的19个核苷酸后所形成的3个序列；所述2个质控引物对的正向引物的序列分别可为：序列121和序列122均去除自5’末端起的18个核苷酸后所形成的2个序列；与所述2个质控引物对的正向引物相匹配的反向引物的序列依次分别可为：序列123和序列124均去除自5’端末端起的19个核苷酸后所形成的2个序列。上述任一所述试剂盒甲可由所述引物对组a、所述引物对组b、所述引物对组c、所述udg酶和所述dutp组成。在本发明中，所述引物对组a具体由所述试剂盒甲中如上所述20个引物对(所述引物对组a中)、所述3个内参引物对和所述2个质控引物对组成；所述引物对组b具体由所述试剂盒甲中如上所述18个引物对(所述引物对组b中)、所述3个内参引物对和所述2个质控引物对组成；所述引物对组c具体由所述试剂盒甲中如上所述19个引物对(所述引物对组c中)、所述3个内参引物对和所述2个质控引物对组成。其中，以上所有的自5’末端起的18个核苷酸，以及自5’端末端起的19个核苷酸，均为为实现采用gexp多重基因表达遗传分析系统对儿童急性淋巴细胞白血病的分型基因的表达量进行测定而设置的正向通用tag序列(5’-aggtgacactatagaata-3’)和反向通用tag序列(5’-gtacgactcactataggga-3’)。本发明所提供的试剂盒乙可包括引物对组a’、引物对组b’和引物对组c’，其特征在于：所述试剂盒乙还可包括udg酶和dutp。每个引物对组对应于1个gexp扩增反应。所述引物对组a’可含有如下20个引物对：20个正向引物的序列分别为序列1至序列20；与所述20个正向引物相匹配的反向引物的序列依次分别为序列21至序列40。所述引物对组b’可含有如下18个引物对：18个正向引物的序列分别为序列41至序列58；与所述18个正向引物相匹配的反向引物的序列依次分别为序列59至序列76。所述引物对组c’可含有如下19个引物对：20个正向引物的序列分别为序列77至序列95；与所述20个正向引物相匹配的反向引物的序列依次分别为序列96至序列114。在实际操作中，为了保证gexp系统检测的高准确性，所述试剂盒乙中，所述引物对组a’、所述引物对组b’和所述引物对组c’中均还可包括如下3个内参引物对和2个质控引物对：所述3个内参引物对的正向引物的序列分别可为序列115至序列117；与所述3个内参引物对的正向引物相匹配的反向引物的序列依次分别可为序列118至序列120；所述2个质控引物对的正向引物的序列分别可为序列121和序列122；与所述2个质控引物对的正向引物相匹配的反向引物的序列依次分别可为序列123和序列124。上述任一所述试剂盒乙可由所述引物对组a’、所述引物对组b’、所述引物对组c’、所述udg酶和所述dutp组成。所述为引物对组a’-c’为：在所述引物对组a-c的每条正向引物的5’末端连接所述正向通用tag序列(5’-aggtgacactatagaata-3’)，在每条反向引物的5’末端连接所述反向通用tag序列(5’-gtacgactcactataggga-3’)。在本发明中，所述引物对组a’具体由所述试剂盒乙中如上所述20个引物对(所述引物对组a’中)、所述3个内参引物对和所述2个质控引物对组成；所述引物对组b’具体由所述试剂盒乙中如上所述18个引物对(所述引物对组b’中)、所述3个内参引物对和所述2个质控引物对组成；所述引物对组c’具体由所述试剂盒乙中如上所述19个引物对(所述引物对组c’中)、所述3个内参引物对和所述2个质控引物对组成。上述任一所述试剂盒中还可包括rt酶和/或dna聚合酶。所述dna聚合酶具体可为热启动dna聚合酶。上述任一所述试剂盒中还可包括pcdna3.1(+)质粒和/或kan基因编码的rna片段。其中，所述kan基因编码的rna片段为序列127所示的rna片段，在本发明中具体购自宁波海尔施基因科技有限公司，产品目录号为p/n2060126。上述任一所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。上述任一所述试剂盒的制备方法，可包括包括将所述引物对组中组成各引物对的每条单链dna、所述udg酶和所述dutp分别单独包装的步骤。上述任一所述试剂盒在制备通过gexp多重基因表达遗传分析系统进行儿童急性淋巴细胞白血病基因分型的产品中的应用也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种用于儿童急性淋巴细胞白血病基因分型检测的方法，可包括如下步骤：采用上述任一所述试剂盒对待测儿童急性淋巴细胞白血病患儿的rna进行多重rt-pcr反应，得到扩增产物；根据扩增产物进行基因分型。本发明还保护一种通过gexp多重基因表达遗传分析系统进行儿童急性淋巴细胞白血病基因分型的产品。该产品含有上述任一所述试剂盒。上文中，采用上述任一所述试剂盒或上述任一所述产品对待测儿童急性淋巴细胞白血病患儿的rna进行多重rt-pcr反应的反应体系可为10μl，由2μl模板、2.5μlrt-pcrbuffer、3μlleukemiaprimermix、1μlsolution、1μl浓度为0.25ng/μl的kanrrna和0.5μlrt-pcrenzymemix组成。所述leukemiaprimermix由56个分型基因(57对引物)、3个内参基因和2个质控基因的反向引物、56个分型基因(57对引物)、3个内参基因和2个质控基因的正向引物和pcdna3.1(+)质粒组成。56个分型基因(57对引物)、3个内参基因和2个质控基因的反向引物在该多重rt-pcr反应体系中的引物浓度如表5中第4列所示。56个分型基因(57对引物)、3个内参基因和2个质控基因的正向引物在该多重rt-pcr反应体系中的引物浓度如表5中第5列所示。pcdna3.1(+)质粒在所述leukemiaprimermix中的浓度为1000拷贝数/μl。solution为荧光标记物和dntp的混合液，其中荧光标记物的浓度可为12μm，datp、dctp和dgtp浓度均可为3.5mm，dutp和dttp的总浓度可为3.5mm，dutp和dttp的浓度比可为1:1、1:3或2:3。rt-pcrenzymemix由rt酶、热启动dna聚合酶和udg酶混合而成。udg酶在所述rt-pcrenzymemix中的浓度可为0.25u/μl以上。rt酶、热启动dna聚合酶和udg酶在所述rt-pcrenzymemix中的浓度依次可为10u/μl、2.5u/μl和0.25u/μl。rt酶、热启动dna聚合酶和udg酶在所述rt-pcrenzymemix中的浓度依次可为10u/μl、2.5u/μl和0.375u/μl。所述kanrrna为序列表中序列127所示的rna片段，在本发明中具体购自宁波海尔施基因科技有限公司，产品目录号为p/n2060126。所述rt-pcrbuffer在本发明中具体购自宁波海尔施基因科技有限公司。上述任一所述rt酶和上述任一所述热启动dna聚合酶在本发明中具体购自宁波海尔施基因科技有限公司。实验证明，采用本发明提供的试剂盒可进行rt-pcr一步法，不仅使得操作更加简便、污染的可能性减小、灵敏度提高，而且采用dutp/udg技术防污染，使得实验体系更加稳定，准确性和特异性大大提高，具有重要的应用价值。附图说明图1为不同dutp用量下的gexp多重基因遗传分析系统检测结果。图2为检测不同单位的udg酶抗污染能力。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，bcr-abl1+all简称bcr-abl1，e2a-pbx1+all简称e2a-pbx1，超二倍体all简称hyperdiploid，mll基因重排+all简称mll，othersb-all简称others，tel-aml1+all简称tel-aml1。rt-pcrbuffer、udg酶、rt酶和热启动dna聚合酶均为宁波海尔施基因科技有限公司的产品。solutionx和kanrrna(序列表中序列127所示的rna片段)均为宁波海尔施基因科技有限公司的产品，产品目录号为依次为p/n2060013和p/n2060126。solutionx为荧光标记物和dntp的混合液，其中荧光标记物的浓度为12μm，datp、dctp、dgtp和dttp浓度均为3.5mm。实施例1、临床样本的收集、采集及处理一、临床标本的收集收集2011年5月至2016年8月期间在北京儿童医院治疗的的219例all患儿的初诊骨髓标本(经患儿本人或监护人同意，并签署了知情同意书)。二、急性淋巴细胞白血病初诊患儿诊断分型219例all患儿经过micm分型确诊为all，包括t-all(tlineageall，t-all)患儿16例、前前b-all(progenitorblineageall，pro-b-all)患儿9例、前b-all(precursorblineageall，pre-b-all)患儿3例、普通b-all(commonblineageall，c-b-all)患儿191例。诊断分型标准按全国统一标准(儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议.中华儿科杂志.2006，44(5)：392-395)。采用多重巢式反转录pcr方法检测表1所示的45种染色体结构畸变形成的融合基因。219例all患儿中，检测结果呈阴性的白血病患儿133例，检测结果呈阳性的白血病患儿86例(其中，tel-aml1融合基因阳性白血病患儿56例，e2a-pbx1融合基因阳性白血病患儿12例，mll基因重排的白血病患儿5例，sil-tal1融合基因阳性的白血病患儿4例，bcr-abl1融合基因阳性白血病患儿9例)。表1.北京儿童医院常规检测的45种融合基因联合采用荧光原位杂交技术(fluorescenceinsituhybridization，fish)、染色体核型分析和流式细胞仪检测骨髓细胞dna指数(dnaindex，di)的方法检测染色体结构或数目异常的变异。219例all患儿中，71例患儿为无染色体结构异常的高超二倍体(hyperdiploid)，即染色体数目在51-65条，另有2例hyperdiploid患儿分别合并tel-aml1融合基因阳性和e2a-pbx1融合基因阳性；1例t-all和1例bcr-abl1融合基因阳性患儿同时伴有染色体数目减低，为亚二倍体(hypodiploid)，即染色体数目在30-39条。对219例all患儿总结如下：12例e2a-pbx1，其中1例同时为hyperdiploid；56例tel-aml1，其中1例同时为hyperdiploid；5例mll基因重排，其中1例同时伴有ikzf1缺失；9例bcr-abl1，其中1例同时为hypodiploid，另有5例同时伴有ikzf1缺失；71例hyperdiploid；16例t-all，其中4例含有sil-tal1融合基因，另有1例为hypodiploid；其余50例暂时未检出任何染色体结构或数目异常，暂归为others。患儿详细信息如表2所示。以其中1号患儿为例，融合基因为tel-aml1，即表示该患儿检测45种融合基因的结果只显示她携带有融合基因tel-aml1，而剩余的44种融合基因检测结果均为阴性，染色体数目正常。表2.219例患儿临床信息注：“/”表示检测结果均为阴性。三、骨髓标本的采集在无菌条件下，分别抽取all患儿的骨髓2ml(从不同部位抽取，如胸骨或髂骨)，加入乙二胺四乙酸盐(edta)抗凝。收集骨髓标本要求：edta抗凝，骨髓量大于2ml，无血凝块，标本存放时间小于24h。四、提取单个核细胞从收集的骨髓中提取单个核细胞，操作步骤如下：a、取提取管，加入2ml骨髓标本和10ml红细胞裂解液(用蒸馏水溶解20mgedta钠盐、4.2g氯化铵和0.5g碳酸氢钾，然后用蒸馏水定容至500ml)，充分混合，室温放置3min，1000rpm常温离心3min，然后弃上层液体(观察提取管底层，如混有较多红细胞，可重复该步骤1-2次，以去除红细胞)。b、完成步骤a后，取所述提取管，加入10ml生理盐水，充分混匀，1000rpm常温离心3min，然后弃上层液体。c、完成步骤b后，取所述提取管，加入少量生理盐水，充分混匀后转移至ep管(规格为1.5ml)，4000rpm常温离心5s，弃去上层液体，下层液体即为提取的单个核细胞标本。单个核细胞标本中的单个核细胞数应在107个数量级。将单个核细胞标本存放于-80℃冰箱，备用。五、提取单个核细胞的总rna用trizol试剂(invitrogen公司的产品)提取单个核细胞的总rna，提取步骤依次如下：a、将单个核细胞标本从-80℃冰箱取出，立即加trizol试剂1ml，反复吹打混匀，室温静置5min(目的为使细胞溶解)。b、完成步骤a后，加入氯仿0.2ml，剧烈振摇15s，室温静置3min。然后4℃、12000rpm离心15min。c、完成步骤b后，将上层水相转移至另一ep管(无rna酶)中，再加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀3～4次，室温静置10min。然后4℃、12000rpm离心10min。d、完成步骤c后，弃上清，然后加入1ml75％(v/v)乙醇水溶液，充分洗涤沉淀，4℃、7500rpm离心5min。彻底弃上清，37℃干燥，将沉淀重悬于约20μl的depc水中。e、完成步骤d后，按1:1000比例稀释rna(如：1μlrna加入1000μldepc水)，通过分光光度法测定样品od260及od280，od260/od280比值应大于或等于1.8，否则重新提取样品。rna浓度(μg/μl)＝od260×40×稀释倍数/1000＝od260×40。实施例2、gexp多重基因遗传分析系统检测一、引物的合成57个分型基因、3个内参基因(b2m、psmc4和gusb)和2个质控基因(pcdna3.1(+)和kanr)的引物序列已在中国发明专利文献cn104059970b中公开，具体信息见表3。表3.57个分型基因、3个内参基因和2个质控基因的引物序列及分组排序注：序列1-126为加入了通用tag序列后的引物序列；片段大小*是指去除通用tag序列后的扩增片段大小。二、gexp反应体系优化1、制备rna混合标本随机取表4中编号为1-16的16例初诊all患儿rna标本，先用dna/rna酶-freeh2o分别稀释至50ng/μl，然后等体积混合，得到rna混合样品。16例all患儿的临床资料及rna初始浓度见表4。表4.16例all患儿rna样品的临床信息及rna浓度2、一步法多重rt-pcr反应体系中引物浓度的初步优化(1)一步法多重rt-pcr反应体系的配制初始leukemiaprimermix由1体积份初始rtprimermix(由57个分型基因、3个内参基因和2个质控基因的反向引物混合而成)和1体积份初始pcrprimermix(由57个分型基因、3个内参基因和2个质控基因的正向引物混合，然后加入终浓度为1000拷贝数/μl的pcdna3.1(+)质粒)混合而成。rt-pcrenzyme由rt酶和热启动dna聚合酶混合而成；rt酶和热启动dna聚合酶在rt-pcrenzyme中的浓度依次为10u/μl和2.5u/μl。配制一步法多重rt-pcr反应体系。该一步法多重rt-pcr反应体系为10μl，由2μl步骤1制备的rna混合标本、2.5μlrt-pcrbuffer、3μl初始leukemiaprimermix、1μlsolutionx、1μl浓度为0.25ng/μl的kanrrna和0.5μlrt-pcrenzyme组成。57个分型基因、3个内参基因和2个质控基因的反向引物在该一步法多重rt-pcr反应体系中的浓度均为333nm；57个分型基因、3个内参基因和2个质控基因的正向引物在该一步法多重rt-pcr反应体系中的浓度均为66.7nm。(2)多重rt-pcr和gexp毛细管电泳取步骤(1)配制的一步法多重rt-pcr反应体系，进行多重rt-pcr，得到pcr扩增产物。将该pcr扩增产物进行gexp毛细管电泳。多重rt-pcr反应条件：105℃热盖处理；25℃5min；50℃30min；95℃预变性15min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸1min；4℃保存。根据毛细管电泳结果选定信号相对适中的峰为基准峰，调整各反向引物浓度，从而优化反应体系。具体优化方法：比基准峰高的反向引物设为一组，比基准峰低的反向引物设为另外一组，分别向下或向上设不同浓度梯度，找出相对合适的引物浓度配制成改良的rtprimermix。改良的leukemiaprimermix由1体积份改良的rtprimermix和1体积份初始pcrprimermix混合而成。3、一步法多重rt-pcr反应体系中dutp和dttp比例的确定由于dutp的扩增效率低于dttp，应在发挥dutp防污染作用的同时保证扩增效率，因此dutp和dttp应按一定比例加入。(1)一步法多重rt-pcr反应体系的配制配制一步法多重rt-pcr反应体系。一步法多重rt-pcr反应体系为10μl，由2μl步骤1制备的rna混合标本、2.5μlrt-pcrbuffer、3μl改良的leukemiaprimermix、1μlsolution(solutionx、solutiony1、solutiony2或solutiony3)、1μl浓度为0.25ng/μl的kanrrna和0.5μlrt-pcrenzyme组成。solutionx中，dutp的浓度为0mm，dttp的浓度为3.5mm。solutiony1和solutionx的唯一不同在于：solutiony1中还包括dutp，且dutp的浓度为0.88mm，dttp的浓度为2.62mm(dutp和dttp的浓度比为1:3)。solutiony2和solutionx的唯一不同在于：solutiony2中还包括dutp，且dutp的浓度为1.4mm，dttp的浓度为2.1mm(dutp和dttp的浓度比为2:3)。solutiony3和solutionx的唯一不同在于：solutiony3中还包括dutp，且dutp的浓度为1.75mm，dttp的浓度为1.75mm(dutp和dttp的浓度比为1:1)。(2)多重rt-pcr和gexp毛细管电泳同步骤2中(2)。实验结果见图1(a为solutionx，b为solutiony1，c为solutiony2，d为solutiony3)。结果表明，dutp的加入对扩增效率影响不明显，因此确定使用dutp和dttp的比例为1：1来进行后续多重rt-pcr反应。4、一步法多重rt-pcr反应体系中udg酶用量的确定(1)一步法多重rt-pcr反应体系的配制配制一步法多重rt-pcr反应体系。该一步法多重rt-pcr反应体系为10μl，由2μlpcr扩增产物的稀释液(将步骤3中(2)得到的pcr扩增产物用无dna/rna酶h2o稀释107倍得到)、2.5μlrt-pcrbuffer、3μl改良的leukemiaprimermix、1μlsolutiony3、1μl浓度为0.25ng/μl的kanrrna和0.5μlrt-pcrenzymemix(rt-pcrenzyme、rt-pcrenzymemix1、rt-pcrenzymemix2或rt-pcrenzymemix3)组成。rt-pcrenzymemix1由rt酶、热启动dna聚合酶和udg酶混合而成；rt酶、热启动dna聚合酶和udg酶在rt-pcrenzymemix1中的浓度依次为10u/μl、2.5u/μl和0.125u/μl。rt-pcrenzymemix2由rt酶、热启动dna聚合酶和udg酶混合而成；rt酶、热启动dna聚合酶和udg酶在rt-pcrenzymemix2中的浓度依次为10u/μl、2.5u/μl和0.25u/μl。rt-pcrenzymemix3由rt酶、热启动dna聚合酶和udg酶混合而成；rt酶、热启动dna聚合酶和udg酶在rt-pcrenzymemix3中的浓度依次为10u/μl、2.5u/μl和0.375u/μl。(2)多重rt-pcr和gexp毛细管电泳同步骤2中(2)。实验结果见图2(a为rt-pcrenzyme，b为rt-pcrenzymemix1，c为rt-pcrenzymemix2，d为rt-pcrenzymemix3)。结果表明，0.25u的udg酶(即采用rt-pcrenzymemix2)足以消除稀释107倍的pcr扩增产物污染。5、一步法多重rt-pcr反应体系中引物终浓度的确定(1)一步法多重rt-pcr反应体系的配制配制一步法多重rt-pcr反应体系。该一步法多重rt-pcr反应体系为10μl，由2μl步骤1制备的rna混合标本、2.5μlrt-pcrbuffer、3μl改良的leukemiaprimermix、1μlsolutiony3、1μl浓度为0.25ng/μl的kanrrna和0.5μlrt-pcrenzymemix2组成。(2)多重rt-pcr和gexp毛细管电泳同步骤2中(2)。由于dutp和udg酶的加入，使得扩增效率在一定程度上受到影响。再次向下或向上设不同浓度梯度，找出合适的引物浓度。其中，col6a3和gng11分型基因在rt引物浓度调整至1000nm时，仍然峰高过低，故进一步上调这两个基因的正向引物浓度，至88.9nm时获得理想峰高。nedd4分型基因引物浓度上调后仍不能获得理想的信号峰，考虑该基因的扩增可能受dutp和udg酶的影响较大，故剔除。综合上述优化条件，本发明提供了一步法多重rt-pcr反应体系。该一步法多重rt-pcr反应体系为10μl，由2μl模板、2.5μlrt-pcrbuffer、3μlleukemiaprimermix、1μlsolutiony3、1μl浓度为0.25ng/μl的kanrrna和0.5μlrt-pcrenzymemix2组成。56个分型基因(57对引物)、3个内参基因和2个质控基因的反向引物在该一步法多重rt-pcr反应体系中的引物浓度如表5中第4列所示；56个分型基因(57对引物)、3个内参基因和2个质控基因的正向引物在一步法多重rt-pcr反应体系中的引物浓度如表5中第5列所示。leukemiaprimermix由1体积份rtprimermix(由56个分型基因、3个内参基因和2个质控基因的反向引物混合而成)和1体积份pcrprimermix(由56个分型基因、3个内参基因和2个质控基因的正向引物混合，然后加入终浓度为1000拷贝数/μl的pcdna3.1(+)质粒)混合而成。表5.rt-pcr多重反应体系中的各基因的引物浓度三、制定标准曲线以步骤二配制的leukemiaprimermix做标准曲线实验。以步骤二中1制备的rna混合标本为标准rna样品，梯度分别设置为100ng/μl、50ng/μl、25ng/μl、12.5ng/μl、6.25ng/μl、3.125ng/μl和1.56ng/μl。分别做重复孔，确保结果的重复性及线性关系良好。配制一步法多重rt-pcr反应体系。该一步法多重rt-pcr反应体系为10μl，由2μl不同浓度的标准rna样品、2.5μlrt-pcrbuffer、3μlleukemiaprimermix、1μlsolutiony3、1μl浓度为0.25ng/μl的kanrrna和0.5μlrt-pcrenzymemix2组成。(2)多重rt-pcr和gexp毛细管电泳同步骤2中(2)。标准曲线结果可同时得到目标基因与内参基因的标准曲线，横坐标为标准品的浓度，纵坐标为特定基因与反应质控基因(kanr)峰面积的比值(ratio)。四、gexp基因多重检测1、一步法多重rt-pcr反应以实施例一中提取的rna为模板，采用无dna/rna酶h2o稀释至50ng/μl。在步骤二中配制的leukemiaprimermix的引导下，分别得到56个分型基因、3个内参基因和2个质控基因的pcr扩增产物。反应体系为10μl，由2μl模板、2.5μlrt-pcrbuffer、3μlleukemiaprimermix、1μlsolutiony3、1μl浓度为0.25ng/μl的kanrrna和0.5μlrt-pcrenzymemix2组成。多重rt-pcr反应条件：105℃热盖处理；25℃5min；50℃30min；95℃预变性15min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸1min；4℃保存。2、gexp毛细管电泳gexp多重基因表达遗传分析系统、sls、dss400、石蜡油、分离缓冲液、样品板及缓冲液板均为美国beckmancoulter公司的产品。(1)制备上样缓冲液(sampleloadingsolution，sls)和分子量内标(dnasizestandard-400，dss400)混合液：将32μlsls和0.25μldss400用枪头混匀10次备用。(2)在每个样本孔中加入约32μlsls和dss400混合液，再将步骤1中得到的pcr扩增产物1μl加至样品板，加入一滴石蜡油覆盖样品。(3)另取缓冲液板，在与样品板对应的孔内加入3/4体积的分离缓冲液。(4)进入genomelabgexp多重基因表达遗传分析系统的setup程序，输入样品名，对每个样本指定freg-3分离方法，指定默认的gexp分析方法，开始运行毛细管电泳程序。(5)将gexp原始数据(.cqs文件)导出，将步骤三中绘制的标准曲线及gexp原始数据(.cqs文件)导入急性淋巴细胞白血病基因表达分析软件((v2.0)，2016sr030652，宁波海尔施基因科技有限公司的产品)，计算每个目的基因与内参基因峰面积(peakarea)的比值，最终得到219例初诊all患儿56个分型基因相对表达量(每个目的基因与内参基因的比值)。五、生物信息学分析完成步骤四后，利用随机抽样方法将219例样本随机分为2组，其中111例作为训练集，其余108例作为测试集。利用‘e1071’r程序包(http://www.r-project.org/)和10倍交叉验证策略对111例训练集样本进行训练，构建supportvectormachine(svm)分类器，平均准确度98.30％(见表6)。表6.在111例训练样本中交叉验证56个分型基因-gexp分类器all分型tpfptnfn准确度敏感性特异性bcr-abl12.92.110600.98108110.980631e2a-pbx15.90.110500.99909910.999057hyperdiploid36071.13.90.9648650.9038981mll2.50.510800.99549510.995413others21.53.583.92.10.949550.9137480.96021t-all801030111tel-aml127.60.482.40.60.9909910.9789410.995195注：平均准确度＝98.30％；tp表示真阳性；fp表示假阳性；tn表示真阴性；fn表示假阴性；准确度＝(tp+tn)/(tp+fn+tn+fp)；敏感性＝tp/(tp+fn)；特异性＝tn/(tn+fp)。采用该svm分类器预测108例测试集的样本。分析结果显示(表7)：该分类器预测儿童all完全独立样本常见7种亚型的平均准确度为94.84％。表7.采用56个分型基因-gexp分类器预测108例测试集样本all分型tpfptnfn准确度敏感性特异性bcr-abl10410400.962963na0.962963e2a-pbx13.62.410200.97777810.977051hyperdiploid33.41.66580.9111110.8098010.976458mll0210600.981481na0.981481others18.26.872.910.10.8435190.6469080.915016t-all7.10.910000.99166710.991128tel-aml126.21.878.61.40.9703700.9503330.977696注：平均准确度＝94.84％；tp表示真阳性；fp表示假阳性；tn表示真阴性；fn表示假阴性；准确度＝(tp+tn)/(tp+fn+tn+fp)；敏感性＝tp/(tp+fn)；特异性＝tn/(tn+fp)。上述结果表明，采用本发明提供的rt-pcr一步法取代逆转录和扩增的两步法，不仅使得操作更加简便、污染的可能性减小(rt和pcr反应之间无需开管)、灵敏度提高(cdna产物全部经pcr扩增)，而且采用dutp/udg技术防污染，使得实验体系更加稳定，准确性和特异性大大提高。所谓dutp/udg技术就是将普通反应体系中的dttp部分用dutp替代，再加入udg酶。在反应过程中，由于dttp被部分替换成dutp，因此pcr扩增产物dna片段中均含有dutp。下次扩增时，若反应体系被含有dutp的pcr扩增产物dna污染，则在dutp/udg反应系统中通过在25℃下，udg酶选择性地将含有dutp的pcr扩增产物dna磷酸骨架上的dutp降解下来而对正常胸腺嘧啶或尿嘧啶的模板dna或rna无破坏作用。由于udg酶不耐热，在50℃下会热变性失活，不影响新扩增的pcr扩增产物。这样既防止了含有dutp的pcr扩增产物污染,又不妨碍目的基因的扩增，提高了扩增的准确性和特异性。<110>首都医科大学附属北京儿童医院哈尔滨工业大学宁波海尔施基因科技有限公司<120>儿童急性淋巴细胞白血病基因分型的试剂盒<160>127<170>patentinversion3.5<210>1<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1aggtgacactatagaatatctccctgttggtgatttgt38<210>2<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2aggtgacactatagaatagaactgacttggcaggagat38<210>3<211>36<212>dna<213>人工序列<220><223><400>3aggtgacactatagaatacgctgcacaagttcctgg36<210>4<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>4aggtgacactatagaatactgagactccattttgctgc38<210>5<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>5aggtgacactatagaatagagcacaatgaagcaagaaca39<210>6<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>6aggtgacactatagaatagtgaaaattcctggcgagaag39<210>7<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>7aggtgacactatagaataacaactcagtggagcattca38<210>8<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>8aggtgacactatagaataacgtgcagctaacaaaatgg38<210>9<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>9aggtgacactatagaatatccaccgtaaagaaaatgcg38<210>10<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>10aggtgacactatagaatacaaaggccaaagccaagaaa38<210>11<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>11aggtga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