本发明属于植物抗病性鉴定技术领域，更具体涉及一种叶柄切面涂菌鉴定草莓炭疽病抗性的方法，适用于草莓抗炭疽病种质资源的筛选和抗性评价。
背景技术：
草莓(fragarinananassa)属蔷薇科(rosaceae)草莓属(fragaria)多年生草本植物，草莓浆果色泽鲜艳，是深受消费者喜爱的水果，也是重要的食品工业原料。进入21世纪后,草莓作为一种生产效益较高的经济作物,在市场的需求及效益的驱动下,我国草莓生产发展十分迅速，草莓产业已成为城郊农村产业结构调整后的新兴产业。
炭疽病是草莓生产上的一种主要病害，可造成草莓育苗困难、大量死苗，严重影响草莓产业的发展。目前生产上抗炭疽病的草莓品种一般品质中下，而品质优良的品种对炭疽病的抗性较差。培育品质优良、兼顾抗炭疽病能力较强的品种是草莓育种的方向之一。建立一种简单易行的草莓炭疽病抗性的评价方法，对草莓抗性育种很重要。
关于炭疽病对草莓的影响，国内外均有相关学者进行了一些研究。中国于1991年由叶正文首次发现草莓炭疽病。e.barclaypoling2008年研究了草莓炭疽病的病原学、流行病学、发病机理及对草莓育苗的影响。韩永超等人2016年详细研究了湖北省草莓炭疽菌的种类特征和分布特点。王丰2008年开展了草莓品种对炭疽病抗性的鉴定技术研究，表明点滴接种、菌片接种、喷雾接种3种方法均能使供试草莓植株感染炭疽病,其中以喷雾接种法发病率和病情指数最高。中国发明专利(cn103667427b)公开了一种用于鉴定草莓种质资源炭疽病抗性的引物序列及其鉴定方法，建立了通过设计引物序列进行pcr扩增来鉴定草莓炭疽病抗性的分子鉴定技术。中国发明专利(cn103060422b)公开了一种室内鉴定草莓是否抗炭疽病的方法，通过室内离体草莓匍匐茎浸入法来鉴定草莓炭疽病抗性。但关于叶柄切面涂菌鉴定草莓炭疽病抗性的方法尚未见报道。点滴接种和菌片接种的接种对象是叶片，点滴接种菌悬液滴易风干、发病不稳定；菌片接种中，菌片上残存培养基容易腐生其它病菌影响试验结果。喷雾接种，其发病主要是由炭疽菌孢子通过叶片气孔侵入，而有的草莓品种叶片发病显著但病菌并不向根茎部传播，植株死苗率也较低，这对喷雾接种法鉴定的准确性有影响。离体匍匐茎浸入法，由于脱离了活体植株，草莓品种因炭疽菌侵染逆境被诱发的自身防御系统——主动抗性无法体现，影响了鉴定准确性。引物扩增分子鉴定法，需要特定的分子生物学仪器设备，需要操作人员掌握一定的分子生物学技术，方法操作有一定难度。
技术实现要素：
本发明的目的是在于提供了一种叶柄切面涂菌鉴定草莓炭疽病抗性的方法，技术鉴定准确性稳定性好，鉴定成本低，方法易行，操作简单，易掌握，炭疽菌沿叶柄切面伤口侵入比通过叶片气孔侵入到达植株根茎部要容易和快速，不同草莓品种对从叶柄切面伤口侵入的炭疽菌的反应更灵敏，叶柄切面涂菌法对不同草莓品种炭疽病抗性的分级更准确。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：
一种叶柄切面涂菌鉴定草莓炭疽病抗性的方法，其步骤是:
a、接种植株准备：将5-7叶的待鉴定草莓植株10-20株分钵种植，在温度20-30℃、1000-1500lx、15－17h/d的光照条件下培养备用。
b、炭疽菌孢子液的制备：将培养的炭疽菌孢子用无菌水悬浮，滤去菌丝后制成0.5-2.0×106个/ml的孢子液。
c、叶柄切面涂菌：在草莓植株倒3叶或倒4叶叶柄上部剪去叶片，用镊子夹住吸有炭疽菌孢子液的小棉球在叶柄切面涂抹，保鲜膜包住叶柄切面固定2天；薄膜覆盖，80％以上的湿度保湿2-3天，利于炭疽菌孢子从叶柄侵入发病。
d、草莓炭疽病抗性评价：7-10天后按植株叶柄发病程度和植株死亡率评价草莓种质资源的炭疽病抗性。
所述的叶柄切面应保持平整，切面凹凸差异不超过0.5mm。
本发明的基于叶柄是衡量草莓炭疽病抗性的主要组织器官是创造性思想，利用本方法可将草莓品种红颜、丰香、晶玉、甜查理对炭疽病的抗性分别划分为：s、ms、mr、r，与生产实际高度吻合。本发明在室内室外均可进行鉴定，所需植株少，方法简单易行，对草莓抗炭疽病种质资源的筛选和抗性评价具有重要意义。
从田间生产观察到，有些抗炭疽病能力较强的草莓品种，如甜查理，叶片上可以感染诸多炭疽病病斑，但叶柄上病斑较少，植株死苗率也很低；而抗炭疽病能力较弱的草莓品种，如红颜，无论叶片上是否有病斑，只要叶柄上出现较大的病斑，植株一般都会发蔫直至逐步死亡。由此可以得出，草莓品种资源的炭疽病抗性水平与其叶柄对炭疽病的抗性水平密切相关。另外，伤口是炭疽病侵染的重要途径之一。基于此，通过实验研究，本发明提出叶柄切面涂菌鉴定草莓炭疽病抗性的方法。如表1所示。
表1本发明与现有技术的比较表
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
本发明在室内室外均可进行鉴定，所需植株少，10株即可,鉴定成本较低。不同草莓品种对从叶柄切面伤口侵入的炭疽菌反应灵敏，一般7天即有症状；炭疽菌沿叶柄切面伤口侵入比通过叶片气孔侵入到达植株根茎部要容易和快速，叶柄切面涂菌法对不同草莓品种炭疽病抗性的分级准确，红颜、甜查理、丰香3个品种3次抗性重复试验均分别归为s、r、ms类型，技术鉴定准确性稳定性好。操作流程上，在制备好孢子液后，通过剪去叶片在叶柄上形成伤口，用吸有炭疽菌孢子液的小棉球在叶柄切面涂抹即可，方法操作简单、易掌握，鉴定成本较低，对草莓抗炭疽病种质资源的筛选和抗性评价具有重要意义。
具体实施方式
实施例1:
一种叶柄切面涂菌鉴定草莓炭疽病抗性的方法，其步骤是:
a、接种植株准备：将5或6或7叶的红颜、晶瑶、晶玉、章姬、甜查理、丰香、三公主、四公主、宁丰、越丽草莓植株10或15或20株分钵种植，在20或25或30℃、1000-1500lx、16h/d的光照条件下培养，获得生长一致的待鉴定草莓植株，备用。
b、炭疽菌孢子液的制备：将培养的炭疽菌孢子用无菌水悬浮，滤去菌丝后制成0.5×106或1.0×106或2.0×106个/ml的孢子液。
c、叶柄切面涂菌：在草莓植株倒3叶或倒4叶叶柄上部剪去叶片，用镊子夹住吸有炭疽菌孢子液的小棉球在叶柄切面涂抹，保鲜膜包住叶柄切面固定2天；薄膜覆盖，80％以上的湿度保湿2或3天。让炭疽菌在合适的生长扩繁条件下通过叶柄伤口侵入并向植株根茎部传播，及时观察不同草莓品种对接种炭疽菌的应答反应。
d、草莓炭疽病抗性评价：7或8或9或10天后按植株叶柄发病程度和植株死亡率评价草莓种质资源的炭疽病抗性。
通过上述技术措施，使本发明鉴定的成本较低，方法操作简单，易掌握，方法准确性、稳定性更好，可以在短时间内快速的鉴定多种草莓种质资源的炭疽病抗性，适用于草莓抗炭疽病种质资源的筛选和抗性评价。
草莓炭疽病发病率和病情指数的技术方法如下：
发病率(dr)(％)＝发病株数/调查株数×100％；
病情指数(di)＝[(各级发病株数×病级数)/(最高发病级数×调查株数)]×100
叶柄病情分级标准：
0级：无病；
1级：病部出现浅红色和褪色晕圈，或红褐色斑点，病斑长度＜3.0mm；
2级：病斑扩大呈梭形，黑褐色凹陷，病斑长度在3.0～10.0mm；
3级：典型的纺锤形病斑，病斑的长度在11.0～20.0mm，环绕叶柄或匍匐茎；
4级：叶柄变黑，干缩，病斑长度＞20.0mm，或整个叶柄干枯变黑坏死；
5级：根茎全部坏死，植株死亡。
品种群体抗病性划分标准di＝0:免疫(i)；0<di≤10:高抗(hr)；10<di≤20:抗(r)；20<di≤40:中抗(mr)；40<di≤60:中感(ms)；60<di≤80:感(s)；80<di≤100:高感(hs)。
通过上述实施例获得如下结果：红颜、晶瑶、晶玉、章姬、甜查理、丰香、三公主、四公主、宁丰、越丽10个草莓品种的炭疽病发病率依次为：100.0％、90.0％、70.0％、95.0％、35.0％、83.3％、70.0％、72.2％、68.4％、90.9％；红颜、晶瑶、晶玉、章姬、甜查理、丰香、三公主、四公主、宁丰、越丽10个草莓品种的炭疽病病情指数依次为：78.4、69.5、31.6、77.3、16.2、52.8、35.2、33.9、36.7、72.5；红颜、晶瑶、晶玉、章姬、甜查理、丰香、三公主、四公主、宁丰、越丽10个草莓品种的炭疽病抗性评价结果分别为：s、s、mr、s、r、ms、mr、mr、mr、s。本方法的炭疽病抗性鉴定结果表明，红颜、晶瑶为感炭疽病品种，甜查理为抗炭疽病品种，与生产实际基本吻合。不同草莓品种的抗性评价汇总结果如表2所示。
表2不同草莓品种抗性评价结果
上例所述仅为本发明的较佳实施例而非限制，凡依本发明的技术构思所作的改进或等效替换，均属本发明权利要求保护的范围。