白菜持绿性基因Brnye1及其分子标记与应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，尤其涉及白菜持绿性基因brnye1及其分子标记与应用。

背景技术：

持绿性是指植株衰老后，叶片仍保持绿色而不变黄的性状，对于以叶片为产品器官的白菜具有特殊重要的意义。

持绿在自然界中普遍存在，在作物中具体表现为，在干旱、高温等环境条件下，作物在籽粒灌浆期或生育晚期，其叶片能够保持较长时间的绿色并且能够进行光合作用；在一些模式植物中，持绿主要表现为叶片光合功能丧失，叶片中的叶绿素不降解或者降解过程受阻，植物的叶片、果皮、果荚、种皮等部位表现持绿。持绿突变体是研究叶绿素代谢、植物衰老进程、植物应对激素响应、植物抗逆性(抗旱,盐胁迫,耐高温等)等一系列生理代谢过程的理想材料(田风霞等,2010)。对农作物中的功能性持绿突变体进行研究，有助于发现和鉴定一些抗性(抗旱,抗高温和抗病等)新品种，可以丰富作物抗逆基因资源，对于作物遗传育种和品种改良具有重要意义。研究模式植物中非功能性持绿突变体的持绿机理，可以发现参与叶绿素分解代谢过程的新酶及相关酶的催化特性，同时有助于揭示叶绿素降解新途径。

目前，有研究获得具有持绿性的白菜育种材料，由于该材料的持绿性状在生育后期植株衰老时才表现，开发与该持绿性状紧密连锁的分子标记，对于实现在苗期进行鉴定选择有重要意义。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供indel片段的应用。

本发明提供了indel片段在检测或辅助检测待测白菜的持绿表型中的应用；

或indel片段在检测或辅助检测待测白菜是否为持绿白菜中的应用；

所述indel片段为如下1)或2)或3)：

1)核苷酸序列为序列1的dna分子；

2)与1)所示的dna分子同源性大于95％、98％或99％的dna分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的dna序列杂交且编码具有相同功能多肽的dna分子。

本发明另一个目的是提供一种检测待测白菜是否为持绿白菜的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测白菜两条同源染色体的基因组中是否均含有indel片段,若所述待测白菜两条同源染色体的基因组中均含有indel片段，则所述待测白菜为候选为持绿白菜，若所述待测白菜两条同源染色体的基因组中不是均含有indel片段，则所述待测白菜为或候选为非持绿白菜；

所述indel片段为如下1)或2)或3)：

1)核苷酸序列为序列1的dna分子；

2)与1)所示的dna分子同源性大于95％、98％或99％的dna分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的dna序列杂交且编码具有相同功能多肽的dna分子。

上述方法中，所述检测待测白菜两条同源染色体的基因组中是否均含有indel片段的方法为如下1)或2)：

1)直接测序；

2)用扩增所述indel片段的引物对扩增，电泳检测扩增产物，若pcr扩增产物仅含有465-475bp(实施例为471bp)的产物，则待测白菜两条同源染色体的基因组中均含有indel片段，若不是仅含有465-475bp的产物，则待测白菜两条同源染色体的基因组中不均含有indel片段。

上述方法中，所述引物对由序列表中序列2所示的单链dna分子和序列表中序列3所述的单链dna分子组成。

本发明第3个目的是提供一种选育持绿表型白菜的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：培育两条同源染色体的基因组中均含有indel片段的白菜，得到持绿表型白菜；

本发明第4个目的是提供本发明提供了一种选育非持绿表型白菜的方法。

本发明提供的一种选育非持绿表型白菜的方法，包括如下步骤：培育两条同源染色体的基因组中不均含有indel片段的白菜，得到非持绿表型白菜。

本分目的5个目的是提供一种dna片段。

本发明提供的dna片段，为如下1)或2)或3)：

1)核苷酸序列为序列1的dna分子；

2)与1)所示的dna分子同源性大于95％、98％或99％的dna分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的dna序列杂交且编码具有相同功能多肽的dna分子；

本发明第6个目的是提供检测待测白菜两条同源染色体的基因组中是否含有indel片段的物质的用途。

本发明提供了检测待测白菜两条同源染色体的基因组中是否含有indel片段的物质在检测待测白菜是否为持绿白菜中的应用。

上述应用中，所述检测待测白菜两条同源染色体的基因组中是否含有indel片段的物质为所述扩增所述indel片段的引物对或含有所述引物对的pcr试剂或试剂盒。

本发明第7个目的是提供一种检测待测白菜是否为持绿白菜的产品。

本发明提供的产品，为检测待测白菜两条同源染色体的基因组中是否含有indel片段的物质。

上述产品中，所述物质为引物对或含有引物对的试剂或含有引物对的试剂盒；

所述引物对由序列表中序列2所示的单链dna分子和序列表中序列3所述的单链dna分子组成。

本发明第8个目的是提供一种检测待测白菜是否为持绿白菜的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述物质对所述待测白菜的基因组dna进行pcr扩增，检测pcr扩增产物，若pcr扩增产物仅含有465-475bp的产物，则所述待测白菜为候选为持绿白菜，若pcr扩增产物不是仅含有465-475bp的产物，则所述待测白菜为或候选为非持绿白菜。

上述中，所述待测白菜为持绿表型亲本或非持绿表型亲本或者二者杂交后代。

含持绿基因brnye1的白菜自交系‘13a516’于2017年4月26日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌株保藏编号为cgmccno.13795，分类命名为brassicacampestrisspp.pekinensis.

本发明的实验证明，本发明发现了位于编码白菜不黄化蛋白基因brnye1/bra019346的外显子区内存在的1个与白菜持绿性连锁的indel标记，通过对该共显性pcr特异性引物的扩增，可得到变异位点的序列信息，鉴定材料持绿与否以及纯合与否，可用于持绿性育种材料的辅助选择。该indel分子标记在白菜持绿性状鉴别上具有较重要的使用价值，可有效运用于白菜分子辅助选择育种。目前由于持绿性状在白菜生育后期才有明显表现，表型观察判断费工费时，该indel分子标记及其检测方法替代生育末期以表型观察判断的方法，使得筛选可以在苗期和室内进行，可用于大规模筛选育种材料，加快育种进程。

附图说明

图1为持绿基因brnye1初步定位结果。

图2为持绿基因brnye1/bra019346在持绿性和非持绿性材料中基因表达结果。

图3为持绿性材料和非持绿性材料pcr扩增序列比对及indel标记；

其中，bra019346为大白菜数据库参考基因序列；13a516为持绿亲本基因序列；13a510为非持绿亲本基因序列。

图4为indelgfl在亲本及f2代个体上的扩增结果；

其中，p1:非持绿亲本自交系13a510

p2:持绿亲本自交系13a516

m：为d2000dnamaker，共有6条条带，大小依次为2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp，扩增产物对应的条带为431bp，471bp。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、白菜持绿性基因brnye1及其indel标记的获得

一、分离群体的构建及遗传分析

含持绿基因brnye1的白菜自交系‘13a516’于2017年4月26日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌株保藏编号为cgmccno.13795，分类命名为brassicacampestrisspp.pekinensis.

以含持绿基因brnye1的白菜自交系‘13a516’为母本，非持绿白菜自交系‘13a510’(日本武藏野公司品种华冠)为父本杂交得到f1，即为正交，再配制反交组合，即‘13a510’ב13a516’，植株全部种植于沈阳农业大学遗传育种温室基地。正反交所得f1代植株表型全部为非持绿。表明其持绿性状受隐性核基因控制。选择正交得到的5株f1植株自交构建f2代作图群体，并分别与父母本进行回交，经调查f2代及回交群体表型，发现73株f1ב13a510’后代均表现为非持绿性状，而f1ב13a516’后代中，47株表现为非持绿，42株表现为持绿，分离比例符合孟德尔1:1分离比率(χ2＝0.18<χ20.05＝3.84)。播种正交f1代自交后的f2代作图群体数为14870株，在播种的全部f2群体中，非持绿8964株，3058表现为持绿，符合孟德尔3:1分离比(χ2＝1.13<χ20.05＝3.84)。由此，得出结论：持绿突变性状是由一对隐性核基因控制。采用bsa-seq技术，即bsa分池结合测序(sequencing)进行定位。在f2代作图群体中选择持绿与非持绿典型极端表型的植株各25株，建立持绿与非持绿混池。剩余1000株表现典型的母本持绿表型的植株用于连锁分析。

二、dna的提取及极端混池的构建

1、dna的提取

a.称取0.2g白菜持绿与非持绿材料的幼嫩叶片加入灭菌处理的2.0ml离心管中，放入液氮速冻，同时用研磨棒研磨叶片至粉末；

b.立即向上述粉末中加入700ulctab裂解液(30g/lctab，100mmol/ltris-hcl，20mmol/ledta，1.4mol/lnacl，)以及14ulβ-巯基乙醇，充分摇匀，放入65℃水浴锅中一小时，期间每隔20分钟，反转摇匀一次；

c.取出离心管，冷却至室温后再加入与ctab等体积的700ul体积比为24:1的氯仿：异戊醇，充分颠倒摇晃3分钟，约300下；

d.常温离心(21-24℃)，12000rpm，5分钟；

e.事先先把无水乙醇放到-20℃冰箱里；

f.吸取450ul上清液入新的1.5ml已灭菌的离心管，加入2倍体积预先-20℃冷冻的无水乙醇，充分混匀，于-20℃静置0.5-1小时或-80℃静置8-10分钟；

g.常温离心，12000rpm离心10分钟；

h.弃上清液，加入1ml70％乙醇(700ul无水乙醇+300ul灭菌超纯水)；

i.常温离心，12000rpm离心1分钟；

j.弃上清，室温放置至完全晾干；

k.加入50ul，1倍te溶解或用100ul灭菌超纯水溶解，短暂离心收集。

2.dna浓度的检测

(1).称取0.2g琼脂糖，量取2ml10×tbe(硼酸缓冲液)，18ml蒸馏水，于三角瓶中混匀。

(2).用封口膜封口，于微波炉中加热30秒，充分溶解。

(3).在充分溶解并降温至50℃后的混合液中加入1ul1mg/ml的eb。

(4).将混合液倒入胶盒中，插好梳子，赶走气泡，静置室温凝结。

(5).取1ul10×loadingbuffer指示剂，与9uldna样混合，将混合液点入琼脂糖凝胶胶孔中。

(6).120v电压电泳20分钟，带的走向是负极向正极。

(7).取1uldna原液用酶标仪(thermo，germany)测定浓度及od260/od280，od260/od280比值小于1.8或大于2.0的进行重新纯化，将纯化后的dna稀释到50ng/μl，-20℃保存备用。

3.混池的构建

选择f2代中具有持绿极端表型的25份dna，各等量吸取1μl于已灭菌的新1.5离心管中，吸打混匀，短暂离心收集，构建持绿混池；等量吸取1μl非持绿极端表型的25份dna构建非持绿混池。

三、brnye1基因的初步定位

采用bsa分池结合测序(bsa-seq)的方法，对持绿、非持绿亲本以及如前所述的两极端混池进行测序，所得reads经质控比对后，经snp-index进行划窗分析，将brnye1基因初步定位与白菜第3号染色体23m-26mb范围内(如图1所示)。

四、分子标记的获得

根据bsa-seq初步定位及精细定位结果，定位区间内，brnye1候选基因bra019346功能注释信息为拟南芥叶绿体不黄化基因atnye1，atnye1是拟南芥持绿性状的决定基因；此外，brnye1候选基因bra019346在持绿材料与非持绿材料中的基因表达水平存在显著差异(如图2所示)，以上结果表明，brnye1基因为白菜持绿性状的决定基因。

利用持绿与非持绿亲本材料在定位区间的重测序信息，结合brassica_database(http://brassicadb.org)参考基因序列对该区间进行比对，发现定位区间内3号染色体一处indel与持绿性状连锁。比较非持绿材料中该位点序列，在持绿材料中该位点有40bp的序列插入(如图3所示)。由此获得与持绿性状完全符合的indel片段，该片段的核苷酸序列为序列1(40bp的序列gagaaatagctgcttcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa)。

自brassica_database(http://brassicadb.org)下载序列，利用primer5.0软件，针对上述indel位点设计与白菜持绿基因brnye1连锁的indel分子标记indelgfl，indelgflf：5’-agccttcaacacctgacaat-3’(上游引物序列2)。

indelgflr：5’-tccaccaacgctccca-3’(下游引物序列3)。该分子标记的扩增产物的为431bp(序列4)或471bp(序列5)，二者仅差序列1所示的40bp片段。

上述引物由苏州金维智生物科技有限公司合成。

分子标记扩增产物仅为471bp，基因型记做b基因型(2条同源染色体均含有indel片段)，表型为持绿；

分子标记的扩增产物仅为431bp，基因型记做a基因型(同源染色体均不含有indel片段)，表型为非持绿；

分子标记扩增产物为431bp和471bp，基因型记做h基因型(1条同源染色体含有indel片段，且另一条不含有indel片段)，表型为非持绿。

五、分子标记鉴定白菜是否持绿表型的方法

为了验证分子标记的可靠性，对父本13a510，母本13a516及二者杂交得到f1代的自交后代f2代150株(已经鉴定出是否为持绿株系)个体进行了检测，检查indelgfl分子标记的两种基因型(a代表母本带型，持绿基因纯合型，b代表父本非持绿基因纯合型，h代表杂合基因型)在150个f2群体中的分布情况。

1、基因组dna的提取

提取待测样本：父本、母本及f2代150株的基因组dna。

2、pcr扩增

以上述各株基因组dna为模板，用上述四获得的分子标记indelgfl中的indelgflf和indelgflr进行pcr扩增，扩增条件和体系如下：

a.反应体系：10μl体系，各组分物质的含量分别为：25ng基因组dna；0.5μmolindelgflf0.5μl；0.5μmolindelgflr0.5μl；2.5mmdntp0.8μl；10×pcrbuffer1μl；taqdnapolymerase0.5u；ddh2o补至10μl，吸打混匀，离心；

b.扩增程序：预变性95℃/5min；95℃/30s；56℃/30s；72℃/1min；35个循环后；72℃延伸5min；最后4℃保存。

3、电泳检测扩增产物

将10ul上述pcr扩增产物与5ul的溴酚兰变性buffer(980ml/lformamide，3.72g/ledta，2.5g/lbromphenolblue，2.5g/lxylenecyanol)混匀，95℃变性5min，7ul上样量点入5％变性聚丙烯酰胺凝胶中，在2000v，75w条件下电泳1h20min，电泳结束后，进行银染。经银染后读带判断。其中，银染包括：①固定，1l蒸馏水+100ml无水乙醇+5ml冰醋酸混合液中固定7min；②染色，1l蒸馏水+2g硝酸银+2ml甲醛混合液中染色10min；③漂洗，用1l蒸馏水漂洗3-4秒；④显影，最后于1l蒸馏水+15g氢氧化钠+2ml甲醛中显影10min。

部分电泳结果如图4所示。

统计结果如表1所示，可以看出，

35份待测样本pcr扩增产物大小为471bp,为b基因型，2条同源染色体均含有indel片段，其中32份为持绿表型，3份为非持绿表型，鉴定表型准确率为91％；

85份待测样本pcr扩增产物大小为431bp,为a基因型，2条同源染色体均不含有indel片段，均为非持绿表型，鉴定表型准确率为100％；

30份待测样本pcr扩增产物大小为431bp和471bp,为h基因型，1条同源染色体含有indel片段，另一条同源染色体不含有indel片段，均为非持绿表型，鉴定表型准确率为100％。

上述结果表明，该indelgfl分子标记或其对应的indel片段可用于辅助检测待测白菜是否为持绿株系，检测方法如下：

检测待测白菜两条同源染色体的基因组中是否均含有indel片段(序列1),若两条同源染色体的基因组中均含有indel片段，则待测白菜为候选为持绿白菜，若两条同源染色体的基因组中不是均含有indel片段，则待测白菜为或候选为非持绿白菜。

检测待测白菜两条同源染色体的基因组中是否均含有indel片段(序列1)的方法为用indelgfl分子标记扩增待测白菜的基因组dna，若pcr扩增产物仅含有471bp的产物(序列5)，则待测白菜两条同源染色体的基因组中均含有indel片段，若pcr扩增产物不是仅含有471bp的产物，则待测白菜两条同源染色体的基因组中不均含有indel片段。

表1为indelgfl在f2群体中的鉴定和验证

实施例2、白菜持绿性基因brnye1的indel片段在辅助选择中的应用

1、基因组dna的提取

按照实施例1的五的1方法提取部分f2代单株基因组dna。

2、pcr扩增

按照实施例1的五的2方法用indel标记中的indelgflf和indelgflr对基因组dna进行pcr扩增。

3、电泳检测扩增产物

按照实施例1的五的3方法对上述pcr扩增产物进行电泳检测。

若pcr扩增产物中仅含有471bp的扩增产物，则两条同源染色体均含有indel片段，则待测样本为或候选为持绿白菜，若pcr扩增产物中不仅含有471bp的扩增产物，则两条同源染色体不是均含有indel片段，则待测样本为或候选为非持绿白菜；

结果如表2所示，

表2

上述结果表明，该indel标记可有效运用于白菜分子辅助选择育种。

序列表

<110>沈阳农业大学

<120>白菜持绿性基因brnye1及其分子标记与应用

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gagaaatagctgcttcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa40

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

agccttcaacacctgacaat20

<210>3

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

tccaccaacgctccca16

<210>4

<211>431

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

agccttcaacacctgacaattaacattttgtaatgaaaccaagaaacaaataaataatta60

ttttattttttacttacaacaggtagttctttggaaaagatgtagtatcgtaactttggg120

aagagatctaagaggaaatggccaccgctaatgtggcagtggacgtgaagagacatgtcc180

cctttcactttcttccattctgctaccacttcatctctgtatagcctatttgcccatcct240

tccaactataatataacataaatctatacacatcagcctctatattttctaaaaccgttc300

ttcagtggcactcagaaacgtatagacgcatacatacctgagagttgttaatagagtgag360

aaatagctaaggttagtttagctgtaatgtcactgtgagtgagagtatacgttcttggga420

gcgttggtgga431

<210>5

<211>471

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

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