本发明涉及生物制剂的技术领域，涉及一种酶法提取铁皮石斛多糖的方法。
背景技术
植物多糖具有免疫调节、抗肿瘤等生物活性，已受到广泛关注。铁皮石斛(dendrobiumofficinalekimuraetmigo)为兰科石斛属多年生附生草本植物的干燥茎，是一种名贵的中药材植物，其性味甘，微寒，归胃、肾经，有益胃生津，滋阴清热的功效，用于热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨痿软。多糖是石斛属植物的最主要组成成分，其生理活性的强弱与多糖含量有一定关系。传统认为质重、嚼之粘牙、味甘、无渣者为优品，其多糖含量也较高。铁皮石斛多糖具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫等药理活性。
目前已报道铁皮石斛的提取方法主要有水提醇沉法、酶解法、超声辅助法、微波辅助法等。传统的水提醇沉法存在能耗高，多糖转移率低，杂质含量高等缺点，超声辅助法及微波辅助法对设备的要求高。酶法主要采用单一纤维素酶或者纤维素酶、果胶酶以及蛋白酶组成的复合酶，此法具有条件温和、杂质易除和提高率等优点。“一种石斛多糖的分离纯化方法”(申请号：201110365323.7)采用微波提取与纤维素酶相结合的方法，设备要求高，且工艺中存在有机试剂除蛋白的过程；“一种铁皮石斛多糖的纯化方法”(申请号：201510237026.2)采用淀粉酶除去淀粉杂质，没有除去多糖中结合的蛋白质杂质，多糖得率仅大于55%。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种酶法提取铁皮石斛多糖的方法，该方法能显著提高铁皮石斛多糖的转移率，降低蛋白质含量，除去淀粉杂质，条件温和，操作简便、耗能低。
我们前期研究发现水提醇沉法提取的铁皮石斛多糖中糖含量占绝大部分，还有小部分的淀粉及蛋白质杂质，有效除去多糖中的淀粉及蛋白质，是提高多糖纯度的关键。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种酶法提取铁皮石斛多糖的方法，包括以下步骤：
(1)将干燥的铁皮石斛粉碎后过40～100目筛，得到铁皮石斛粉末；
(2)称取铁皮石斛粉末，加入15～30倍重量的纯化水，搅拌均匀，然后升温至40～60℃；
(3)向上述提取体系中分别加入木瓜蛋白酶、中温α-淀粉酶，搅拌均匀，继续在40～60℃下酶解2～5h；
(4)将上述提取体系加热升温至90～100℃，并保温5～15min，使加入的酶制剂变性失活；
(5)待温度降至室温，2000～5000rpm离心10～20min，上清液即为铁皮石斛石斛多糖提取液；
(6)上述铁皮石斛多糖提取液过阴离子交换树脂柱进行脱色；
(7)脱色后的铁皮石斛多糖提取液减压浓缩至每1ml相当于含生药0.1～1.0g的浓缩液；
(8)向上述浓缩液中加入95%乙醇或无水乙醇，使乙醇浓度达到80%，在温度2～5℃下醇沉过夜；
(9)将上述乙醇沉淀液进行离心，沉淀物用80%乙醇洗涤3次，冷冻干燥至含水量小于5%，得到铁皮石斛多糖。
优选的，步骤(3)木瓜蛋白酶的添加量为10～50u/g，中温α-淀粉酶的添加量为50～200u/g。
优选的，步骤(3)中最佳酶解温度为50℃下，最佳酶解时间为酶解3h。
优选的，步骤(6)所述阴离子交换树脂柱为d941或d900大孔树脂柱，径高比为1:4～1:8，上样量为8个柱床体积，上样流速为2～5ml/min，上样完毕以1个柱床体积的纯化水洗脱，合并过柱液及洗脱液。
优选的，步骤(7)浓缩到每1ml含生药0.2g时最佳。
采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量，按下式计算多糖转移率，多糖中蛋白质的含量采用马斯亮蓝法测定，双波长比色法测定淀粉含量，结果采用该方法所得多糖的转移率为88.56%，蛋白质含量为1.92%，未检出淀粉。
多糖转移率=(铁皮石斛多糖样品中多糖的质量/投料的铁皮石斛药材中总多糖的质量)×100%
本发明制得的铁皮石斛多糖可以添加到保健食品或药品中，用于增强免疫力。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下优点：
1.在低温条件下，采用复合酶解的方法提取铁皮石斛多糖的方法，保持多糖的活性，多糖的转移率提高到大于87%，蛋白质含量小于2%，除去淀粉杂质；
2.采用阴离子交换树脂柱进行脱色，避免常规活性炭脱色产生的二次污染；
3.条件温和，避免毒性有机试剂的使用，操作方便，成本低，适于工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
本实施例的酶法提取铁皮石斛多糖的方法，包括以下步骤：
(1)将干燥的铁皮石斛粉碎后过40目筛，得到铁皮石斛粉末；
(2)称取铁皮石斛粉末100g，加入15倍量的纯化水，搅拌均匀，然后升温至40℃；
(3)向上述提取体系中分别加入10u/g的木瓜蛋白酶、50u/g的中温α-淀粉酶，搅拌均匀，继续在40℃下酶解2h；
(4)将上述提取体系加热升温至90℃，并保温5min，使加入的酶制剂变性失活；
(5)待温度降至室温，2000rpm离心10min，上清液即为铁皮石斛石斛多糖提取液；
(6)上述铁皮石斛多糖提取液过d900阴离子交换树脂柱进行脱色，径高比为1:4，上样量为8个柱床体积，上样流速为2ml/min，上样完毕以1个柱床体积的纯化水洗脱，合并过柱液及洗脱液；
(7)脱色后的铁皮石斛多糖提取液减压浓缩至每1ml相当于含生药0.1g；
(8)向上述浓缩液中加入95%乙醇，使乙醇浓度达到80%，在温度2℃下醇沉过夜；
(9)将上述乙醇沉淀液进行离心，沉淀物用80%乙醇洗涤3次，冷冻干燥至含水量小于5%，得到铁皮石斛多糖；
(10)采用苯酚-硫酸法测定上述方法所得多糖的转移率为88.23%，考马斯亮蓝法测定多糖中蛋白质的含量为1.73%，双波长比色法测定未检出淀粉。
实施例2
本实施例的酶法提取铁皮石斛多糖的方法，包括以下步骤：
(1)将干燥的铁皮石斛粉碎后过100目筛，得到铁皮石斛粉末；
(2)称取铁皮石斛粉末100g，加入30倍量的纯化水，搅拌均匀，然后升温至60℃；
(3)向上述提取体系中分别加入50u/g的木瓜蛋白酶、200u/g的中温α-淀粉酶，搅拌均匀，继续在60℃下酶解5h；
(4)将上述提取体系加热升温至100℃，并保温15min，使加入的酶制剂变性失活；
(5)待温度降至室温，5000rpm离心20min，上清液即为铁皮石斛石斛多糖提取液；
(6)上述铁皮石斛多糖提取液过d941阴离子交换树脂柱进行脱色，径高比为1:8，上样量为8个柱床体积，上样流速为5ml/min，上样完毕以1个柱床体积的纯化水洗脱，合并过柱液及洗脱液；
(7)脱色后的铁皮石斛多糖提取液减压浓缩至每1ml相当于含生药1.0g；
(8)向上述浓缩液中加入无水乙醇，使乙醇浓度达到80%，在温度5℃下醇沉过夜；
(9)将上述乙醇沉淀液进行离心，沉淀物用80%乙醇洗涤3次，冷冻干燥至含水量小于5%，得到铁皮石斛多糖；
(10)采用苯酚-硫酸法测定上述方法所得多糖的转移率为89.78%，考马斯亮蓝法测定多糖中蛋白质的含量为1.63%，双波长比色法测定未检出淀粉。
实施例3
本实施例的酶法提取铁皮石斛多糖的方法，包括以下步骤：
(1)将干燥的铁皮石斛粉碎后过50目筛，得到铁皮石斛粉末；
(2)称取铁皮石斛粉末100g，加入25倍量的纯化水，搅拌均匀，然后升温至50℃；
(3)向上述提取体系中分别加入50u/g的木瓜蛋白酶、100u/g的中温α-淀粉酶，搅拌均匀，继续在50℃下酶解3h；
(4)将上述提取体系加热升温至100℃，并保温10min，使加入的酶制剂变性失活；
(5)待温度降至室温，4000rpm离心15min，上清液即为铁皮石斛石斛多糖提取液；
(6)上述铁皮石斛多糖提取液过d941阴离子交换树脂柱进行脱色，径高比为1:5，上样量为8个柱床体积，上样流速为4ml/min，上样完毕以1个柱床体积的纯化水洗脱，合并过柱液及洗脱液；
(7)脱色后的铁皮石斛多糖提取液减压浓缩至每1ml相当于含生药0.2g；
(8)向上述浓缩液中加入无水乙醇，使乙醇浓度达到80%，在温度4℃下醇沉过夜；
(9)将上述乙醇沉淀液进行离心，沉淀物用80%乙醇洗涤3次，冷冻干燥至含水量小于5%，得到铁皮石斛多糖；
(10)采用苯酚-硫酸法测定上述方法所得多糖的转移率为88.23%，考马斯亮蓝法测定多糖中蛋白质的含量为1.81%，双波长比色法测定未检出淀粉。
实施例4
本实施例的酶法提取铁皮石斛多糖的方法，包括以下步骤：
(1)将干燥的铁皮石斛粉碎后过60目筛，得到铁皮石斛粉末；
(2)称取铁皮石斛粉末100g，加入25倍量的纯化水，搅拌均匀，然后升温至55℃；
(3)向上述提取体系中分别加入50u/g的木瓜蛋白酶、150u/g的中温α-淀粉酶，搅拌均匀，继续在55℃下酶解4h；
(4)将上述提取体系加热升温至95℃，并保温15min，使加入的酶制剂变性失活；
(5)待温度降至室温，4000rpm离心10min，上清液即为铁皮石斛石斛多糖提取液；
(6)上述铁皮石斛多糖提取液过d900阴离子交换树脂柱进行脱色，径高比为1:6，上样量为8个柱床体积，上样流速为3ml/min，上样完毕以1个柱床体积的纯化水洗脱，合并过柱液及洗脱液；
(7)脱色后的铁皮石斛多糖提取液减压浓缩至每1ml相当于含生药0.4g；
(8)向上述浓缩液中加入95%乙醇，使乙醇浓度达到80%，在温度4℃下醇沉过夜；
(9)将上述乙醇沉淀液进行离心，沉淀物用80%乙醇洗涤3次，冷冻干燥至含水量小于5%，得到铁皮石斛多糖；
(10)采用苯酚-硫酸法测定上述方法所得多糖的转移率为87.17%，考马斯亮蓝法测定多糖中蛋白质的含量为1.64%，双波长比色法测定未检出淀粉。
本发明在温和的条件下，采用木瓜蛋白酶与中温α-淀粉酶提取铁皮石斛多糖，可显著提高多糖的转移率，减低多糖中淀粉及蛋白质杂质含量，提取条件温和，没有毒性有机试剂的使用，操作方便，易于产业化生产。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，不能依此限定本发明实施的范围，依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。