本发明涉及生物技术和医学
技术领域：
，尤其是涉及一种ns1蛋白的结合蛋白。
背景技术：
登革热(denguefever,df)是由4个血清型病毒(denv-1、denv-2、denv-3、denv-4)引起的急性蚊媒传染病，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播。df是分布最广，发病最多，危害较大的一种虫媒病毒性疾病，广泛流行于全球热带和亚热带的非洲、美洲、东南亚和西太平洋地区的100多个国家和地区。在临床上，df是一种严重的流感样的疾病。主要表现为起病突然、高热、剧烈头痛、眼眶后痛、肌肉和关节痛，可伴有皮疹、淋巴腺肿和白血球减少，可波及所有人群，但症状可因病人的年龄不同而不同。一般将这种病型称为古典登革热，此类型传播迅速，可引起较大规模的流行。在登革热流行期，易感人群的罹患率通常为40％-50％，可高达80％-90％，但病死率很低。登革热出血热是以高热、出血、肝大，严重病例循环衰竭为特征，病死率高，是较为严重的一种临床类型。伴有休克综合症的称为登革休克综合症。登革热没有特效的治疗方法。如果没有适应的治疗，登革出血热的病死率可超过20％，经过有效的支持疗法，病死率可低于1％。登革热诊断要点：1)流行病学资料，发病关15天的活动情况，有否去过流行区，蚊虫叮咬历；2)临床特征，突然起病，发热，“三痛三红”，皮诊；3)实验室检查，白细胞、血小板下降；检测血清特性igm阳性；恢复期igg比急性期有4倍增长；分离到病毒或特异性抗原。临床上用于登革病毒的检测方法有病毒培养、血清学检测、病毒核酸检测等。病毒分离所需时间较长，达不到快速诊断的目的，而常规的血清学诊断又因存在广泛的交叉反应而受到干扰。胶体金标记的免疫层析方法具有快速、简便、不需要依赖重要装备、能够实现现场检测等特点，成为目前传染病快速诊断中研究的热点。ns1蛋白是登革病毒非结构蛋白中唯一的糖蛋白，抗原性极强且不引发ade，所以作为胶体金检测的靶标。而胶体金检测需要针对ns1蛋白的特异性单克隆抗体，传统临床用的都是鼠源性的单克隆抗体。长期以来，鼠单克隆抗体被广泛的应用于科研、临床诊断和治疗。但由于杂交瘤方式生产采用小鼠腹腔诱生，受小鼠个体影响特别大，生产不稳定、批间差大、含小鼠自身抗体纯化难度大。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明是基于所获得的anti-denguens13d5单克隆抗体，通过克隆、鉴定与基因结构的分析，确定了其cdr区序列，构建了相应的包括与ns1蛋白结合的抗原结合结构域的分离的结合蛋白，并建立了相应的真核细胞表达系统，生产纯化出了该结合蛋白。本发明提供的包括与ns1蛋白结合的抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其中所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区：或；与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性且与ns1蛋白具有kd≤1.19×10--8mol/l的亲和力；互补决定区cdr-vh1为g-f-n-i-k-x1-y-y-x2-h，其中，x1是e或d，x2是v、i或l；互补决定区cdr-vh2为w-i-d-p-x1-n-g-k-t-x2-y-d-p-k-x3-q-d，其中，x1是e、d或n，x2是l或i，x3是v、y或f；互补决定区cdr-vh3为v-x1-a-y-x2-r-f-v-y，其中，x1是t或s，x2是v、f或y；互补决定区cdr-vl1为s-a-s-x1-s-v-x2-y-m-y，其中，x1是s或t，x2是k或r；互补决定区cdr-vl2为i-y-x1-t-s-n-x2-a-s-g-x3-p，其中，x1是d或e，x2是v、i或l，x3是f或v；互补决定区cdr-vl3为q-x1-s-s-x2-p-r-t-f，其中，x1是q、y或w，x2是t、y或f。进一步地，所述互补决定区cdr-vh1中，x1是d；所述互补决定区cdr-vh2中，x1是e，x3是f；所述互补决定区cdr-vl1中，x2是r；所述互补决定区cdr-vl2中，x1是d，x3是v；所述互补决定区cdr-vl3中，x1是w。进一步地，所述互补决定区cdr-vh1中，x2是v。进一步地，所述互补决定区cdr-vh1中，x2是i。进一步地，所述互补决定区cdr-vh1中，x2是l。进一步地，所述互补决定区cdr-vh2中，x2是l。进一步地，所述互补决定区cdr-vh2中，x2是i。进一步地，所述互补决定区cdr-vh3中，x1是t，x2是v。进一步地，所述互补决定区cdr-vh3中，x1是t，x2是f。进一步地，所述互补决定区cdr-vh3中，x1是t，x2是y。进一步地，所述互补决定区cdr-vh3中，x1是s，x2是v。进一步地，所述互补决定区cdr-vh3中，x1是s，x2是f。进一步地，所述互补决定区cdr-vh3中，x1是s，x2是y。进一步地，所述互补决定区cdr-vl1中，x1是s。进一步地，所述互补决定区cdr-vl1中，x1是t。进一步地，所述互补决定区cdr-vl2中，x2是v。进一步地，所述互补决定区cdr-vl2中，x2是i。进一步地，所述互补决定区cdr-vl2中，x2是l。进一步地，所述互补决定区cdr-vl3中，x2是t。进一步地，所述互补决定区cdr-vl3中，x2是y。进一步地，所述互补决定区cdr-vl3中，x2是f。进一步地，所述结合蛋白中包括至少3个cdrs；或者，所述结合蛋白包括至少6个cdrs；优选的，所述结合蛋白为纳米抗体、f(ab’)2、fab’、fab、fv、scfv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种；优选的，所述结合蛋白包括序列依次如seqidno:1-4所示的轻链骨架区fr-l1、fr-l2、fr-l3及fr-l4，和/或，序列依次如seqidno:5-8所示的重链骨架区fr-h1、fr-h2、fr-h3及fr-h4。进一步地，所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列；优选的，所述恒定区序列选自igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige、igd任何其中之一恒定区的序列；优选的，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人；优选的，所述恒定区来源于小鼠；轻链恒定区序列如seqidno:9所示；重链恒定区序列如seqidno:10所示。本发明还提供了一种核酸，所述核酸编码上述的结合蛋白。本发明还提供了一种载体，所述载体包括上述的核酸。本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括上述的核酸或上述的载体。本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述的结合蛋白、核酸或载体中的一种或多种。优选地，所述试剂盒还包括用于标记所述结合蛋白的标记。本发明还提供了一种生产上述结合蛋白的方法，包括制备上述的核酸或载体的步骤；优选包括如下步骤：在培养基中培养上述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的结合蛋白。另外，本发明还提供了上述的结合蛋白在制备用于检测登革热感染的产品中的应用。本发明提供的包括与ns1蛋白结合的抗原结合结构域的分离的结合蛋白，包括特定的重链cdr和轻链cdr。该结合蛋白能够特异性地识别并结合ns1蛋白，具有较高的灵敏度和特异性，从而实现对登革热病毒的检测。并且，无需利用小鼠腹腔诱生杂交瘤细胞来生产该结合蛋白，生产难度小的同时，抗体功能更加稳定。具体实施方式除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。为了本发明可以更容易地理解，选择的术语在下文定义。术语“氨基酸”表示天然存在或非天然存在的梭基α-氨基酸。术语“氨基酸”用在本申请中可以包括天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸包括丙氨酸(三字母密码：a1a，单字母密码：a)，精氨酸(arg，r)，天冬酞胺(asn，n)，天冬氨酸(asp，d)，半肌氨酸(cys，c)，谷氨酞胺(g1n，q)，谷氨酸(g1u，e)，甘氨酸(g1y，g)，组氨酸(his，h)，异亮氨酸(i1e，i)，亮氨酸(leu，l)，赖氨酸(lys，k)，甲硫氨酸(met，m)，苯丙氨酸(phe，f)，脯氨酸(pro，p)，丝氨酸(ser，s)，苏氨酸(thr，t)，色氨酸(trp，w)，酪氨酸(tyr，y)，和撷氨酸(va1，v)。非天然存在的氨基酸包括但不限于α-氨基己二酸，氨基丁酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，高亮氨酸，高精氨酸，羟基脯氨酸，正亮氨酸，吡啶基丙氨酸，肌氨酸等等。术语“分离的结合蛋白”是这样的蛋白，其由于衍生起源或来源不与天然结合的组分结合，所述天然结合的组分在其天然状态下与其伴随；基本上不含来自相同物种的其他蛋白；由来自不同物种的细胞表达；或在自然界中不存在。因此，化学合成或在不同于其天然起源的细胞的细胞系统中合成的蛋白将是与其天然结合的组分“分离的”。还可以通过分离，使用本领域众所周知的蛋白纯化技术，使得蛋白基本上不含大然结合的组分。术语“包括抗原结合结构域的分离的结合蛋白”泛指包含cdr区的一切蛋白/蛋白片段。“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体以及这些抗体的抗原化合物结合片段，包括fab、f(ab’)2、fd、fv、scfv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物。抗体的类型可以选择igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige、igd。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以被称为“vh”。轻链的可变结构域可以被称为“vl”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区由被三个称为“互补决定区”或“cdr”的高变区打断的构架区构成。抗体的构架区，即构成要件轻链和重链的组合的构架区，起到定位和对齐cdr的作用，所述cdr主要负责与抗原的结合。本发明提供了一种包括与ns1蛋白结合的抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其中所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区：或；与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性且与ns1蛋白具有kd≤1.19×10--8mol/l的亲和力；互补决定区cdr-vh1为g-f-n-i-k-x1-y-y-x2-h，其中，x1是e或d，x2是v、i或l；互补决定区cdr-vh2为w-i-d-p-x1-n-g-k-t-x2-y-d-p-k-x3-q-d，其中，x1是e、d或n，x2是l或i，x3是v、y或f；互补决定区cdr-vh3为v-x1-a-y-x2-r-f-v-y，其中，x1是t或s，x2是v、f或y；互补决定区cdr-vl1为s-a-s-x1-s-v-x2-y-m-y，其中，x1是s或t，x2是k或r；互补决定区cdr-vl2为i-y-x1-t-s-n-x2-a-s-g-x3-p，其中，x1是d或e，x2是v、i或l，x3是f或v；互补决定区cdr-vl3为q-x1-s-s-x2-p-r-t-f，其中，x1是q、y或w，x2是t、y或f。本领域公知，抗体的结合特异性及亲合力均主要由cdr序列决定，根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非cdr区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。因此，本发明也包括该结合蛋白的“功能性衍生物”。“功能性衍生物”是指氨基酸替换的变体，一个功能性衍生物保留有可检测的结合蛋白活性，优选为能结合ns1蛋白的抗体的活性。“功能性衍生物”可以包含“变体”和“片段”，因其具有与本发明所述的结合蛋白完全相同的cdr序列，因此具有相类似的生物活性。在一些实施方式中，所述抗原结合结构域与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少85％，或90％，或91％，或92％，或93％，或94％，或95％，或96％，或97％，或98％，或99％的序列同一性且与ns1蛋白具有kd≤1.19×10--8mol/l，kd值也可以选择1.03×10-10mol/l、1.15×10-10mol/l、1.21×10-10mol/l、0.32×10-9mol/l、0.46×10-9mol/l、0.70×10-9mol/l、0.80×10-9mol/l、0.90×10-9mol/l、1.07×10-9mol/l、1.14×10-9mol/l或1.19×10-8mol/l的亲和力；或者1.03×10-10mol/l≤kd≤1.19×10-8mol/l。在一些优选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh1中，x1是d；所述互补决定区cdr-vh2中，x1是e，x3是f；所述互补决定区cdr-vl1中，x2是r；所述互补决定区cdr-vl2中，x1是d，x3是v；所述互补决定区cdr-vl3中，x1是w。在一些优选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh1中，x2是v。在一些优选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh1中，x2是i。在一些优选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh1中，x2是l。在一些优选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh2中，x2是l。在一些优选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh2中，x2是i。在一些优选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh3中，x1是t，x2是v。在一些优选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh3中，x1是t，x2是f。在一些优选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh3中，x1是t，x2是y。在一些优选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh3中，x1是s，x2是v。在一些优选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh3中，x1是s，x2是f。在一些优选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vh3中，x1是s，x2是y。在一些优选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl1中，x1是s。在一些优选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl1中，x1是t。在一些优选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl2中，x2是v。在一些优选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl2中，x2是i。在一些优选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl2中，x2是l。在一些优选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl3中，x2是t。在一些优选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl3中，x2是y。在一些优选的实施方式中，所述互补决定区cdr-vl3中，x2是f。在一些优选的实施方式中，所述结合蛋白中包括至少3个cdrs；或者，所述结合蛋白包括至少6个cdrs。在一些优选的实施方式中，所述结合蛋白为包含可变区和恒定区的完整抗体。在一些优选的实施方式中，所述结合蛋白为纳米抗体、f(ab’)2、fab’、fab、fv、scfv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种。在一些优选的实施方式中，所述结合蛋白包括序列依次如seqidno:1-4所示的轻链骨架区fr-l1、fr-l2、fr-l3及fr-l4，和/或，序列依次如seqidno:5-8所示的重链骨架区fr-h1、fr-h2、fr-h3及fr-h4。在一些优选的实施方式中，所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列。在一些优选的实施方式中，所述恒定区序列选自igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige、igd任何其中之一恒定区的序列。在一些优选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。在一些优选的实施方式中，所述恒定区来源于小鼠；轻链恒定区序列如seqidno:9所示；重链恒定区序列如seqidno:10所示。在一些实施方案中，本发明包括含有编码该结合蛋白的核酸序列。在本文中，核酸序列包含其保守置换的变体(例如简并密码子的置换)和互补序列。术语“核酸”和“多核苷酸”是同义的，包含基因、cdna分子、mrna分子以及它们的片段例如寡核苷酸。在一些实施方案中，本发明包括含有编码该结合蛋白的核酸序列的表达载体，其中的核酸序列与至少一种调节序列可操作连接。“可操作连接”指的是编码序列以允许编码序列的表达的方式与调节序列连接。调节序列选择用来在合适的宿主细胞中指导目的蛋白质的表达，包含启动子、增强子和其它的表达调控元件。在本文中，载体可以指包含本发明的核酸或其片段的、能够携带遗传信息并且可以将遗传信息递送到细胞中的分子或试剂。典型的载体包括质粒、病毒、噬菌体、黏粒和微型染色体。载体可以是克隆载体(即用于将遗传信息转移到细胞中的载体，可以繁殖所述细胞并且可以选择存在或不存在所述遗传信息的所述细胞)或表达载体(即包含必要的遗传元件从而允许所述载体的遗传信息在细胞中表达的载体)。因此，克隆载体可以包含选择标记，以及与所述克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点，而表达载体则包含对于影响指定靶细胞中的表达必要的调节元件。本发明的核酸或其片段可以插入到合适的载体中以形成携带本发明核酸片段的克隆载体或表达载体。这种新载体也是本发明的一部分。所述载体可以包括质粒、噬菌体、黏粒、微型染色体或病毒，也包括只在特定细胞中瞬时表达的裸dna。本发明克隆载体和表达载体能够自发的复制，因此能够为用于随后克隆的高水平表达或高水平复制目的提供高拷贝数。表达载体可以包括用于驱动本发明的核酸片段表达的启动子，可选的编码使所述肽表达产物分泌或整合到膜上的信号肽的核酸序列，本发明的核酸片段，以及可选的编码终止子的核酸序列。当在生产菌株或细胞系中操作表达载体时，载体引入到宿主细胞中时可以整合到宿主细胞的基因组中，也可以不能被整合到宿主细胞基因组中。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。本发明的表达载体用于转化宿主细胞。这种转化细胞也是本发明的一部分，可以是用于增殖本发明的核酸片段和载体、或用于重组制备本发明的多肽的培养细胞或细胞系。本发明的转化细胞包括微生物如细菌(如大肠杆菌、芽抱杆菌等)。宿主细胞也包括来自多细胞生物如真菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞，优选来自哺乳动物的细胞，例如cho细胞。所述转化细胞能够复制本发明的核酸片段。当重组制备本发明的肽组合时，所述表达产物可以输出到培养基中或携带在所述转化细胞的表面。在一些实施方案中，本发明提供的结合蛋白可以用于检侧一种或多种靶分子在生物样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测。在一些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。本发明的免疫测定包括胶体金免疫测定，还包括elisa以及其它利用抗原抗体反应的试验或方法。在一些实施方案中，本发明提供一种制品(例如试剂盒)，所述制品包含可用于诊断登革热病毒感染的材料。该制品包括容器和在容器上或与容器一起的标签或包装说明书。适合的容器包括，例如，瓶子或注射器等。所述容器可以由各种材料如玻璃或塑料制成。容器装有组合物，所述组合物是单独地或与可有效用于诊断登革热的另一种组合物结合。组合物中至少一种活性试剂是本发明提供的结合蛋白。在一些实施方案中，本文提供含有本文描述的结合蛋白、核酸或载体的检测试剂盒。检测测试样品中的ns1蛋白抗原的方法，其包括：a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下，使所述测试样品中的ns1蛋白抗原与如上所述的结合蛋白接触以形成免疫复合物；和b)检测所述免疫复合物的存在，所述复合物的存在指示所述测试样品中所述ns1蛋白抗原的存在；在此实施方式中，所述结合蛋白可以标记由显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。在一些实施方式中，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述结合蛋白结合；在此实施方式中，所述结合蛋白以第一抗体的形式与所述第二抗体形成配对抗体，用于结合ns1蛋白的不同抗原表位；所述的第二抗体可以标记由显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。在一些实施方式中，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述ns1蛋白抗原结合；在此实施方式中，所述结合蛋白作为所述第二抗体的抗原，所述的第二抗体可以标记由显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。在一些实施方式中，所述显示信号强度的指示剂包括荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金或酶中的任一种。在一些实施方式中，所述荧光物质包括alexa350、alexa405、alexa430、alexa488、alexa555、alexa647、amca、氨基吖啶、bodipy630/650、bodipy650/665、bodipy-fl、bodipy-r6g、bodipy-tmr、bodipy-trx、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、cascadeblue、cy2、cy3、cy5、cy7、6-fam、丹磺酰氯、荧光素、hex、6-joe、nbd(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、oregongreen488、oregongreen500、oregongreen514、pacificblue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、lajolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyaninb、藻蓝蛋白c、藻蓝蛋白r、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白r、reg、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、rox、tamra、tet、trit(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的任一种。在一些实施方式中，所述放射性同位素包括110in、111in、177lu、18f、52fe、62cu、64cu、67cu、67ga、68ga、86y、90y、89zr、94mtc、94tc、99mtc、120i、123i、124i、125i、131i、154-158gd、32p、11c、13n、15o、186re、188re、51mn、52mmn、55co、72as、75br、76br、82mrb和83sr中的任一种。在一些实施方式中，所述酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任一种。在一些实施方式中，所述荧光微球为：聚苯乙烯荧光微球，内部包裹有稀土荧光离子铕。如在一些实施方案中，本发明提供用于确定例如感染登革热的受试者中的ns1蛋白存在的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种本发明提供的结合蛋白，相关的缓冲剂，用于使液体样品与所述结合蛋白反应所需的试剂，以及用于确定ns1蛋白和结合蛋白之间存在阳性或阴性结合反应的试剂。为了确定ns1蛋白的存在，所述试剂盒可以例如利用带有标记的结合蛋白作为抗体，其中所述标记可以是任何合适的标记，如胶体金标记。下文提供了一些实例用于示例性说明本发明，而不是限制本发明的范围。下文提供了一些实例用于示例性说明本发明，而不是限制本发明的范围。实施例1本实施例中限制性内切酶、primestardna聚合酶购自takara公司。magextractor-rna提取试剂盒购自toyobo公司。smartertmracecdnaamplificationkit试剂盒购自takara公司。pmd-18t载体购自takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由invitrogen公司完成。分泌anti-denguens13d5单克隆抗体的杂交瘤细胞株为菲鹏生物股份有限公司已有的杂交瘤细胞株，复苏备用。1.1引物扩增heavychain和lightchain5’race引物：smarteriiaoligonucleotide：5’-aagcagtggtatcaacgcagagtacxxxxx-3’；5'-racecdsprimer(5'-cds)：5’-(t)25vn-3’(n＝a,c,g,ort；v＝a,g,orc)；universalprimeramix(upm)：5’-ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt-3’；nesteduniversalprimera(nup)：5’-aagcagtggtatcaacgcagagt-3’；mkr：5’-ttttccttttgaattcctaacactcattcctgttgaagc-3’；mhr：5’-ttttccttttgaattctcatttaccaggagagtgggaga-3’。1.2、抗体可变区基因克隆及测序从分泌anti-denguens13d5单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取中rna，用smartertmracecdnaamplificationkit试剂盒及试剂盒中的smarteriiaoligonucleotide和5'-cds引物进行第一链cdna合成，获得的第一链cdna产物作为pcr扩增模板。lightchain基因以universalprimeramix(upm)、nesteduniversalprimera(nup)和mkr引物进行扩增，heavychain基因以universalprimeramix(upm)、nesteduniversalprimera(nup)和mhr引物进行扩增。其中lightchain的引物对扩增出0.8kb左右的目的条带，heavychain的引物对扩增出1.4kb左右的目的条带。用琼脂糖凝胶电泳纯化回收，产物用rtaqdna聚合酶进行加a反应后插入到pmd-18t载体中，转化到dh5α感受态细胞中，长出菌落后分别取heavychain及lightchain基因克隆各4个克隆送invitrogen公司进行测序。1.3、anti-denguens13d5抗体可变区基因的序列分析将上述测序得到的基因序列放在imgt抗体数据库中进行分析，并利用vnti11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中lightchain扩增出的基因片段中，vl基因序列为342bp，属于vkii基因家族，其前方有57bp的前导肽序列；heavychain引物对扩增出的基因片段中，vh基因序列为357bp，属于vh1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。1.4、重组抗体表达质粒的构建pcdnatm3.4vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入hindiii、bamhi、ecori等多克隆酶切位点，并命名为pcdna3.4a表达载体，后续简称3.4a表达载体；根据上述pmd-18t中抗体基因测序结果，设计dn3d5抗体的heavychain和lightchain基因特异性引物，两端分别带有hindiii、ecori酶切位点和保护碱基，引物如下：dn3d5-hf：5’-catgaagcttatggaatggagctgggtctttctcttcttcctg-3’；dn3d5-hr：5’-ctaggaattcttatcatttaccaggagagtgggagaggctcttctc-3’；dn3d5-lf：5’-ctagaagcttatgaagttgcctgttaggctgttgg-3’；dn3d5-lr：5’-ctaggaattcttactaacactcattcctgttgaagctc-3’。通过pcr扩增方法扩出0.75kb的lightchain基因片段和1.42kb的heavychain基因片段。heavychain和lightchain基因片段分别采用hindiii/ecori双酶切，3.4a载体采用hindiii/ecori双酶切，将片段和载体纯化回收后heavychain基因和lightchain基因分别连接3.4a表达载体中，分别得到heavychain和lightchain的重组表达质粒。实施例21、表达上清结合蛋白活性鉴定质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节cho细胞1.43×107cells/ml于离心管中，100μl质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，转入10ml含cdchoagt培养基中，37℃摇床中培养(8％co2、震幅150)；每天取样检测细胞活率，当细胞活率低于50％，离心细胞培养上清，得到蛋白样品。在突变后对抗体活性进行检测，包被液稀释羊抗鼠igg1μg/ml进行微孔板包被，每孔100μl，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％bsa+80％pbs)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的dn单克隆抗体，100μl/孔，37℃，60min；甩掉板内液体，拍干，加入20％鼠阴性血封闭，每孔120μl，37℃，1h；甩掉板内液体，拍干，加入稀释10倍的dn-iii-ns抗原(公司自产重组抗原)，每孔100μl，37℃，40min；洗涤液清洗5次，拍干；加入标记hrp的另一株dn单克隆抗体(1:4k)，每孔100μl，37℃，30min；加入显色液a液(50μl/孔)，加入显色液b液(50μl/孔)，10min；加入终止液，50μl/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读od值2、结合蛋白纯化将上述样品用proteina亲和层析柱进行亲和纯化，纯化后得到500mg重组抗体，取4μg纯化的抗体进行还原性sds-page。在还原性sds-page后显示两条带，1条为28kd的轻链(序列如seqidno:11所示)，另一条为50kd的重链(序列如seqidno:12所示)。3、抗体亲和力分析利用amc传感器，纯化出来的抗体用pbst稀释到10μg/ml，dn-iii质控品重组蛋白(公司自产)用pbst进行梯度稀释：490.2nmol/ml、245.2nmol/ml、122.5nmol/ml、61.3nmol/ml、30.6nmol/ml、15.3nmol/ml、7.66nmol/ml、0nmol/ml；运行流程：缓冲液1(pbst)中平衡60s，抗体溶液中固化抗体300s，缓冲液2(pbst)中孵育180s，抗原溶液中结合420s，缓冲液2中解离1200s，用10mmph1.69gly溶液及缓冲液3进行传感器再生，输出数据。(kd表示平衡解亲常数既亲各力；kon表示结合速率；koff表示解离速率)，输出数据。实施例3实施例2得到的抗体(具有序列如seqidno:11以及12所示的轻链和重链)虽然具备结合ns1蛋白的能力，但亲和力和抗体活性均不够理想，因而申请人对该抗体的轻链cdr及重链cdr进行突变。经分析，重链的互补决定区：cdr-vh1为g-f-n-i-k-e(x1)-y-y-v(x2)-h；cdr-vh2为w-i-d-p-d(x1)-n-g-k-t-l(x2)-y-d-p-k-v(x3)-q-d；cdr-vh3为v-t(x1)-a-y-v(x2)-r-f-v-y；轻链的互补决定区：cdr-vl1为s-a-s-s(x1)-s-v-k(x2)-y-m-y；cdr-vl2为i-y-e(x1)-t-s-n-v(x2)-a-s-g-f(x3)-p；cdr-vl3为q-q(x1)-s-s-t(x2)-p-r-t-f。其中，x1、x2、x3均为突变位点。在突变后应用实施例2提供的方法对抗体活性进行检测，部分结果如下：表1与抗体活性有关的突变位点表2抗体活性分析数据wt突变1突变2突变3突变4突变5原倍2.3692.3442.2731.0540.892-稀释3倍2.3782.3102.2530.8790.102-稀释9倍2.2922.2192.1330.2100.014-稀释27倍1.9031.5671.5560.031--稀释81倍0.9180.6960.689---稀释243倍0.3610.2810.204---稀释729倍0.1880.1690.158空白孔0.0850.1350.132---“-”代表无活性。从上表可知，突变1的活性效果最佳，因而以突变1作为骨架序列筛选效价较好的突变位点，部分结果如下。表3与抗体亲和力有关的突变位点表4亲和力分析数据从表4的结果可以看出，表3中列出的突变位点对抗体的亲和力影响不大。为验证上述结果，以wt作为骨架序列重复上述实验，进行突变位点的亲和力验证，部分结果如下。表5以wt为骨架进行的突变表6亲和力分析数据kd(m)kon(1/ms)koff(1/s)wt3.09e-094.43e+041.37e-04wt1-10.60e-083.77e+032.28e-05wt1-41.19e-084.15e+034.95e-05wt1-70.37e-084.09e+031.53e-05wt1-200.53e-083.12e+031.64e-05从表5和表6分析，在保证具有抗体活性的前提下，上述突变位点与其他位点的关联也不大。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。sequencelisting<110>东莞市朋志生物科技有限公司<120>ns1蛋白的结合蛋白<160>12<170>patentinversion3.5<210>1<211>23<212>prt<213>人工序列<400>1glnilevalleuthrglnserproalailemetseralapheprogly151015gluargvalthrmetthrcys20<210>2<211>13<212>prt<213>人工序列<400>2trphisglnglnlysproglyserserproargleuleu1510<210>3<211>30<212>prt<213>人工序列<400>3valargpheserglyserglyserglythrsertyrserleuthrile151015serargaspglualametaspalaalathrtyrtyrcysgln202530<210>4<211>9<212>prt<213>人工序列<400>4glyglyglythrlysleugluilelys15<210>5<211>25<212>prt<213>人工序列<400>5gluvalglnleuglnglnserglythrgluleuvalargproglyala151015leuvallysleusercyslysalaser2025<210>6<211>14<212>prt<213>人工序列<400>6trpvallysglnargproargglnglyleuglutrpilegly1510<210>7<211>30<212>prt<213>人工序列<400>7lysalaserilethrseraspthrserthrasnthralatyrleugln151015leuargserleuthrsergluaspthralavaltyrtyrcys202530<210>8<211>11<212>prt<213>人工序列<400>8trpglyglnglythrleuvalthrvalserala1510<210>9<211>107<212>prt<213>人工序列<400>9argalaaspalaalaprothrvalserilepheproproserserglu151015glnleuthrserglyglyalaservalvalcyspheleuasnasnphe202530tyrprolysaspileasnvallystrplysileaspglysergluarg354045glnasnglyvalleuasnsertrpthraspglnaspserlysaspser505560thrtyrsermetserserthrleuthrleuthrlysaspglutyrglu65707580arghisasnsertyrthrcysglualathrhislysthrserthrser859095proilevallysserpheasnargasnglucys100105<210>10<211>323<212>prt<213>人工序列<400>10alalysthrthrproproservaltyrproleualaproglyserala151015alaglnthrasnsermetvalthrleuglycysleuvallysglytyr202530pheprogluprovalthrvalthrtrpasnserglyserleuserser354045glyvalhisthrpheproalavalleuglnseraspleutyrthrleu505560serserservalthrvalproserserthrtrpproserglnthrval65707580thrcysasnvalalahisproalaserserthrlysvalasplyslys859095ilevalproargaspcysglycyslysprocysilecysthrvalpro100105110gluvalserservalpheilepheproprolysprolysaspvalleu115120125thrilethrleuthrprolysvalthrcysvalvalvalaspileser130135140lysaspaspprogluvalglnphesertrpphevalaspaspvalglu145150155160valhisthralaglnthrlysproargglugluglnpheasnserthr165170175pheargservalsergluleuproilemethisglnasptrpleuasn180185190glylysgluphelyscysargvalasnseralaalapheproalapro195200205ileglulysthrileserlysthrlysglyargprolysalaprogln210215220valtyrthrileproproprolysgluglnmetalalysasplysval225230235240serleuthrcysmetilethrasnphepheprogluaspilethrval245250255glutrpglntrpasnglyglnproalagluasntyrlysasnthrgln260265270proilemetaspthraspglysertyrphevaltyrserlysleuasn275280285valglnlysserasntrpglualaglyasnthrphethrcysserval290295300leuhisgluglyleuhisasnhishisthrglulysserleuserhis305310315320serprogly<210>11<211>213<212>prt<213>人工序列<400>11glnilevalleuthrglnserproalailemetseralapheprogly151015gluargvalthrmetthrcysseralaserthrservallystyrmet202530tyrtrphisglnglnlysproglyserserproargleuleuiletyr354045gluthrserasnilealaserglyvalprovalargpheserglyser505560glyserglythrsertyrserleuthrileserargaspglualamet65707580aspalaalathrtyrtyrcysglnglntrpsersertyrproargthr859095pheglyglyglythrlysleugluilelysargalaaspalaalapro100105110thrvalserilepheproprosersergluglnleuthrserglygly115120125alaservalvalcyspheleuasnasnphetyrprolysaspileasn130135140vallystrplysileaspglysergluargglnasnglyvalleuasn145150155160sertrpthraspglnaspserlysaspserthrtyrsermetserser165170175thrleuthrleuthrlysaspglutyrgluarghisasnsertyrthr180185190cysglualathrhislysthrserthrserproilevallysserphe195200205asnargasnglucys210<210>12<211>439<212>prt<213>人工序列<400>12gluvalglnleuglnglnserglythrgluleuvalargproglyala151015leuvallysleusercyslysalaserglypheasnilelysasptyr202530tyrvalhistrpvallysglnargproargglnglyleuglutrpile354045glytrpileaspproasnasnglylysthriletyraspprolysphe505560glnasplysalaserilethrseraspthrserthrasnthralatyr65707580leuglnleuargserleuthrsergluaspthralavaltyrtyrcys859095valthralatyrvalargphevaltyrtrpglyglnglythrleuval100105110thrvalseralaalalysthrthrproproservaltyrproleuala115120125proglyseralaalaglnthrasnsermetvalthrleuglycysleu130135140vallysglytyrpheprogluprovalthrvalthrtrpasnsergly145150155160serleuserserglyvalhisthrpheproalavalleuglnserasp165170175leutyrthrleuserserservalthrvalproserserthrtrppro180185190serglnthrvalthrcysasnvalalahisproalaserserthrlys195200205valasplyslysilevalproargaspcysglycyslysprocysile210215220cysthrvalprogluvalserservalpheilepheproprolyspro225230235240lysaspvalleuthrilethrleuthrprolysvalthrcysvalval245250255valaspileserlysaspaspprogluvalglnphesertrppheval260265270aspaspvalgluvalhisthralaglnthrlysproarggluglugln275280285pheasnserthrpheargservalsergluleuproilemethisgln290295300asptrpleuasnglylysgluphelyscysargvalasnseralaala305310315320pheproalaproileglulysthrileserlysthrlysglyargpro325330335lysalaproglnvaltyrthrileproproprolysgluglnmetala340345350lysasplysvalserleuthrcysmetilethrasnphepheproglu355360365aspilethrvalglutrpglntrpasnglyglnproalagluasntyr370375380lysasnthrglnproilemetaspthraspglysertyrphevaltyr385390395400serlysleuasnvalglnlysserasntrpglualaglyasnthrphe405410415thrcysservalleuhisgluglyleuhisasnhishisthrglulys420425430serleuserhisserprogly435当前第1页12