毛竹PeVQ28蛋白及其编码基因与应用的制作方法

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及一种毛竹pevq28蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

中国竹子的种类十分丰富，据统计约39属、500多种，无论是竹子的类别源、种植面积还是竹林的蓄积量和产量都是位于世界第一位，可以说中国是世界上最主要的生产竹材的国家。毛竹也是一种森林资源，在我国南方地区占据着着十分重要的地位，由于其生长速度快且达到可用标准的周期短，产量也十分可观，可以代替一些慢生森林资源类型，随着科学技术的发展，对毛竹使用范围更加地广泛。由于毛竹材性特质，在建筑上的使用逐渐吸引了风景区、农家乐经营者，造型独特，简朴大方且低能环保；竹制的扫把、椅子、汤勺、玩具等竹艺制品也逐渐走进人们的日常生活中；毛竹中纤维素含量高决定其可用作于造纸原材料。同时在食用方面，不仅是竹笋不可以作为绿色食材食用，而且一些工厂加工的绿色饮品或是保健品中组成成分是从竹叶中提取或从竹材加工废料中水解提炼。除经济价值外，毛竹林还具有重要的生态方面的价值，如涵养水源、保育土壤、净化环境等。。

vq-motif蛋白是一类植物特异性蛋白，由于与wrky转录因子相互作用而逐渐引起关注。通过对vq蛋白家族在拟南芥中的研究，vq蛋白家族参与植物多方面的功能调控，主要参与植物的盐胁迫反应。在拟南芥中研究发现atcambp25(atvq15)在拟南芥种子萌发和生长发育早期可负调渗透胁迫，在nacl和渗透胁迫条件下，转基因株系在种子萌发和生长发育表现出高度敏感。同样地，经过研究发现atvq9过表达植株在nacl处理下条件下，无论是种子的萌发还是拟南芥苗的生长状况都有受到抑制的表现。

毛竹的生长环境对水分、气候及土壤的要求较高，适合生长在水分充足、气候温暖及微酸性或中性壤土环境中。近年来，随着全球气温的不断升高及气候的不断恶化，致使植物在生长过程中会受到来自环境的各种不利条件的伤害，土壤盐渍化是当今世界普遍关注的问题。盐胁迫是植物生长发育的主要限制因子之一。毛竹对盐胁迫是敏感的，它们在盐碱地生长时，由于受到盐碱的胁迫作用，生长缓慢，往往叶片变黄、死亡、脱落，严重影响光合作用，有时甚至整株植物枯萎死亡。盐胁迫对毛竹造成的负向效应主要表现在：钾、钙、磷、氮摄入不足造成的营养胁迫；钠离子、氯离子以及硫酸盐的累积造成的离子毒害效应；土壤中高浓度溶质造成的渗透胁迫；活性氧积累造成生物膜、蛋白和核酸的破坏，即氧化胁迫。高盐等环境胁迫已极大的限制了毛竹的生长状况，因此，认识植物对盐胁迫的反应机制，提高植物的抗盐性，培育出一批耐盐的毛竹新种质，对提高毛竹的产量，促进林产业稳定发展，增加国民的经济收入具有重要的意义。

目前已公布的vq基因及其同源基因，多来源于模式植物或者草本植物，这些植物多为一年生植物，而在毛竹中关于vq基因的功能还尚未报道。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种毛竹pevq28蛋白及其编码基因与应用。

为了实现本发明目的，本发明采用了如下技术方案：本发明的一种毛竹pevq28蛋白，所述的毛竹pevq28蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。

本发明的一种编码所述的毛竹pevq28蛋白的编码基因序列，其特征在于：所述的毛竹pevq28蛋白的核酸序列如seqidno.2所示。

本发明的含有所述编码基因序列的载体。

本发明的所述载体的构建方法，包括如下步骤:

将两端包含酶切位点的毛竹pevq28蛋白编码基因序列构建到peasyt1simplecloningvector载体上，转入大肠杆菌感受态细胞transt1内，得到t1-pevq28重组质粒，双酶切t1-pevq28重组质粒和pcambia1301a质粒，连接后，转入大肠杆菌感受态细胞，提取质粒后，获得表达载体pcambia1301a-pevq28。

本发明的含有所述载体的工程菌。

本发明的用于克隆所述编码基因序列的引物对，其特征在于：所述引物对包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如seqidno.4所示，所述的下游引物的核苷酸序列如seqidno.5所示。

本发明的一种毛竹pevq28基因，其特征在于：所述的毛竹pevq28基因cdna全长的核酸序列如seqidno.3所示。

本发明所述的毛竹pevq28基因在改造植物抗盐中的应用。

进一步地，通过农杆菌介导的花序浸染法将所述基因或所述的编码基因序列转入植物中。

有益效果：本发明首次提供了毛竹抗盐相关的pevq28蛋白及其编码基因与应用。通过农杆菌介导的花序浸染法将pevq28基因表达载体转入野生型拟南芥中，结果显示过表达拟南芥植株的抗盐性明显增强，说明pevq28基因能够提高转基因拟南芥的抗盐性。利用毛竹pevq28基因表达载体获得的植物材料，对外界高盐环境具有一定的适应性，具有很好的应用前景。

附图说明

图1是本发明所述pevq28基因所编码的蛋白的氨基酸序列和结构域划分图；

图2是本发明实施例2毛竹叶片总rna的电泳图；m：trans2kdnamarker；1：毛竹叶片总rna。

图3本发明实施例4毛竹pevq28基因的植物转基因载体pcambi1301a-pevq28构建示意图；

图4是本发明实施例5转基因拟南芥和野生型拟南芥在盐处理前后的表型图；a:转基因拟南芥和野生型拟南芥在盐处理前后的表型图；b：转基因拟南芥和野生型拟南芥在盐处理10天后的存活率；c-h：转基因拟南芥和野生型拟南芥在盐处理前后的pro、rwc、sod、pod、cat以及mda的含量。wt：野生型拟南芥；l1、l3、l10：转基因过表达株系。

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例中所使用的试剂主要包括分子生物学实验试剂和试剂盒等，均可通过商业途径获得，具体包括：rna提取试剂盒购于roche生物科技有限公司；反转录试剂盒(first-strandcdnasynthesiskit)购于promega公司；sybrgreenmix购于美国abi公司；trizol购于上海英俊生物技术有限公司琼脂糖凝胶dna回收试剂盒、质粒快速小提试剂盒购于axygen；peasyt1simplecloningvector、taq酶、transt1感受态及相关的试剂盒购于北京全式金公司；限制性内切酶smai和sali及dnamarker均购于takara(宝生物工程(大连))有限公司；测序工作均由华大基因科技股份有限公司完成。本发明实施例中所提供的方法如果没有特殊说明均为常规方法。

实施例1

一个毛竹pevq28基因编码的蛋白序列

使用primers软件，对毛竹pevq28基因的cdna序列全长，进行蛋白序列翻译(seqidno.1)(图1)。

实施例2

毛竹抗盐相关基因pevq28诱导表达模式分析

(一)胁迫处理和总rna提取

用100mm氯化钠溶液，150mm氯化钠溶液和200mm氯化钠溶液分别浇灌一年生的毛竹幼苗，保持其他营养条件不变。分别用剪刀(事先用75％酒精擦净消毒)取各种处理后的0、1、3、6、12及24h的毛竹叶片，装入含有rna保护液的2ml的dof管中保存备用，不同时间段及样品植株重复3次。trizol法提取总rna，详细步骤如下：

(1)从rna保护液中取出备用的毛竹叶片，先放在滤纸中尽量吸干保护液避免造成影响，转入研钵后倒入液氮即刻开始研磨直至叶片成为粉末，收集粉末于1.5mldorf管(提前液氮预冷)；

(2)用移液器吸取1mltrizol溶液加到装有样品的dof管，快速震荡dof管15s后在超净工作台上室温放置5min；

(3)4℃离心10min，设置转速为12,000rpm。结束后小心吸取800μldof管中三层液相的中层水相，到新的dof管中；

(4)加氯仿/异戊醇溶液200μl，迅速15s震荡，3min静置；

(5)4℃离心15min，12,000rpm，吸取400μl上层水相到新dof管中，加入一样体积的异丙醇沉淀，静放25min以上；

(6)重复“(5)”的离心设置，结束后只留dof管底部的沉淀；

(7)用75％酒精清洗沉淀，重复两次，转速7500rpm，离心时间5min，完成后留沉淀；

(8)开盖的dof管放置于超净工作台吹干，室温5-10min。注意吹干时间不能过长，否则沉淀太过干燥难溶；

(9)吸30μl的depc水溶解沉淀；

(10)混匀后获得rna溶液，取出4μl检测结果，其余存-80℃冰箱。

(二)总rna的检测及去基因组dna处理

(1)总rna完整性检测

取3μl提取的总rna，与1μlloadingbuffer混匀，电泳检测，电泳5v/cm。20分钟后，在凝胶成像系统中观察并拍照，若发现离点样孔近的28srrna条带最亮约是18srrna的二倍，完整无杂带，则认为提取的rna未发生降解(图2)。

(2)总rna纯度和含量的检测

用微量分光光度计检测总rna纯度和含量，先对仪器进行清洗，再检测rna(1μl)。如果a260/a280的比值在1.8～2.0范围内，代表rna纯度较好，若rna中有蛋白质或酚污染，a260/a280的比值就会明显低于1.8，而比值大于2.0则表明rna样品发生降解。

(3)基因组dna的去除

1)在pcr管中配制以下反应液：

在微量的离心管中，依次加入下列试剂：

rnase-free水补至最终体积50μl

2)37℃反应30分钟，加入50μl的rnase-free水；

3)吸取100μl苯酚/氯仿/异戊醇混合液(比例25：24：1)加入；

4)离心(10000rpm，10分钟)，转移水层到新的pcr管，加10μl醋酸钠(3mol/l，ph＝5.2)和250μl无水乙醇(提前预冷)，-20℃放45分钟；

5)用提前预冷的70％的酒精清洗离心后的沉淀，置于超净工作台上吹干，加rnase-free水溶解沉淀，并电泳检测是否除去基因组dna。

(三)反转录

实验方法由takara反转录试剂盒primescript^tmrtmastermix(perfectrealtime)

说明书提供：

(1)加样：

(2)加样混匀后，37℃保育15分钟，若rna浓度过低可延至30分钟；

(3)85℃，5秒，目的是使反转录酶失活，4℃保存；

(4)反转录产物cdna于-20℃冰箱保存，用于荧光定量实验。

(四)引物设计

根据毛竹pevq28基因的cdna序列全长，利用primer5软件设计荧光定量

pevq28引物：

f：5’-tgagcccatcaactacactgcc-3’；

r：5’-tgctggcgtctggcttcc-3’。

用pcr对其特异性进行检测，在确保pcr特异性扩增前提下，方可使用。以毛竹tip41基因为荧光定量试验的阳性对照，tip41基因的引物为：

f：5’-aaaatcattgtaggccattgtcg-3’；

r：5-actaaattaagccagcgggagtg-3’。

荧光定量pcr反应体系为25μl，各组分为sybrgreenmix12.5μl，模板cdna为2μl，上游引物和下游引物(10μmol/l)各0.5μl，最后补去离子水至25μl。pcr反应参数如下：95℃预变性10min；95℃15sec，60℃1min，共40个循环。反应结束后，对产物进行加热，获得产物的溶解曲线。采用2^–δδct法对获得的信号和数据进行处理。

实施例3

毛竹抗盐相关基因pevq28的克隆

根据毛竹基因组网站上公布的pevq28基因cds序列，设计pcr扩增该片段的引物，上游引物加smai酶切位点，下游引物加sali酶切位点。

引物序列如下：

pevq28-f5′-atacccgggatgggggagtaccacag-3′

pevq28-r5-gccgtcgacttaagatgcgtacatttcac-3′

以毛竹叶片totalrna反转录第1链cdna为模板，用上游引物和下游引物进行pcr扩增，pcr反应体系如表1所示：

表1

pcr反应条件为：预变性：98℃10min；变性：98℃10s；退火：58℃30s；延伸：72℃1min，39个循环；总延伸：72℃10min。

反应结束后，吸取pcr产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中检测和切胶后，使用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收，将回收片段与peasyt1simplecloningvector连接，转化到全式金生物技术有限公司的大肠杆菌感受态transt1细胞中；pcr和酶切检测筛选阳性克隆；对检测结果初步判断正确的连接片段，送去华大公司进行测序，测序结果如：序列表中seqidno:2的dna序列所示，由747bp个碱基组成，将其与毛竹基因组网站上报道的序列比对，结果完全一致。

实施例4

毛竹pevq28基因的植物转基因载体pcambi1301a-pevq28构建

将已连接到peasyt1simplecloningvector上的小片段的pevq28片段与农杆菌双元载体pcambia1301a用smai和sali酶进行双酶切，于37℃水浴锅中，3h，酶切20ul体系如表2所示：

表2

双酶切后，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，利用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收。将上述大小片段用t4dna连接酶连接，25℃连接2～12h，连接体系如表3所示：

表3

取5～10μl的构建好的载体pcambia1301a–pevq28质粒轻轻打入到100μleha105农杆菌感受态细胞中，冰浴5min，液氮速冻1min，37℃水浴5min后，加入200μlyep液体培养基，28℃，220培养4～5h；1.0×10⁴g，离心30s，弃上清，加入100μlyep液体培养基，重新悬浮细胞，涂布于含100μg/mlkan和50μg/mlrif的yep固体平板上，28℃培养约24～48h；挑取平板上长出的微黄色的单菌落，接种于含100μg/mlkan和50μg/mlrif的yep液体培养液中，摇菌24～48h；待菌液浑浊，显示为橙黄色，提取质粒；分别用pcr和双酶切验证。

实施例5

将植物转基因表达载体pcambia1301a–pevq28转入野生型拟南芥中

1.拟南芥的种植：

(1)在超净台上，用12％花王漂白水漂洗饱满的野生型拟南芥种子8min，然后以灭菌的蒸馏水反复冲洗7-8次，每次冲洗3min。

(2)用1ml移液枪吸取消毒过的种子均匀地吹打在1/2ms固体培养基上，放入4℃冰箱春化3天，然后转移到温室中培养。

(3)一周后，将平板上的拟南芥移栽到装有蛭石和黑土(3:1)的小盆中，每4棵/盆。然后保鲜膜覆盖三天。生长期间3天浇水一次，保持花盆中土壤湿润。

2.农杆菌侵染液的制备：

取50μl已构建好的过量表达载体农杆菌菌液，加入到10mlyep液体培养中，同时加入相应的kan和rif，28℃，230r/min，培养两天，od600＝08-1.0。4℃，4.5×10³r/min，离心6min，弃上清。用转化buffer培养基重悬沉淀，备用。

用剪刀将已抽薹的主茎剪掉，打破顶端优势，使其分生更多的侧枝。待植株上有1/3的花蕾时，用胶头滴管吸取一配制好的菌液，滴蘸花蕾，并用剪刀剪去已有的果荚，减少种子的假阳性。避光黑暗培养三天。约5天后，用样的方法进行第二次侵染。最终收获的种子，为t0代。

实施例6

毛竹pevq28基因的转基因拟南芥筛选和鉴定

1.潮霉素培养基的筛选：

将拟南芥t0种子，均匀地平铺在潮霉素的ms培养基上，如上述步骤。待4℃春化3天后，转移到温室中培养。约一周，观察萌发情况，如正常萌发，则可能为转基因阳性植株。

2.pcr分子验证

首先根据ctab法进提取pevq28转基因拟南芥dna，

(1)在水浴锅(60℃)内溶解ctab提取缓冲液；

(2)将叶片置于研钵内，倒入液氮，研磨至粉状。分装入2mldof管中，每管加入1mlctab提取缓冲液，漩涡震荡30s，置于冰上静3-5min，使充分裂解；

(3)将dof管置于水浴锅(65℃)中，保温1h，使细胞完全破碎；

(4)向dof管中加入1ml酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，并充分混匀，1.2×10⁴g，离心15min，取上层水相至新的dof管中，加入等体积的氯仿异戊醇，充分混匀，再次1.2×10⁴g，离心15分钟；

(5)再次吸400ml的上清液至新的dof管中，加入400ml的异丙醇，混匀，于-20℃冰箱中静置半小时，1.2×10⁴g，离心15min，去上清；

(6)加入1ml的乙醇(70％)，离心6min，弃上清；

(7)重复步骤(6)；

(8)加50μl灭过菌的纯水溶解沉淀，并进行dna的纯度、浓度及a260/a280值的检测。

以野生型拟南芥dna作为对照，使用载体构建的引物pevq28f和pevq28r，以及对转基因拟南芥的阳性植株dna进行pcr筛选。pcr扩增程序：98℃10min；变性：98℃10s；退火：62℃5s；延伸：72℃30s，28个循环；总延伸：72℃10min。反应结束后，取pcr产物，进行2％琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统中检测。

3.毛竹pevq28基因的转基因拟南芥的表型分析

将转基因以及野生型拟南芥纯合体种子，种植于温室中，两周后，拍照观察表型；同时进行盐胁迫处理，在盐处理的过程中，拍照观察表型变化。并对不同株系的拟南芥盐处理后的存活率进行统计，以及干盐处理前后的生理指标进行统计(图4)。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

序列表

<110>安徽农业大学

<120>毛竹pevq28蛋白及其编码基因与应用

<130>2018

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>170

<212>prt

<213>人工序列(pevq28)

<400>1

metglyglutyrhisargmetserproserthrthrleuprovalhis

151015

lysaspserserhisthrileserlysthrargprolysilelysile

202530

ilehisileileserprogluileilelysthraspvalalaasnphe

354045

argaspleuvalglnargleuthrglylysproaspalaserthrala

505560

aspvalalaproserleuproprovalgluglugluglnlyslysglu

65707580

alailelyslysargproproproproproalaalagluargglyasp

859095

phemetvalproglngluasnlyslyslysilelyscysgluvallys

100105110

valglngluglyglyleuglyaspglyleuasphisasngluleutrp

115120125

metaspleuasnproglyglypheleuserpheleuglugluaspval

130135140

pheglnglymetalaproasppheleuglnproleuglyserserarg

145150155160

metaspleuvalglyglumettyralaser

165170

<210>2

<211>513

<212>dna

<213>人工序列(pevq28-cds)

<400>2

atgggggagtaccacagaatgagcccatcaactacactgcccgtgcacaaggactcctcg60

catactatatccaagacgcggcccaagataaagatcatccacatcatttcaccggagatc120

atcaagaccgacgtcgccaacttccgggacctcgtgcagcggctcactgggaagccagac180

gccagcacggcggacgtggctccgtcgctgccgccggtagaggaggaacagaagaaggag240

gcgatcaagaagaggccgccgccgccgccggctgccgagaggggcgatttcatggtgcca300

caagagaataagaagaagatcaaatgcgaggttaaggttcaggaaggaggtttaggcgat360

ggccttgatcacaacgagctgtggatggatctgaatccgggaggtttcttgagcttcttg420

gaggaggacgtcttccaagggatggctcctgacttcttgcagcctctcggctcgtcaagg480

atggatttggttggtgaaatgtacgcatcttaa513

<210>3

<211>1659

<212>dna

<213>人工序列(pevq28-cdna)

<400>3

ctatatatacctttccatttccctctcctctcctcacacactgatctttctagctctccc60

cctctcttgatctctgtctgtctgcacactaatgggggagtaccacagaatgagcccatc120

aactacactgcccgtgcacaaggactcctcgcatactatatccaagacgcggcccaagat180

aaagatcatccacatcatttcaccggagatcatcaagaccgacgtcgccaacttccggga240

cctcgtgcagcggctcactgggaagccagacgccagcacggcggacgtggctccgtcgct300

gccgccggtagaggaggaacagaagaaggaggcgatcaagaagaggccgccgccgccgcc360

ggctgccgagaggggcgatttcatggtgccacaagagaataagaagaagatcaaatgcga420

ggttaaggttcaggaaggaggtttaggcgatggccttgatcacaacgagctgtggatgga480

tctgaatccgggaggtttcttgagcttcttggaggaggacgtcttccaagggatggctcc540

tgacttcttgcagcctctcggctcgtcaaggatggatttggttggtgaaatgtacgcatc600

ttaattgggttaagagttttctttgattttattttcctttcgtgttgtgaggattttggc660

actttggtagagaggattggattctttttttctcttccctttgtctagatgaacacaatg720

gtgttggaagttcttgcacccttggttgcaaataatgatgtgtatgtaaggggtcactgg780

tgggatcatagaaggaatgatcaatttgggtgcttaaatttgttttgctctctgttccaa840

atgtaaataattgctctttgtcctgttttgaaagtaccatatcgagaaaatcagaacagt900

gatattttcaactgaatcatggtaagtgaactttaaattctgttattttcacattgtagc960

tgcactcttgatcatcattctacccttgttttttgaaggaaaattgtgctcatcaatcac1020

catcttgatggcaattcaaaagtttttgtgtgttgtacaagatggagctccattattcca1080

ttaatttggtcaccaatcttacaccaaggaatgtatacacttgctctctgctctctttga1140

gagcaccaatttagttttgagcccctttcagtagacctgccaaagaatgctctgattaag1200

tgtttgcttcagtttactaattgcaaaggatgtgatcaaacaggtgtcaatgactctatg1260

cacaactggaaattaccttgatgggaataactcttttttaatagcattcttctatgtgaa1320

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<210>4

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(上游引物)

<400>4

atacccgggatgggggagtaccacag26

<210>5

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(下游引物)

<400>5

gccgtcgacttaagatgcgtacatttcac29