一株短杆菌菌株及应用的制作方法

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一株降解油桐饼粕的短杆菌菌株及其应用。

背景技术：

油桐是我国本土的木本油料树种。油桐具有生长快，产量高，适应性广，种子含油率高且营养丰富等优点。桐籽榨油后的桐饼，含有氮4％～6％，p2o51.8％～2.7％，k2o1.2％～1.3％，还有大量其它微量元素，是一种优良的蛋白资源。但由于油桐饼粕含有毒素，为皂角甙和佛波醇及其相关化学物质，因而油桐饼粕长久以来多作为饼肥还田使用。

随着农业现代化的发展，高养分且使用简便的化肥逐渐取代了历史悠久的有机肥。随之而来的是各种农业和环境问题：土壤养分流失、肥力下降，环境污染加剧，作物抗病虫害能力减弱，资源浪费等等。桐粕肥料化不仅有助于解决世界各地的肥源不足问题，有益于生物肥的多样性，而且能够在一定程度上规避对于化学肥料的依赖。但是油桐饼粕作为肥料直接施用或者堆积发酵后施用，不仅肥效慢，而且桐粕中的营养物质不能充分利用造成资源浪费。

短杆菌属(brevibacterium)是放线菌目中的一个大属，好氧且无芽孢的革兰氏阳性短杆状细菌。该属是1953年由breed以亚麻短杆菌为模式种提出的。短杆菌能够利用天冬氨酸合成苏氨酸、赖氨酸等，其中赖氨酸是人和高等动物所必需的氨基酸，在食品、医药和畜牧业上的需求量大。本属中的黄色短杆菌(b.flavum)可将葡萄糖发酵生产l-谷氨酸，是重要的工业菌种，主要用于医药、食品和饲料工业。brevibacteriumpermense是一种耐受油桐饼粕毒素，并且能够有效降解油桐饼粕蛋白的细菌，具有产氨能力。

技术实现要素：

本发明目的之一在于提供一株短杆菌lyt-5及其在降解油桐饼粕中的应用，本发明的短杆菌能够耐受油桐饼粕毒素并有效降解油桐饼粕蛋白质。

本发明所提供的短杆菌(brevibacterium)命名为brevibacteriumpermenselyt-5(以下简称短杆菌菌株lyt-5)，该菌株已于2017年3月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，(简称gdmcc，保藏单位地址：广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼，邮编：510070)，保藏编号为gdmccno：60154。

本发明所提供的短杆菌菌株lyt-5的特征如下：

1)菌落特征：菌落呈污白色，圆形和椭圆，表面粗糙且不透明，边缘不整齐。

2)生理生化鉴定结果如表1所示：

表1枯草芽孢杆菌lyt-1生理生化试验结果

3)16srdna序列分析：

本发明的短杆菌菌株lyt-5，其16srdna序列在ncbi数据库中用blast进行同源性分析，得到相似性较高的序列，运用mega6.06软件构建系统发育树；该短杆菌lyt-5的16srdna序列与brevibacteriumpermense的同源性达到100％。

brevibacteriumpermenselyt-5具有耐受油桐饼粕毒素的能力。

brevibacteriumpermenselyt-5具有高效降解油桐饼粕蛋白质的能力。

brevibacteriumpermenselyt-5具有促生作用，所述促生作用为产氨作用。

因此，短杆菌lyt-5可用于制备降解油桐饼粕制剂。还可用于制备油桐饼粕发酵菌剂。

总之，本发明提供了一种短杆菌菌株lyt-5，该菌株具有耐受油桐饼粕毒素和高效降解油桐饼粕的能力，并且具有促生作用。该菌株在96小时内降解油桐饼粕蛋白生产氨基酸量为141.5mg/g，增长了8.8倍。本发明提供的短杆菌菌株lyt-5为降解油桐饼粕提供了菌源，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明具体实施方式中brevibacteriumpermenselyt-5的菌落形态图；

图2为本发明具体实施方式中brevibacteriumpermenselyt-5的pcr产物琼脂糖电泳图；

图3为本发明具体实施方式中brevibacteriumpermenselyt-5的16s序列构建的系统发育树图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：菌株的分离和筛选

1)油桐饼粕来源：通过从自湖南国盛生物能源股份有限公司采样。

2)油桐饼粕浸出汁培养基：油桐饼粕200g，60～90℃下浸泡3～4h，用8层纱布过滤除去残渣获得桐粕汁，定容至1000ml，250ml三角瓶分装，每瓶装量50ml，ph自然。

3)油桐饼粕发酵底料：油桐饼粕和水等比例(质量比)混匀，500ml锥形瓶装量40g，1×10⁵pa灭菌25min(两次)。

4)菌种初筛：将油桐饼粕和水按3∶1比例混匀，自然堆积发酵20d。取1g堆积发酵的油桐粕接种到油桐粕浸出汁培养基屮，做3个重复，30℃、180r/min摇床培养48h后，分别吸取1ml菌悬液接种到油桐粕浸出汁培养基屮，30℃、180r/min摇床培养3d。3d后分别取1ml菌悬液，用无菌水作一系列的倍比稀释。分别将100μl稀释浓度为10^-13～10^-16的稀释液涂布到na培养基上，30℃培养箱中倒置培养，每隔24h观察平板上菌体生长情况。挑取颜色形态不同的菌落进行划线分离，反复进行纯化，得到单菌落并进行编号，4℃斜面保存。

5)菌株复筛：将分离纯化的单菌株分别接种到50mlna液体培养基中，30℃、180r/min摇床培养。每隔12h时取样1ml，用无菌水进行10^-1～10^-8倍比稀释，选取10^-7～10^-8浓度进行na平板涂布，每个浓度3次重复，30℃恒温培养24h，对平板上的菌落进行计数。待细菌密度达到10⁸cfu/ml时即可用于接种发酵。按40％接种量(v/m)接种菌液到油桐饼粕发酵底料中，35℃恒温培养箱培养4d，每隔24h进行翻样，每个菌株2组重复。发酵结束后，取出发酵物70℃烘干，甲醛法测定发酵前后样品中氨基态氮含量，对比筛选出发酵效果比较好的菌株。

实施例2：菌株的鉴定

1)形态学观察：

将菌株划线到营养琼脂(na)培养基(胰蛋白胨10g/l，牛肉膏3g/l，nacl5g/l，ph7.2～7.4，121℃下灭菌20min。)，然后将平板倒转，30℃培养24h，观察记录平板上菌落的生长情况。图1显示菌株的菌落特征大体上如下：菌落特征：菌落呈微黄色，表面粗糙褶皱不透明，圆形或不规则形，边缘不整齐。

2)生理生化鉴定：

接触酶实验：直接滴加3％的过氧化氢于菌株的液体培养物(24h)中，立即观察，有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性。菌株立即产生大量气泡，实验结果为阳性。

氧化酶实验：取白色洁净滤纸一角于洁净培养皿中，蘸取试验菌菌落少许，滴加试剂(1％盐酸二甲基对苯二胺水溶液)一滴，阳性者立即呈粉红色，以后颜色逐渐加深。菌株不变色，为阴性。

淀粉水解实验：菌种点接至淀粉培养基上，30℃培养48h，滴加少量碘液于平板，轻轻旋转，使碘液均匀分布于平板，观察。菌落周围出现无色透明圈表明有水解淀粉的能力，反之，没有。菌株菌落周围无透明圈产生，不能水解淀粉。

甲基红mr实验：挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养于30℃，3～5天，取培养液1ml，加甲基红指示剂1～2滴，阳性呈红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。菌液变黄色，为阴性。

vp实验：挑取新纯培养物少许，接种于通用培养基，于30℃培养2d、培养液2.5ml先加入a萘酚纯酒精溶液0.6ml，再加40％氢氧化钾水溶液0.2ml，摇动2～5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或30℃恒温箱，如2h内仍不显现红色，可判定为阴性。菌液立即变红，为阳性。

明胶液化实验：取新纯培养物，穿刺接种于明胶高层约2/3深度，另有两支未接种的空白对照。20℃下培养3～5d。每天观察结果，若细菌生长且明胶部分或全部变为可流动的液体，则为试验阳性。否则为阴性。明胶不被液化，为阴性。

硝酸盐还原实验：将培养物接种于硝酸盐肉汤培养基，28℃摇床培养3d，取5ml培养液，按试剂盒(海博生物技术有限公司硝酸盐还原试剂盒)说明加入显色剂，变黄为阳性，不变色为阴性。菌液不变色，为阴性。

产硫化氢实验：将待检菌穿刺接种于醋酸铅培养基，于35℃培养24～48h观察结果。培养基变黑为阳性，不变为阴性。培养基未变色，为阴性。

柠檬酸盐利用实验：挑取菌苔在西蒙斯氏柠檬酸盐培养基斜面上划线接种，35℃培养3-7天。培养基为碱性(指示剂蓝色或桃红色)者为阳性，否则为阴性。培养基变蓝色，为阳性。

卵磷脂酶活性实验：用75％乙醇将新鲜鸡蛋表面消毒，并用灭菌的镊子将鸡蛋打个孔，倾去蛋清，然后用无菌吸管吸出卵黄，加入到融化后冷却至50℃左右的培养基中，混匀后倒平板，点接菌种，30℃培养24-48h观察，菌落边缘出现浑浊不透明区者为酶阳性。不出现明显的浑浊不透明区，为阴性。

丙二酸盐利用实验：挑取培养12h菌苔接种于丙二酸盐培养基，35℃培养培养24-48h，培养基由绿变蓝者为阳性，反之为阴性。培养基变蓝色，为阳性。

纤维素分解实验：将待测菌株划线接种于添加0.8％纤维素粉的琼脂基础培养基上，以不接种的培养基作为空白对照，30℃培养1～2周，菌株能在培养基上生长，实验结果为阳性；反之为阴性。菌株不生长，为阴性。

产iaa试验：将待测菌株接种到添加0.5mmol/ll-色氨酸的tsb培养基中30℃摇床培养48h，取培养液2ml，10000r/min离心10min，取上清，每1ml上清液添加2mlsalkowski试剂，室温暗处静置30min，以空白培养基作为对照，如有粉色产生则说明有iaa产生。无粉色产生，不产iaa。

产氨试验：将菌株接种到蛋白胨培养基中，30℃摇床培养3d，取培养液少许于试管中，滴加5滴纳氏试剂，以空白培养基作为对照，出现黄褐色沉淀为阳性，证明菌株具有产氨的能力。有黄褐色沉淀产生，具有产氨能力。

解磷试验：将菌株接种到添加2％琼脂的nbrip培养基上，30℃培养3d，菌落周围有无色透明圈出现者为阳性，证明该菌株具有解磷能力。菌株菌落周围没有无色透明圈出现，为阴性。

3)16srdna序列分析：

采用康为世纪生物科技有限公司基因组提取试剂盒(细菌)提取dna。

pcr反应体系(50μl)：mastermix(2×)25μl；上游引物2.5μl；下游引物2.5μl；ddh2o18μl；模板dna2μl；总体积50μl。

pcr反应条件：94℃预变性5min；94℃变性0.5min，53℃退火0.5min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸5min，-20℃保存。

pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测(电泳图如图2所示)。pcr产物由上海生工生物工程有限公司进行测序。将所得序列通过ncbi—blast进行序列比对分析，运用mega6.06软件构建系统发育树(系统发育树如图3所示)。

综合述形态学观察、生理生化鉴定及16srdna序列分析结果，可以确定该菌株lyt-5为brevibacteriumpermense，其被命名为brevibacteriumpermenselyt-5。