本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从杏鲍菇菌渣中提取漆酶的方法。
背景技术：
随着食用菌产业的迅速发展，出菇后大量菌渣的综合利用对于保护环境、实现生态农业和有机农业良性循环有着十分重要的意义，目前菌渣主要是丢弃或焚烧，不仅造成资源的浪费更导致霉菌和害虫的增生，造成环境的污染。
杏鲍菇是一种分解纤维素、木质素、蛋白质能力较强的食用菌，其生长发育过程中能分泌较多的漆酶。采摘后的新鲜菌渣中含有大量的漆酶，回收利用后可继续堆肥或制成饲料，既能提高菌渣的利用率，又能创造一定的经济价值。漆酶在制浆漂白、生物燃料、污染物的降解、绿色有机物的合成、食品工业、生物传感器、生物监测方面应用广泛。
目前漆酶的获取主要是从漆树或微生物的发酵液中获取，生产量比较有限，生产成本较高，目前还没有从杏鲍菇菌渣中提取漆酶的方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种原料廉价且丰富，获取漆酶途径简单的方法，提高杏鲍菇菌渣的利用率，扩大了漆酶的获取途径。
具体的，本发明从杏鲍菇菌渣中提取漆酶的方法，按照如下步骤进行：
s1：原料预处理
选取刚收获子实体的新鲜菌渣或阴凉处放置3天以内的菌渣，将菌渣进行粉碎，过4～10目筛；
s2：提取粗酶液
向粉碎后的菌渣中加入浸提液，浸泡12～36h，过滤除去固体，4000～5000r/min离心5～10min，收集上清液即为粗酶液；
所述浸提液为ph＝4.5～5.5的hac-naac缓冲溶液，按照料液比1g：5～10ml的比例添加；
s3：浓缩、纯化漆酶
用切向流超滤系统浓缩、纯化粗酶液，得到漆酶酶制剂，在2～4℃储存。
优选地，所述漆酶酶制剂进一步通过真空冷冻干燥，获得漆酶酶粉。
更优选地，s3中，采用切向流超滤系统浓缩的具体过程为：将粗酶液先用50kd的切向流超滤膜进行过滤，收集渗透液，再用30kd的切向流超滤膜浓缩渗透液，超滤浓缩20倍。
更优选地，所制得的漆酶酶制剂或漆酶酶粉呈褐色，可溶于水，漆酶蛋白比活力为8000-10000u/g，温度20-60℃，酶活力稳定；室温下，ph值在4.0～6.6范围内的酶活力变化小于15％。
本发明所采用的技术方案，具有如下有益效果：
(1)以刚收获子实体的新鲜菌渣或阴凉处放置3天以内的菌渣为原料，进行提取，原料廉价且丰富，获取途径简便，扩展了漆酶的来源，提高废弃物菌渣的利用率。
(2)菌渣粉碎后采用ph＝4.5～5.5的hac-naac缓冲溶液浸提，即可获得漆酶，简单易行，操作简便，可大规模提取。
(3)采用切向流超滤系统浓缩、纯化粗酶液，能够有效截获漆酶蛋白分子，去除杂蛋白，有利于连续化操作，提高漆酶蛋白比活力。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明通过杏鲍菇菌渣获得漆酶，不仅扩展了漆酶的获取途径，还实现了杏鲍菇菌渣的高效利用，下面就以具体的示例对本发明的技术方案进行详细的描述。需要说明的是，下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，未注明的实验材料来源均为市售，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
实施例1
本实施例一种从杏鲍菇菌渣中提取漆酶的方法，具体过程如下：
选取刚收获子实体的新鲜菌渣，将这些菌渣进行粉碎，过4目左右筛；然后向粉碎后的菌渣中加入浸提液，所用浸提液为ph＝4.5～5.5的hac-naac缓冲溶液，按照料液比1g：5ml添加，浸泡24h后，过滤除去固体，4800r/min离心10min，收集上清液即为粗酶液，该方法简单，浸提率高，且便于后续收集粗酶液。接着采用切向流超滤系统对粗酶液进行浓缩，由于漆酶的分子量大概在120kd左右，所以将粗酶液先用50kd的切向流超滤膜进行过滤，截留掉一些大分子杂质，收集渗透液，再用30kd的切向流超滤膜浓缩渗透液，超滤浓缩20倍后，得到褐色的浓缩酶制剂，酶制剂2-4℃储存。
在这里我们之所以采用切向流超滤系统对粗酶液进行浓缩，是因为切向流超滤系统可用于低至10毫升、高达数千升样品的浓缩、洗滤(脱盐及缓冲液置换)以及利用尺寸大小分离生物分子，用切向流超滤能够有效截获漆酶蛋白分子，去除杂蛋白，提高漆酶蛋白比活力。这样连续高效流水线化去除粗酶液中的杂质和杂蛋白纯化浓缩酶液的方式，便于工业化操作。
下面我们以abts(2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)为底物，测定上述方法获得的漆酶酶活，在这里，酶活单位定义为适宜条件下单位时间生成产物的微摩尔数(u/g/min)。
漆酶酶活测定的具体过程为：取浓缩酶制剂，测定漆酶酶活，以abts(2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)为底物，每分钟氧化1微摩尔abts底物所需要的酶量定义为1个酶活单位(u)。在1毫升反应体系中，底物abts终浓度为1毫摩尔/升，其中含有100毫摩尔/升ph值为4.5的乙酸钠缓冲液880微升，100微升abts和20微升浓缩酶制剂，整个反应体系在30℃下反应5分钟，在420nm下测定其吸光度的变化。酶活力按以下公式计算：其中a1为空白对照吸光值；a2为反应后吸光值；t为反应时间；ε为底物abts的摩尔吸光系数，为3.6×104m-1cm-1。
测定得到上述浓缩酶制剂的比活力为9700u/g，温度20-60℃下的酶活力稳定；室温下，ph值在4.0～6.6范围内的酶活力变化小于15％。
实施例2
本实施例一种从杏鲍菇菌渣中提取漆酶的方法，具体过程如下：
选取阴凉处放置3天以内的菌渣，将这些菌渣进行粉碎，过10目左右筛；然后向粉碎后的菌渣中加入浸提液，所用浸提液为ph＝4.5～5.5的hac-naac缓冲溶液，按照料液比1g：10ml添加，浸泡12h后，过滤除去固体，5000r/min离心5min，收集上清液即为粗酶液。接着采用切向流超滤系统对粗酶液进行浓缩，将粗酶液先用50kd的切向流超滤膜进行过滤，截留掉一些大分子杂质，收集渗透液，再用30kd的切向流超滤膜浓缩渗透液，超滤浓缩20倍后，得到的浓缩液通过真空冷冻干燥获得漆酶酶粉。
进一步地，我们对上述方法得到的漆酶酶粉进行表征，酶粉为褐色粉末，可溶于水，比活力为8200u/g，温度20-60℃下的酶活力稳定；室温下，ph值在4.0～6.6范围内的酶活力变化小于10％。
实施例3
本实施例一种从杏鲍菇菌渣中提取漆酶的方法，具体过程和实施例相同，不同之处仅在于：菌渣与浸提液的料液比为1g：8.2ml，浸泡36h。
上述方法得到的漆酶酶粉的表征结果如下：比活力为9400u/g，温度20-60℃下的酶活力稳定；室温下，ph值在4.0～6.6范围内的酶活力变化小于11.7％。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例1～3相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。