本发明涉及本发明涉及一种利用制备超高纯度乳酸链球菌素的方法，尤其是可以利用此方法制备药品级高纯度乳酸链球菌素。
背景技术：
乳酸链球菌素(英文名称nisin)亦称乳酸链球菌肽，是乳酸链球菌产生的一种多肽物质，由34个氨基酸残基组成，分子量约为3500da。由于nisin可抑制大多数革兰氏阳性细菌，如肉毒梭菌、金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、利斯特氏菌，并对芽孢杆菌的芽孢有强烈的抑制作用，因此被作为食品防腐剂广泛应用于食品行业。通常，产芽孢的细菌耐热性很强，如鲜乳采用135℃、2秒超高温瞬时灭菌，非芽孢细菌的死亡率为100％，芽孢细菌的死亡率90％，还有10％的芽孢细菌不能杀灭。若鲜乳中添加0.03-0.05g/kgnisin就可抑制芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌孢子的发芽和繁殖。根据研究结果表明，乳酸链球菌素的抗菌作用是通过干扰细胞v膜的正常功能，造成细胞膜的渗透，养分流失和膜电位下降，从而导致致病菌和腐败菌细胞的死亡。
nisin作为新型的高效、无毒、安全的天然食品防腐剂，进入人体后被机体蛋白酶消化分解为氨基酸，被机体吸收利用，并且不影响肠道内正常菌群的生命活动，是当今食品行业中保鲜防腐，延长货架期的绝对良品。除此之外，nisin在医疗卫生领域也有很大的应用前景，高纯度的nisin对治疗牙周炎、乳腺炎和皮肤感染有很好的疗效。也有研究表明nisin对口腔癌、头颈部等癌细胞起到抑制作用。还有研究揭示了nisin对耐药性革兰氏阳性细菌(如mrsa)感染具有有效的治疗作用。然而，目前市售的nisin纯度较低(仅为2.5％～10％)，且含有较多的杂蛋白，进入机体后可能会引起某些不良反应，影响了其在医疗领域的应用和推广。因此，如何获取高纯度的nisin是研究者关注的重点和热点。
目前，工业上nisin主要是采用发酵法生产，然后从发酵液中提取nisin，提取方法主要有吸附法、盐析法、膜过滤法、有机溶剂法、泡沫分离法和双水相萃取法等。吸附法是在发酵液中加入固体吸附剂如大孔树脂或者利用菌体细胞自身吸附乳酸链球菌素，解吸后将解吸液盐析或喷雾干燥，制成粉末状食品级nisin产品；膜过滤法首先用无机膜或管式膜从发酵液中除去菌体和固体等相对分子质量比乳酸链球菌素大的物质，再采用卷式膜超滤从发酵液中除去相对分子质量比乳酸链球菌素小的物质，得到发酵液浓缩物，最后加入固体食盐，经喷雾干燥制得食品级nisin，产品中食盐含量为10％～50％；有机溶剂法主要采用正丙醇和丙酮，将一定量正丙醇加入nacl饱和的预处理后发酵液中，离心，上清液加入丙酮沉淀，冷冻干燥即得nisin粉末。
琼脂糖凝胶是由β-d-半乳糖和3,6-脱水-l-半乳糖交替结合所形成的线性多聚糖。琼脂糖凝胶层析，是使待分离物质通过琼脂糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。混合物的分离程度主要决定于凝胶颗粒内部微孔的孔径和混合物相对分子质量的分布范围。和凝胶孔径有直接关系的是凝胶的交联度。凝胶孔径决定了被排阻物质相对分子质量的下限。移动缓慢的小分子物质，在低交联度的凝胶上不易分离，大分子物质同小分子物质的分离宜用高交联度的凝胶。
目前应用最广、分辨率最高的多肽分离纯化方法是反相高效液相色谱法，常作为天然活性多肽或人工合成多肽的最终纯化步骤，但反相色谱介质对极性较强的多肽分子选择性差，难以形成足够的吸附保留，而且样品载量有限，填料成本高，重复利用率低，限制了生产规模。
亲水相互作用色谱能够为多肽分离纯化提供一种与反相色谱不同的选择性，对极性较强的多肽分子能够形成较强的吸附保留，而挥发性流动相便于从多肽产品中去除，也有利于与质谱等检测分析手段的兼容。亲水相互作用色谱的介质亲水性较强，因此不易造成生物活性分子的变性，生物相容性好。但目前绝大多数亲水相互作用色谱介质以硅胶为基本框架结构，对流动相和样品的ph值范围有限定，有些不能在偏碱或偏酸的环境下使用，有些不能分离碱性或酸性化合物。
琼脂糖凝胶中性亲水，非特异性吸附低，成胶性能好，容易形成具有开放纤维结构的多孔球状颗粒，表面丰富的轻基便于交联和配基衍生，交联后刚性增强，易于规模放大，且化学稳定性提高，可采用强酸强碱进行原位清洗与再生。以往在中药多酚类化合物分离纯化的研究中发现，某些琼脂糖凝胶介质在亲水相互作用色谱的流动相条件下，对极性小分子化合物能够产生以氢键吸附为主的亲水吸附，因此有望拓展其应用领域，使其成为亲水相互作用色谱介质，用于极性小分子肽类化合物的分离纯化。
技术实现要素：
本发明是为了解决目前生产上利用常规提取方法制备nisin纯度不高，无法为制备医药级超高纯度nisin提供有效纯化工艺技术而提出的。
本发明的一种利用琼脂糖凝胶亲和层析色谱提取医药级超高纯度乳酸链球菌素的方法，它是按照以下步骤进行：
以生物效价≥15000iu/mg的乳酸链球菌素粗制半成品为原料，再经过琼脂糖凝胶亲和色谱层析柱进行乳酸链球菌素纯化，最后经过冷冻干燥制成超高纯度乳酸链球菌素纯品；
其中，生物效价≥15000iu/mg的乳酸链球菌素粗制半成品的制备方法如下：
一、利用陶瓷膜对乳酸链球菌素最终发酵活力≥8500iu/ml的发酵液进行固液分离，分离得到清液进行下一步处理；其中，分离前发酵液的ph预先调至2.5，并在70℃下恒速搅拌30min；
二、利用孔径不同的两级膜对上步骤得到的清液进行第一级和第二级的分离和浓缩，第一级分离后浓缩倍数为4～8倍，第二级分离后浓缩倍数为8～14倍，得到的浓缩液进行下一步处理；所述的两级膜为卷式超滤膜，其中，第一级膜孔径为10000～100000；第二级膜孔径为1000～10000；
三、利用竹制或椰壳制颗粒状活性炭对上述一次浓缩液进行脱色处理，得到脱色后浓缩液；
四、利用泡沫分离法对步骤三得到的脱色后浓缩液进行乳酸链球菌素的二次浓缩分离，在泡沫分离过程中以2～6个碳原子数的食品级分析纯正烷醇对泡沫进行消泡处理，得到的消泡浓缩液加入0.5～1.5倍体积的相同的正烷醇，在转速为10～50转/min的条件下搅拌30～60min，静置12～24h，待沉淀完全后进行下一步离心处理；
五、利用三项转鼓离心分离机对上步得到的消泡浓缩液进行离心浓缩，离心转速为8000～12000r/min，离心时间为5～10min，离心后收集固相物即为乳酸链球菌素粗制半成品原料，其生物效价≥15000iu/mg，水分含量为10％～30％；
所述的经过琼脂糖凝胶亲和色谱层析柱进行乳酸链球菌素纯化的操作步骤为：
一、用ph为2.50～3.50的平衡缓冲液，以0.001～0.100l/min的流速对琼脂糖凝胶亲和层析色谱柱进行柱平衡，当流出液的ph与平衡缓冲液的ph相同时停止柱平衡；
二、取生物效价≧15000iu/mg的乳酸链球菌素粗制半成品，溶解于平衡缓冲液中，配制成浓度为1.0～50.0g/l的样品走柱液，在经过步骤一柱平衡后的琼脂糖凝胶色谱柱上对样品走柱液进行走柱处理以吸附乳酸链球菌素分子，当流出液中的乳酸链球菌素的生物效价≧50iu/ml，则琼脂糖凝胶层析色谱吸附达到饱和；
三、乳酸链球菌素走样吸附达到饱和后，再用平衡缓冲液顶柱，清除柱层空隙中没有完全被吸附的样品走柱液，当流出液的ph与平衡缓冲液的ph相同时，停止顶柱处理；
四、用ph在2.00～3.00之间的洗脱液对步骤三处理后的琼脂糖凝胶亲和层析色谱柱进行分离产物洗脱，以0.001～0.100l/min的流速对色谱柱进行柱洗脱，在洗脱过程中分三段对洗脱液进行收集：第一段为光吸收130以下收集，第二段为光吸收130到峰值再降到80之间收集，第三段为光吸收80到20之间收集，当流出液的ph与洗脱液相同时停止洗脱；
其中，平衡缓冲液是酸与钠盐的混合溶液，平衡缓冲液中的酸的浓度为0.04～0.14mol/l，钠盐的浓度为0.04～0.14mol/l；
其中，洗脱液是酸与钠盐和氯盐的混合溶液，洗脱液中酸的浓度为0.02～0.12mol/l，钠盐的浓度为0.02～0.12mol/l，氯盐的浓度为0.1mol/l。
本发明包含以下有益效果：
常规提取方法包括陶瓷膜固液分离、泡沫分离或有机膜浓缩、盐析、沉淀、ph2.5酸水稀释、喷雾干燥等工艺，生产出来的nisin生物效价≧900iu/ml,本发明方案中的关键步骤是琼脂糖凝胶亲和层析色谱，对生物效价≧15000iu/毫克的nisin粗制半成品进行纯化分离，经过样品溶液处理、样品琼脂糖凝胶色谱柱走样吸附、洗脱、强酸沉淀、丙酮洗涤、冷冻干燥和胶体磨研磨，可以生产纯度大于等于98％，生物效价大于等于39200iu/毫克的高纯度乳酸链球菌素，在医药级生产条件下可以生产医用级别的高纯度nisin原料。本发明与传统技术制备的普通食品级nisin相比，纯度提高了约43.5倍。
本发明制得的乳酸链球菌素纯度≧98％的，活力≧39000iu/mg的医药级高纯度乳酸链球菌素产品。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种利用琼脂糖凝胶亲和层析色谱提取医药级超高纯度乳酸链球菌素的方法，它是按照以下步骤进行：
以生物效价≥15000iu/mg的乳酸链球菌素粗制半成品为原料，再经过琼脂糖凝胶亲和色谱层析柱进行乳酸链球菌素纯化，最后经过冷冻干燥制成超高纯度乳酸链球菌素纯品；
其中，生物效价≥15000iu/mg的乳酸链球菌素粗制半成品的制备方法如下：
一、利用陶瓷膜对乳酸链球菌素最终发酵活力≥8500iu/ml的发酵液进行固液分离，分离得到清液进行下一步处理；其中，分离前发酵液的ph预先调至2.5，并在70℃下恒速搅拌30min；
二、利用孔径不同的两级膜对上步骤得到的清液进行第一级和第二级的分离和浓缩，第一级分离后浓缩倍数为4～8倍，第二级分离后浓缩倍数为8～14倍，得到的浓缩液进行下一步处理；所述的两级膜为卷式超滤膜，其中，第一级膜孔径为10000～100000；第二级膜孔径为1000～10000；
三、利用竹制或椰壳制颗粒状活性炭对上述一次浓缩液进行脱色处理，得到脱色后浓缩液；
四、利用泡沫分离法对步骤三得到的脱色后浓缩液进行乳酸链球菌素的二次浓缩分离，在泡沫分离过程中以2～6个碳原子数的食品级分析纯正烷醇对泡沫进行消泡处理，得到的消泡浓缩液加入0.5～1.5倍体积的相同的正烷醇，在转速为10～50转/min的条件下搅拌30～60min，静置12～24h，待沉淀完全后进行下一步离心处理；
五、利用三项转鼓离心分离机对上步得到的消泡浓缩液进行离心浓缩，离心转速为8000～12000r/min，离心时间为5～10min，离心后收集固相物即为乳酸链球菌素粗制半成品原料，其生物效价≥15000iu/mg，水分含量为10％～30％；
所述的经过琼脂糖凝胶亲和色谱层析柱进行乳酸链球菌素纯化的操作步骤为：
一、用ph为2.50～3.50的平衡缓冲液，以0.001～0.100l/min的流速对琼脂糖凝胶亲和层析色谱柱进行柱平衡，当流出液的ph与平衡缓冲液的ph相同时停止柱平衡；
二、取生物效价≧15000iu/mg的乳酸链球菌素粗制半成品，溶解于平衡缓冲液中，配制成浓度为1.0～50.0g/l的样品走柱液，在经过步骤一柱平衡后的琼脂糖凝胶色谱柱上对样品走柱液进行走柱处理以吸附乳酸链球菌素分子，当流出液中的乳酸链球菌素的生物效价≧50iu/ml，则琼脂糖凝胶层析色谱吸附达到饱和；
三、乳酸链球菌素走样吸附达到饱和后，再用平衡缓冲液顶柱，清除柱层空隙中没有完全被吸附的样品走柱液，当流出液的ph与平衡缓冲液的ph相同时，停止顶柱处理；
四、用ph在2.00～3.00之间的洗脱液对步骤三处理后的琼脂糖凝胶亲和层析色谱柱进行分离产物洗脱，以0.001～0.100l/min的流速对色谱柱进行柱洗脱，在洗脱过程中分三段对洗脱液进行收集：第一段为光吸收130以下收集，第二段为光吸收130到峰值再降到80之间收集，第三段为光吸收80到20之间收集，当流出液的ph与洗脱液相同时停止洗脱；
其中，平衡缓冲液是酸与钠盐的混合溶液，平衡缓冲液中的酸的浓度为0.04～0.14mol/l，钠盐的浓度为0.04～0.14mol/l；
其中，洗脱液是酸与钠盐和氯盐的混合溶液，洗脱液中酸的浓度为0.02～0.12mol/l，钠盐的浓度为0.02～0.12mol/l，氯盐的浓度为0.1mol/l。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：所述的平衡缓冲液为柠檬酸与柠檬酸钠的混合溶液、苹果酸与苹果酸钠的混合溶液、磷酸与磷酸钠的混合溶液、硫酸与硫酸钠的混合溶液、乳酸与乳酸钠的混合溶液或盐酸与氯化钠的混合溶液。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：所述的洗脱液为柠檬酸与柠檬酸钠的混合溶液、苹果酸与苹果酸钠的混合溶液、磷酸与磷酸钠的混合溶液、硫酸与硫酸钠的混合溶液、乳酸与乳酸钠的混合溶液或盐酸与氯化钠的混合溶液。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：所述的氯盐为licl、nacl或kcl。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：走柱液在走柱之前需进行离心、过滤和抽气处理。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：在经过冷冻干燥制成超高纯度乳酸链球菌素纯品之前，需将经过琼脂糖凝胶亲和色谱层析柱纯化后的乳酸链球菌素，进行酸沉淀后离心、洗涤处理。其它组成和连接方式与具体实施方式一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：在进行酸沉淀后离心、洗涤处理后的乳酸链球菌素进行冷冻干燥制成超高纯度乳酸链球菌素纯品，具体操作如下：
一、将收集到的洗脱液，按照其体积的12％～20％添加配制好的强酸溶液，在转速为10～50转/min的条件下搅拌30～120min，静止沉淀12～24h；
二、将上述沉淀后的液体在0～4℃温度下离心10min，转速为6000～12000rpm，离心后弃去上清液；
三、将上述离心得到的沉淀加入含有质量体积百分含量为12％～20％三氯乙酸的丙酮，将沉淀完全打散，在0～4℃温度下离心10～30min，转速为6000～12000rpm，离心后弃去上清液，收集沉淀；
四、用1～2倍体积的丙酮清洗步骤三的沉淀2～3次；
五、将处理清洗后的沉淀放入冷冻干燥机中，在-40℃～-20℃条件下进行冷冻干燥，冻干10～20h；
六、将冻干后的沉淀用胶体磨研磨成粉，然后进行生物效价的检测，放置在低温冰箱中保存，即制得超高纯度乳酸链球菌素纯品；其中，所述的强酸溶液浓度为30％～60％。
其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同点在于：强酸为三氟乙酸、二氟乙酸、一氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸、三溴乙酸、二溴乙酸或一溴乙酸。其它与具体实施方式一相同。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例一：
本实施例的一种利用琼脂糖凝胶亲和层析色谱提取超高纯度乳酸链球菌素的方法，它是按照以下步骤进行：
1、取下罐时生物效价为9236iu/ml的nisin发酵液100.0l，用盐酸调节ph至2.5，70℃下恒速搅拌30min，用小型陶瓷膜对发酵菌体进行固液分离。固液分离后，收集得到陶瓷膜过滤清液体积为101.5l，经测定此次过滤清液的nisin效价为9070iu/ml。此步的回收率为99.68％。
2、对上步获得的陶瓷膜过滤清液进行两级卷式超滤膜过滤提纯和浓缩。第一级采用膜分子量为80000的卷式超滤膜，浓缩约5倍后得到一级浓缩液体积为20.2l，测定一级浓缩液的nisin效价为45235iu/ml。这一步的回收率为99.25％。
3、第二级采用膜分子量为5000的有机卷式超滤膜，将一级浓缩液继续浓缩约2.1倍后得到二级浓缩液体积为9.59l(二级浓缩后与陶瓷膜过滤清液相比共浓缩了约10.6倍)，测定二级浓缩液的效价为92328iu/ml。这一步的回收率为96.90％。得到的二级浓缩液进行下一步处理。
4、利用竹制颗粒状活性炭对上述二级浓缩液进行脱色处理，得到脱色后浓缩液9.55l，脱色后二级浓缩脱色液效价为85038iu/ml。这一步的回收率为91.72％；
5、利用泡沫分离法对上述步骤得到的二级浓缩脱色液进行nisin的二次浓缩分离，在泡沫分离过程中以食品级正丙醇对泡沫进行消泡处理，得到的消泡浓缩液的总体积为4.22l，消泡浓缩液的生物效价为168927iu/ml。这一步的回收率为87.78％。
6、向上步获得的消泡浓缩液中加入75％体积的正丙醇，可以看到分离的到的多肽及少量杂质蛋白会出现明显的细絮状沉淀。然后利用三项转鼓离心分离机对上述得到的细絮状沉淀连同浓缩液一齐进行离心分离，离心转速为10000r/min，离心时间为10min，离心后收集固相物质量41.74g(水分含量为19％)，即为nisin粗制半成品原料，其生物效价为18830iu/mg。至这一步总回收率为85.10％。
7、用ph＝2.80的平衡缓冲液(0.06mol/l的柠檬酸与0.06mol/l的柠檬酸钠混合溶液)以0.06l/min的流速对琼脂糖凝胶亲和层析色谱柱进行柱平衡，当流出液的ph＝2.80时停止进平衡液，柱平衡结束。
8、取步骤6中制得的效价为18830iu/mg的nisin粗制半成品，溶解于上述平衡液中，配制成3.7g/l的样品走柱液溶液，该溶液在走柱之前经过充分地离心、过滤和抽气，然后以0.012l/min的流速经过柱平衡后的琼脂糖凝胶色谱柱上对样品走柱液进行走柱处理以吸附nisin分子，利用hplc每隔2h测定一次nisin含量，当流出液中的nisin的含量达到90iu/ml时，便可以停止进样吸附。
9、nisin走样吸附达到饱和后，再用2倍柱层床体积的平衡液顶柱，清除柱层空隙中没有完全被吸附的样品走柱液。
10、用ph＝2.50的洗脱液以0.018l/min的流速对吸附nisin饱和了的琼脂糖凝胶亲和层析色谱柱进行洗脱，在洗脱过程中分三段对洗脱液进行收集(利用上海嘉鹏科技有限公司生产的hd-a电脑层析采集仪与核酸蛋白检测仪，并利用该仪器自带的分析软件在电脑上安装并在电脑上直接查看吸光值)，一般情况下第一段为光吸收130以下，第二段为光吸收130到峰值再降到80，第三段为光吸收80到20，当流出液的ph＝2.50时来判断是否可以停止；其中洗脱液可以是0.06mol/l的磷酸与其0.06mol/l的磷酸钠混合溶液，再按体积加入0.1mol/l的licl。
11、收集到的洗脱液，按照体积的18％添加配制好的三氯乙酸溶液，30转/min下搅拌40min，静止沉淀15h。
12、将上述沉淀好的液体在4℃温度下离心10min，转速为8000rpm，离心后弃去上清液。
13、将上述离心得到的沉淀加入含有18％三氯乙酸的丙酮，将沉淀完全打散，在4℃温度下离心15min，转速为8000rpm，离心后弃去上清液。
14、用2倍体积的丙酮清洗上述沉淀2～3次。
15、将上述洗涤好的沉淀放入冷冻干燥机中，在-35℃条件下进行冷冻干燥，冻干14h。这步结束后，得到18.1068g浅灰褐色的干燥沉淀。
16、将冻干后的沉淀用低温胶体磨研磨成粉，得到18.0004g浅灰褐色高纯度nisin粉末，生物效价测定后结果为39968iu/mg，产品纯度为99.92％，至此步结束总回收率为78.41％。
实施例二：
本实施例的一种利用琼脂糖凝胶亲和层析色谱提取超高纯度乳酸链球菌素的方法，它是按照以下步骤进行：
1、取下罐时效价活力为9784iu/ml的nisin发酵液220.0l，用盐酸调节ph至2.5，70℃下恒速搅拌30min，用小型陶瓷膜对发酵菌体进行固液分离。固液分离后，收集得到陶瓷膜过滤清液体积为223.1l，经测定此次过滤清液的nisin效价为9575iu/ml。此步的回收率为99.24％
2、对上步获得的陶瓷膜过滤清液进行两级卷式超滤膜过滤提纯和浓缩。第一级采用膜孔径为50000的有机卷式超滤膜，浓缩约4.5倍后得到一级浓缩液体积为49.50l，测定一级浓缩液的nisin效价为43119iu/ml。这一步的回收率为99.16％。
3、第二级采用膜孔径为3000的有机卷式超滤膜，将一级浓缩液继续浓缩约2.5倍后得到二级浓缩液体积为19.80l(二级浓缩后与陶瓷膜过滤清液相比共浓缩了约11.3倍)，测定二级浓缩液的效价为105667iu/ml。这一步的总回收率为97.20％。得到的二级浓缩液进行下一步处理。
4、利用竹制颗粒状活性炭对上述二级浓缩液进行脱色处理，得到脱色后浓缩液19.75l，脱色后二级浓缩脱色液效价为100660iu/ml。这一步的回收率为92.36％；
5、利用泡沫分离法对上述步骤得到的二级浓缩脱色液进行nisin的二次浓缩分离，在泡沫分离过程中以食品级正丁醇对泡沫进行消泡处理，得到的消泡浓缩液的总体积为9.85l，消泡浓缩液的生物效价为194838iu/ml。这一步的回收率为89.16％。
6、向上步获得的消泡浓缩液中加入1倍体积的正丁醇，可以看到分离得到的多肽及少量杂质蛋白会出现明显的细絮状沉淀。然后利用三项转鼓离心分离机对上述得到的细絮状沉淀连同浓缩液一齐进行离心分离，离心转速为10000r/min，离心时间为15min，离心后收集固相物质量87.65g(水分含量为20％)，即为nisin粗制半成品原料，其生物效价为21186iu/mg。至这一步总回收率为86.27％。
7、用ph＝3.00的平衡缓冲液(0.05mol/l的乳酸与0.05mol/l的乳酸钠混合溶液)以0.058l/min的流速对琼脂糖凝胶亲和层析色谱柱进行柱平衡，当流出液的ph＝3.00时停止进平衡液，柱平衡结束。
8、取步骤6中制得的效价为21186iu/mg的nisin粗制半成品，溶解于上述平衡液中，配制成8.3g/l的样品走柱液溶液，该溶液在走柱之前经过充分地离心、过滤和抽气，然后以0.006l/min的流速经过柱平衡后的琼脂糖凝胶色谱柱上对样品走柱液进行走柱处理以吸附nisin分子，利用hplc每隔2h测定一次nisin含量，当流出液中的nisin的含量达到121iu/ml时，停止进样吸附。
9、nisin走样吸附达到饱和后，再用2倍柱层床体积的平衡液顶柱，清除柱层空隙中没有完全被吸附的样品走柱液。
10、用ph＝2.50的洗脱液以0.014l/min的流速对吸附nisin饱和了的琼脂糖凝胶亲和层析色谱柱进行洗脱，在洗脱过程中分三段对洗脱液进行收集(利用上海嘉鹏科技有限公司生产的hd-a电脑层析采集仪与核酸蛋白检测仪，并利用该仪器自带的分析软件在电脑上安装并在电脑上直接查看吸光值)，一般情况下第一段为光吸收130以下，第二段为光吸收130到峰值再降到80，第三段为光吸收80到20，当流出液的ph＝2.50时来判断是否可以停止；其中洗脱液可以是0.06mol/l的乙酸与其0.06mol/l的乙酸钠混合溶液，再按体积加入0.1mol/l的kcl。
11、收集到的洗脱液，按照体积的15％添加配制好的三氯乙酸溶液，10转/min下搅拌60min，静止沉淀12h。
12、将上述沉淀好的液体在4℃温度下离心10min，转速为8000rpm，离心后弃去上清液。
13、将上述离心得到的沉淀加入含有20％三氯乙酸的丙酮，将沉淀完全打散，在4℃温度下离心15min，转速为8000rpm，离心后弃去上清液。
14、用2倍体积的丙酮清洗上述沉淀2次。
15、将上述洗涤好的沉淀放入冷冻干燥机中，在-40℃～-30℃条件下进行冷冻干燥，冻干12h。这步结束后，得到39.7825g浅灰褐色的干燥沉淀。
16、将冻干后的沉淀用低温胶体磨打磨成粉，得到39.7825g浅灰褐色高纯度nisin粉末，生物效价测定后结果为40128iu/mg，产品纯度为100.32％，至此步结束总回收率为74.17％。
实施例三：
本实施例的一种利用琼脂糖凝胶亲和层析色谱提取超高纯度乳酸链球菌素的方法，它是按照以下步骤进行：
1、取下罐时效价活力为12245iu/ml的nisin发酵液2300.0l，用盐酸调节ph至2.5，70℃下恒速搅拌30min，用陶瓷膜对发酵菌体进行固液分离。固液分离后，收集得到陶瓷膜过滤清液体积为2345.0l，经测定此次过滤清液的nisin效价为11988iu/ml。此步的回收率为99.82％。
2、对上步获得的陶瓷膜过滤清液进行两级卷式超滤膜过滤提纯和浓缩。第一级采用膜孔径为50000的有机卷式超滤膜，浓缩约5.0倍后得到一级浓缩液体积为469.0l，测定一级浓缩液的nisin效价为59920iu/ml。这一步的回收率为99.78％。
3、第二级采用膜孔径为3000的有机卷式超滤膜，将一级浓缩液继续浓缩约2.0倍后得到二级浓缩液体积为234.0l(二级浓缩后与陶瓷膜过滤清液相比共浓缩了约10.1倍)，测定二级浓缩液的效价为118897iu/ml。这一步的总回收率为98.78％。得到的二级浓缩液进行下一步处理。
4、利用竹制颗粒状活性炭对上述二级浓缩液进行脱色处理，得到脱色后浓缩液230.0l，脱色后二级浓缩脱色液效价为113567iu/ml。这一步的回收率为92.75％；
5、利用泡沫分离法对上述步骤得到的二级浓缩脱色液进行nisin的二次浓缩分离，在泡沫分离过程中以食品级正戊醇对泡沫进行消泡处理，得到的消泡浓缩液的总体积为121l，消泡浓缩液的生物效价为209838iu/ml。这一步的回收率为90.15％。
6、向上步获得的消泡浓缩液中加入1倍体积的正丁醇，可以看到分离得到的多肽及少量杂质蛋白会出现明显的细絮状沉淀。然后利用三项转鼓离心分离机对上述得到的细絮状沉淀连同浓缩液一齐进行离心分离，离心转速为10000r/min，离心时间为17min，离心后收集固相物质量1011.9g(水分含量为23％)，即为nisin粗制半成品原料，其生物效价为24039iu/mg。至这一步总回收率为86.37％。
7、用ph＝3.10的平衡缓冲液(0.05mol/l的乙酸与0.05mol/l的乙酸钠混合溶液)以0.019l/min的流速对琼脂糖凝胶亲和层析色谱柱进行柱平衡，当流出液的ph＝3.10时停止进平衡液，柱平衡结束。
8、取步骤6中制得的效价为24039iu/mg的nisin粗制半成品，溶解于上述平衡液中，配制成35.0g/l的样品走柱液溶液，该溶液在走柱之前经过充分地离心、过滤和抽气，然后以0.006l/min的流速经过柱平衡后的琼脂糖凝胶色谱柱上对样品走柱液进行走柱处理以吸附nisin分子，利用hplc每隔4h测定一次nisin含量，当流出液中的nisin的含量达到109iu/ml时，停止进样吸附。
9、nisin走样吸附达到饱和后，再用2.2倍柱层床体积的平衡液顶柱，清除柱层空隙中没有完全被吸附的样品走柱液。
10、用ph＝2.80的洗脱液以0.014l/min的流速对吸附nisin饱和了的琼脂糖凝胶亲和层析色谱柱进行洗脱，在洗脱过程中分三段对洗脱液进行收集(利用上海嘉鹏科技有限公司生产的hd-a电脑层析采集仪与核酸蛋白检测仪，并利用该仪器自带的分析软件在电脑上安装并在电脑上直接查看吸光值)，一般情况下第一段为光吸收130以下，第二段为光吸收130到峰值再降到80，第三段为光吸收80到20，当流出液的ph＝2.50时来判断是否可以停止；其中洗脱液可以是0.06mol/l的乙酸与其0.06mol/l的乙酸钠混合溶液，再按体积加入0.1mol/l的nacl。
11、收集到的洗脱液，按照体积的20％添加配制好的三氯乙酸溶液，20转/min转速搅拌50min，静止沉淀12h。
12、将上述沉淀好的液体在4℃温度下离心10min，转速为8000rpm，离心后弃去上清液。
13、将上述离心得到的沉淀加入含有20％三氯乙酸的丙酮，将沉淀完全打散，在4℃温度下离心15min，转速为9000rpm，离心后弃去上清液。
14、用1.5倍体积的丙酮清洗上述沉淀2次。
15、将上述洗涤好的沉淀放入冷冻干燥机中，在-38℃条件下进行冷冻干燥，冻干12h。这步结束后，得到39.7825g浅灰褐色的干燥沉淀。
16、将冻干后的沉淀用胶体磨打磨成粉，得到549.765g浅灰褐色高纯度nisin粉末，生物效价测定后结果为39999iu/mg，产品纯度为99.9975％，至此步结束总回收率为78.08％。