一种二次亲和层析法提取激肽释放酶原的方法及含激肽释放酶原的药物组合物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种二次亲和层析法提取激肽释放酶原的方法及含有激肽释放酶原的药物组合物，其特点在于优化原有亲和层析提取糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的洗脱条件，从中提取激肽释放酶原的收率为0.2%～0.4%。
【专利说明】一种二次亲和层析法提取激肽释放酶原的方法及含激肽释放酶原的药物组合物
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体地说涉及一种应用二次亲和层析提取激肽释放酶原的方法。
【背景技术】
[0002]激肽释放酶原是激肽释放酶的前体，激肽释放酶属于丝氨酸蛋白酶，它包括血浆型激肽释放酶和组织型激肽释放酶两种类型，均能使激肽原释放出一种多肽一一激肽，而激肽释放酶一激肽系统(kallikrein kinin system, KKS)是体内主要的降压系统之一，作为一个复杂的内源性多酶系统，参与调控心血管、肾脏、神经系统等的生理功能，与心脏病、肾病、炎症反应、癌症等疾病的发生有着密切关系。
[0003]近年来在心血管系统方面的研宄进展很快，许多临床研宄和基础实验已证实糖尿病、高血压、心力衰竭、心肌梗死及左心室肥厚等疾病的发生与KKS的活性降低有关。因而深入研宄KKS的作用为研宄心血管相关疾病的发病机制和治疗手段提供了又一新的途径。
[0004]本发明人自2008年开始对胰酶的生产工艺进行试验研宄，特别是在糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的生产过程中，不断探索，力求优化完善工艺参数，并且在原有工艺的基础上另辟蹊径，成功完成提取激肽释放酶原的工艺研宄，其收率为0.2%?0.4%，生产工艺稳定，质量可控。
【发明内容】
[0005]1、本发明提供了种应用二次亲和层析提取激肽释放酶原的方法，特别是采用优化原有亲和层析工艺，得到激肽释放酶原。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现:
一种二次亲和层析法提取激肽释放酶原的方法及含有激肽释放酶原的药物组合物，其特征在于:在通过对原有工艺的优化，提取所得激肽释放酶原收率为0.2%?0.4%。在发明技术方案中，其特征还在于所述提取工艺包括如下步骤:
O原料预处理
胰脏洗净后，立即浸入预先冰冻好的硫酸溶液中，骤然冷却，在零度左右保存。
[0007]2)蛋白浸渍提取
2.1)取预处理过的胰脏投入绞肉机中绞碎成胰浆(必要时应绞3次)，加入胰浆2倍量的冰冷硫酸，置冷室中，多次搅拌，浸渍提取。
[0008]2.2)浸渍物过滤后，滤渣再用I倍量的冰冷硫酸重复上述过程，再进行过滤，弃滤渣，合并2次滤液，加入硫酸铵，使硫酸铵浓度达到40%饱和度，冷室放置，过夜。
[0009]2.3)虹吸上清液，底层沉淀加入适量硅藻土作助滤剂，减压过滤，上清液和滤液合并，得提取液，加入硫酸铵，使硫酸铵浓度达到70%饱和度，冷室放置过夜。
[0010]3)分级沉淀 3.1)次日上层清液弃去，底层沉淀减压过滤至干，加入3倍于滤饼重的冰水使之溶解，重复用硫酸铵40%和70%饱和度分级沉淀；
3.2)将最后一次70%饱和度沉淀滤饼，加入1.5倍于滤饼重的冰水溶解，并加入0.5倍滤饼重量的饱和硫酸钱溶液。
[0011]4)—次亲和层析
4.1)用适量的0.01-0.3mol/L，PH5-10的Tris-HCL缓冲液平衡亲和层析快胶柱；
4.2)将混合液流经此柱，流速控制在l~5mL/min左右，得到含糜蛋白酶原的淋洗液；
4.3)平衡后，用0.l-5mol/L的NaCL溶液洗脱完全，得含胰蛋白酶原的淋洗液。
[0012]5) 二次亲和层析
5.1)用适量的0.01-0.3mol/L，PH3-8的醋酸盐缓冲液来平衡亲和层析快胶柱；
5.2)平衡后，用含0.l-3mol/L NaCl的0.01-0.3mol/L，PH3-8的醋酸盐缓冲液洗脱完全，流速控制在l~5mL/min左右，得含激肽释放酶原的洗脱峰。
[0013]6)结晶
6.1)将含激肽释放酶原的洗脱峰于-20°C冰箱中静置结晶22?24h ;
6.2)将结晶减压抽滤，干燥后得激肽释放酶原。
[0014]经核算，所得激肽释放酶原收率约为0.2%?0.4%。
[0015]与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是:
选用二次亲和层析提取激肽释放酶原，在稳定收率的前提下，其理化性质和生物活性也保持稳定，从而有利于下一步对激肽释放酶原进行精制，最终使激肽释放酶的各项指标均符合中国药典标准。更重要的是，通过工艺的不断改进和完善，特别是采用二次亲和层析优化原有工艺，激肽释放酶原收率0.2%?0.4%，节约成本，提高了经济效益。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，而不以任何方式限制。
[0017]实施例1 O原料预处理
胰脏洗净后，去掉脂肪、结缔组织等杂物，立即浸入预先冰冻好的硫酸溶液中，骤然冷却，在零度左右保存。
[0018]2)蛋白浸渍提取
2.1)将预处理过的胰脏投入绞肉机中绞碎成胰浆，称重后积满10kg投入反应罐，加入200L冰冷硫酸。置冷室中，每I?2h搅拌I次，浸渍提取24h。
[0019]2.2)浸渍物用粗滤袋(或二层纱布)过滤，滤干后，得到滤渣86kg。再用86L冰冷硫酸重复上述过程，再进行过滤，弃滤渣，合并2次滤液共270L，加入固体硫酸铵65.34kg,使硫酸铵浓度达到40%饱和度，冷室放置，过夜。
[0020]2.3)虹吸上清液，底层沉淀加入适量硅藻土作助滤剂，减压过滤，上清液和滤液合并，得提取液264L，加入固体硫酸铵54.12kg,使硫酸铵浓度达到70%饱和度，冷室放置过夜。
[0021]3)分级沉淀
3.1)次日上层清液弃去，底层沉淀减压过滤至干称重46.68kg，加入140L冰水使之溶解，重复用硫酸铵40%和70%饱和度分级沉淀；
3.2)取第二次70%饱和度沉淀滤饼9.6kg，加入14.4L冰水溶解，并加入4.8L饱和硫酸铵溶液。
[0022]4) 一次亲和层析
4.1)用80L 0.2mol/L，PH8的Tris-HCL缓冲液平衡亲和层析快胶柱；
4.2)将混合液19.2L流经此柱，流速控制在2mL/min左右，得到含糜蛋白酶原的淋洗液16.4L ；
4.3)平衡后，用36.8L 1.5mol/L的NaCL溶液洗脱，得含胰蛋白酶原的淋洗液37.4L。
[0023]5) 二次亲和层析
5.1)用40L的0.05mol/L, PH6的醋酸盐缓冲液来平衡亲和层析快胶柱；
5.2)平衡后，用含0.5mol/L NaCl的0.05mol/L, PH6的醋酸盐缓冲液洗脱完全，流速控制在4mL/min左右，得含激肽释放酶原的洗脱峰12.5L。
[0024]6)结晶
6.1)将含激肽释放酶原的洗脱峰于-20°C冰箱中静置结晶24h ;
6.2)将结晶减压抽滤，干燥后得激肽释放酶原0.32kg。
[0025]经核算，所得激肽释放酶原收率约为0.32%。
[0026]实施例2 O原料预处理
胰脏洗净后，去掉脂肪、结缔组织等杂物，立即浸入预先冰冻好的硫酸溶液中，骤然冷却，在零度左右保存。
[0027]2)蛋白浸渍提取
2.1)将预处理过的胰脏投入绞肉机中绞碎成胰浆，称重后积满10kg投入反应罐，加入200L冰冷硫酸。置冷室中，每I?2h搅拌I次，浸渍提取24h。
[0028]2.2)浸渍物用粗滤袋(或二层纱布)过滤，滤干后，得到滤渣88kg。再用88L冰冷硫酸重复上述过程，再进行过滤，弃滤渣，合并2次滤液共275L，加入固体硫酸铵66.55kg,使硫酸铵浓度达到40%饱和度，冷室放置，过夜。
[0029]2.3)虹吸上清液，底层沉淀加入适量硅藻土作助滤剂，减压过滤，上清液和滤液合并，得提取液268L，加入固体硫酸铵54.94kg,使硫酸铵浓度达到70%饱和度，冷室放置过夜。
[0030]3)分级沉淀
3.1)次日上层清液弃去，底层沉淀减压过滤至干称重48.67kg，加入146L冰水使之溶解，重复用硫酸铵40%和70%饱和度分级沉淀；
3.2)取第二次70%饱和度沉淀滤饼9.8kg，加入14.7L冰水溶解，并加入4.9L饱和硫酸铵溶液。
[0031]4)亲和层析
4.Dffl 82L 0.15mol/L，PH7的Tris-HCL缓冲液平衡亲和层析快胶柱；
4.2)将混合液19.6L流经此柱，流速控制在3mL/min左右，得到含糜蛋白酶原的淋洗液16.8L ；
4.3)平衡后，用38.5L lmol/L的NaCL溶液洗脱，得含胰蛋白酶原的淋洗液37.6L。
[0032]5) 二次亲和层析
5.1)用40L的0.05mol/L, PH6的醋酸盐缓冲液来平衡亲和层析快胶柱；
5.2)平衡后，用含0.5mol/L NaCl的0.05mol/L, PH6的醋酸盐缓冲液洗脱完全，流速控制在4mL/min左右，得含激肽释放酶原的洗脱峰16.6L。
[0033]6)结晶
6.1)将含激肽释放酶原的洗脱峰于-20°C冰箱中静置结晶24h ;
6.2)将结晶减压抽滤，干燥后得激肽释放酶原0.38kg。
[0034]经核算，所得激肽释放酶原收率为0.38%。
[0035]实施例3
将实施例2制备的胰激肽原酶60000单位、预胶化淀粉217g、微晶纤维素65g置混合机内，搅拌15分钟，再加入羟丙基甲基纤维素7.14g、硬脂酸镁0.34 g，缓缓均匀地加入混合机内搅拌，至颗粒形成，放入制粒机中制粒，中间体检验，合格后用高速旋转压片机制成10000片，片芯检验合格后按每公斤素片加入肠溶型薄膜包衣预混剂(黄色)0.12kg完成包肠溶衣工序。
[0036]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
【权利要求】
1.一种二次亲和层析法提取激肽释放酶原的方法及含有激肽释放酶原的药物组合物，应用亲和层析法对原有糜蛋白酶原和胰蛋白酶原提取工艺进行了研宄、改进，通过工艺参数的研宄、改进，特别是采用二次亲和层析从中提取激肽释放酶原。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述激肽释放酶原是通过以牛胰或猪胰等为原料，将原料依次经过预处理、蛋白浸渍提取、分级沉淀、一次亲和层析、二次亲和层析、结晶制备得到的。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述提取工艺包括如下步骤: (1)胰脏洗净后，立即浸入预先冰冻好的硫酸溶液保存； (2)将上述胰脏绞成胰浆，加入冰冷硫酸置于冷室中，搅拌后浸渍提取； (3)过滤，滤液中加入硫酸铵，冷室放置过夜后，减压过滤； (4 )经硫酸铵分级沉淀后得含激肽释放酶原、糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的混合液，经过一次亲和层析，分别得到含糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的淋洗液； (5)经过第二次亲和层析，得到含激肽释放酶原的洗脱峰； (6)将含激肽释放酶原的洗脱峰于_20°C冰箱中静置结晶，减压抽滤，得激肽释放酶原。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，胰脏在绞碎前，始终在冰冷的硫酸溶液中保存。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述硫酸溶液的浓度均0.0125mol/Lo
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，为了更好的提取蛋白，硫酸铵沉淀可反复进行。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于:所述亲和层析快胶柱包括:DEAE_Sepharose2B FFjDEAE-Sepharose 4B FFjDEAE-Sepharose 6B FF， DEAE-Sepharose CL-2BFFj DEAE-Sepharose CL-4B FFj DEAE-Sepharose CL-6B FF0
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于:所述一次亲和层析条件为:平衡液选用0.01-0.2mol/L，PH5-10的Tris-HCL缓冲液，流速控制在l~5mL/min左右，洗脱液选用0.l-5mol/L 的 NaCL 溶液。
9.如权利要求3所述的方法，其特征在于:所述二次亲和层析条件为:平衡液选用0.01-0.3mol/L，PH3-8的醋酸盐缓冲液，流速控制在l~5mL/min左右，洗脱液选用含0.l-3mol/L NaCl 的 0.01-0.3mol/L，PH3-8 的醋酸盐缓冲液。
10.如权利要求1?6所述的方法，其特征在于:所得激肽释放酶原的收率为0.2%?0.4%。
11.一种药物组合物，其含有根据权利要求1-10制备的激肽释放酶原作为活性成分，还含有预胶化淀粉、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素、硬脂酸镁及肠溶型薄膜包衣预混剂(黄色)。
【文档编号】A61P9/12GK104498462SQ201410807948
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月23日 优先权日:2014年12月23日
【发明者】刘乃山, 林晓磊, 刘翠珍 申请人:青岛康原药业有限公司