基于双链探针的液相杂交捕获试剂盒、洗涤试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，涉及基因组测序文库杂交捕获试剂盒、洗涤试剂盒以及它们在液相杂交捕获中的应用。

背景技术：

20世纪初诞生了新一代测序技术(nextgenerationsequencing，ngs)，这一技术的出现为dna测序技术领域带来了突飞猛进的进展。与一代测序技术相比，二代测序技术具有高通量、高准确性的技术特点，可对数以亿计的dna片段同时进行测序。与传统的sanger法测序相比ngs测序成本大大降低。但全基因组测序成本仍然较高，且许多研究应用并不需要全基因组测序，而对于一个或多个样本的目标区域测序的需求较为迫切，因此对目标区域有针对性地测序方法能够显著地降低测序成本，同时也能缩短测序时间和生物信息分析周期。目标序列捕获技术的出现，满足了上述需求。目标序列捕获测序是针对已知的特定基因组区域设计探针捕获后进行测序，在靶向富集过程中不感兴趣的dna片段会被最大限度的去除，使得测序所产生的结果主要集中于感兴趣的目标区域。目前常用的序列捕获方法有：pcr法、分子倒置探针法(molecularinsersionprobe，mip)和杂交捕获法。pcr法具有高灵敏性、高特异性和重复性好等优点，不过这种方法并不能很容易扩大目标区域，适合捕获一些很小的区域，且部分区域扩增困难，针对突变频率较低的体细胞突变检测灵敏度不够等问题没有很好的解决办法。分子倒置探针法具有样品前期处理简单、样品需求量小等优点，然而其分子探针合成成本较高，均一性较差，难以对一些区域较大的基因组序列进行捕获。杂交捕获法通过目标dna片段和已带有生物素标记探针特异性杂交方式将目标序列捕获和分离出来。这一技术在二代测序平台中应用较为广泛，尤其是液相杂交捕获方法在目标区域捕获技术领域有着独有的优势。液相杂交捕获技术可以克服上述pcr法和分子倒置探针法的问题，具有更好的捕获效率，更少的偏好性，更高的检测灵敏度，更简便的操作和适合的成本等优点。

液相杂交捕获技术中高效的捕获效率及高准确性主要取决于三个方面：1.探针的准确性及特异性；2.杂交缓冲液环境及杂交条件；3.杂交后的洗涤缓冲液环境及洗涤条件。高准确度及高特异性的生物亲和素标记探针是高杂交准确性的保证，本领域现有的探针合成技术已能够达到该水平，如idt公司的探针合成技术。而找到一种高效的杂交缓冲液、杂交条件及洗涤缓冲液及洗涤方法显得尤为重要，这一环节是有效提高杂交效率，提高捕获准确性，简化实验流程及降低成本的主要瓶颈及限速步骤。

因此，基于以上研究成果及技术特点，开发一种高效的、准确度高的、低成本的液相杂交捕获试剂及方法较为迫切，以满足对靶向测序日益增长的要求。

技术实现要素：

本发明涉及用于双链核酸杂交及洗涤的新型组合物、相关试剂盒以及杂交洗涤方法。这些组合物和方法与传统过程相比，能够更快、更高效、捕获效果更好地完成基因组dna的靶标区域富集。

本发明的一个方面在于提供一种基因组测序文库杂交捕获试剂盒，其包括2×浓度溶液以及100％去离子甲酰胺，

其中，所述2×浓度溶液包含100-150mm的磷酸二氢钠、4×柠檬酸钠缓冲液、1-3mm的乙二胺四乙酸、2×denhardt溶液、2-5mg/ml的carrierrna及15-20w/w％的硫酸葡聚糖，

其中，所述4×柠檬酸钠溶液包含0.6m氯化钠、0.06m柠檬酸钠，ph7.0；并且

所述2×denhardt溶液包含0.04％聚蔗糖400、0.04％聚乙烯吡咯烷酮以及0.04％牛血清蛋白。

优选地，所述4×柠檬酸钠溶液由20×柠檬酸钠溶液稀释5倍配制得到，所述20×柠檬酸钠溶液包含3m氯化钠、0.3m柠檬酸钠，ph7.0；并且

所述2×denhardt溶液由50×denhardt溶液稀释25倍配制得到，所述50×denhardt溶液包含1％聚蔗糖400、1％聚乙烯吡咯烷酮以及1％牛血清蛋白。

在一个优选的实施方式中，所述2×浓度溶液包含100mm的磷酸二氢钠、4×柠檬酸钠缓冲液、2mm的乙二胺四乙酸、2×denhardt溶液、2mg/ml的carrierrna及20w/w％的硫酸葡聚糖。

本发明的又一方面提供一种上述基因组测序文库杂交捕获试剂盒的使用方法，其包括以下步骤：

将所述2×浓度溶液与所述100％去离子甲酰胺以及探针溶液按照以下条件混合：

所述2×浓度溶液在最终溶液中被稀释一倍，并且

去离子甲酰胺在最终溶液中的浓度为20-50v/v％。

再一方面，本发明提供了一种基因组测序文库杂交捕获溶液，其通过上述使用方法获得。

又一方面，本发明提供一种用于基因组测序文库杂交捕获后的洗涤溶液试剂盒，其包括以下5种洗涤缓冲液组分：

1)stringent洗涤溶液：2×柠檬酸钠缓冲液，30％v/v％去离子甲酰胺；

2)洗涤溶液i：2×柠檬酸钠溶液，0.1％十二烷基硫酸钠(sds)；

3)洗涤溶液ii：2×柠檬酸钠溶液；

4)洗涤溶液iii：0.2×柠檬酸钠溶液；以及

5)链霉亲和素磁珠洗涤溶液：10mmtris-hclph7.5-8.0，1mmedta以及2mnacl，

其中，所述2×柠檬酸钠溶液包含0.3m氯化钠以及0.03m柠檬酸钠，ph7.0，并且

所述0.2×柠檬酸钠溶液包含0.03m氯化钠以及0.003m柠檬酸钠，ph7.0。

优选地，所述2×柠檬酸钠溶液以及0.2×柠檬酸钠溶液均为20×柠檬酸钠溶液的稀释液，所述20×柠檬酸钠溶液包含3m氯化钠以及0.3m柠檬酸钠，ph7.0。

本发明的另一方面提供一种基因组测序文库杂交试剂盒，其包含上述杂交捕获试剂盒以及上述洗涤溶液试剂盒。

本发明的另一方面提供了上述基因组测序文库杂交试剂盒在探针对基因组dna测序文库进行杂交捕获富集中的用途。

再一方面，本发明提供一种液相杂交捕获方法，其中，在所述方法中使用上述杂交捕获试剂盒和/或上述洗涤溶液试剂盒。

有益效果

本发明提供的双链核酸液相杂交捕获溶液及洗涤溶液试剂盒具有较高的效率，可以缩短杂交时间至16h，而商品化试剂盒一般杂交时间为64-72h，因此，可以大大缩短试验周期，降低成本；洗涤溶液具有较好的洗脱效果，大幅减少了非目标区域dna片段，有效提高靶向富集效率，降低成本。

附图说明

图1显示三个实验组中4个目标基因的富集倍数的比较结果。

图2显示三个实验组中2个非目标基因的富集倍数的比较结果。

其中，实验组1使用商品化试剂盒杂交溶液及洗涤溶液，实验组2和实验组3使用本发明捕获溶液及洗涤溶液试剂盒，实验条件相同，评价自制试剂性能。目标基因与非目标基因的富集倍数通过实时定量pcr(realtime-qpcr)进行检测。检测结果为三次独立重复试验所得平均值±标准误差(mean±sem)。

具体实施方式

在本发明中的术语“2×浓度溶液”是指该溶液的浓度是其在使用时工作液浓度的2倍，也理解为在使用时需将该溶液稀释一倍。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细的描述，但是本领域技术人员将会理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节，也可以实现本申请各权利要求保护的技术方案。

在本发明的以下示例中使用的denhardt’soluction购自amresco公司，carrierrna购自天根生化科技有限公司，去离子甲酰胺液体购自索莱宝生物科技有限公司。

实施例

制备实施例1捕获溶液的配制

该溶液由磷酸二氢钠(nah2po4)缓冲液、柠檬酸钠缓冲液(ssc)、乙二胺四乙酸

(edta)、去离子甲酰胺、denhardt(denhardt)溶液、carrierrna及硫酸葡聚糖配

制而成。首先配制2×浓度溶液(不含去离子甲酰胺，去离子甲酰胺液体单独加入捕

获溶液中)，-20℃条件下可长期保存，具体配方如下：

100mmnah2po4

4×ssc

2mmedta

2×denhard溶液

2mg/mlcarrierrna

20w/w％硫酸葡聚糖

溶液ph7.0

捕获溶液包含2×浓度溶液与100％甲酰胺液体，混合后形成杂交捕获溶液工作液，体积混合比例如下表1中所示。

表1

制备实施例2洗涤溶液试剂盒的配制

所述洗涤溶液试剂盒包含5种洗涤缓冲液组分，-20℃条件下可长期保存，具体配方如下：

stringent洗涤溶液：2×ssc溶液，30v/v％去离子甲酰胺。

洗涤溶液i：2×ssc溶液，0.1％十二烷基硫酸钠(sds)。

洗涤溶液ii：2×ssc溶液。

洗涤溶液iii：0.2×ssc溶液。

生物素亲和磁珠洗涤溶液：10mmtris-hcl，ph7.5；1mmedta；2mnacl。

实施例1捕获溶液以及洗涤溶液试剂盒在杂交捕获富集中的应用

具体而言，整个实验流程包括：首先将提取到的样本dna经过超声打断成200-250bp的dna片段(但不限于超声波打断法)，经过末端修复、加“a”及连接过程将dna片段连上index接头；随后利用构建的捕获文库与含有待捕获的靶标基因区域dna片段杂交，捕获目标区域的dna片段，评价目标区域dna片段的富集效果，对这些dna片段进行测序。经过生物信息学数据分析后获得样本检测结果。

1.样本基因组dna提取及文库制备

样本基因组dna的提取方法参照qiagen公司的qiaampdnabloodminikit试剂盒，分别提取了编号为s1的人全血基因组样本。将得到的高质量基因组dna样本片段化成200-250bp的dna片段，将样本分为3份进行平行文库构建实验，随后经过末端修复、加“a”及连接等过程，将3组dna片段分别连上3个不同的index接头(相关试剂来自kapahyperprepkitilluminaplatforms)，经过pcr扩增纯化后得到样本dna文库。三个样本使用的index序列如下：s1-1：atcacg；s1-2：cgatgt；s1-3：ttaggc。

2.基因组文库混合、封闭及干燥

将构建好的基因组dna文库按照数据量分配比例混合，总量1ug，随后将cotdna、基因组dna文库与封闭引物按照如下表2中的比例混合。其中cotdna作为基因组中重复率较高的一部分dna片段，在杂交时有助于提高杂交效率，封闭引物用来封闭文库中的测序接头。将上述混合好的样本在真空浓缩仪中60℃蒸干，用于后续杂交。

表2

3.重新溶解及变性：向上述干燥后的混合物中加入10.5μl的捕获溶液。实验组1，样本编号为s1-1，使用rochenimblegen商品化试剂盒杂交试剂；实验组2，样本编号为s1-2，使用如上述制备实施例1制备的捕获溶液；实验组3，样本编号为s1-3，为实验组2的重复试验。充分涡旋溶解后于95℃变性10min。

4.杂交：将变性好的10.5μl混合物加入到4.5μl杂交捕获探针文库中，三组实验使用相同双链dna探针进行液相杂交捕获，涡旋30s充分溶解混匀后全速离心30s。实验组1于47℃杂交64h，实验组2、3于55℃杂交16h。

5.链霉亲和素磁珠捕获目标区域dna文库片段：杂交反应后，将15μl样品转移至事先分别经过rochenimblegen商品化试剂盒中的beadwashbuffer(实验组1)和上述制备实施例2制备的链霉亲和素磁珠洗涤溶液(实验组2、3)洗涤重悬的100μl链霉亲和素标记磁珠中，混匀后实验组1于47℃孵育45min，实验组2、3于55℃孵育45min，每隔15分钟吹打混匀一次，让捕获的片段与磁珠结合，特异吸附目标片段，将杂交到的片段抓取出来。

实验组1，样本编号为s1-1，使用rochenimblegen商品化试剂盒洗脱试剂；实验组2，样本编号为s1-2，使用如上述制备实施例2制备的洗涤溶液；实验组3，样本编号为s1-3，为实验组2的重复试验。

6.洗涤非目标区域dna片段：这里主要叙述上述制备实施例2制备的洗脱试剂洗脱步骤。

①实验组1加入100μl47℃预热的rochenimblegen商品化试剂盒的洗涤溶液i，实验组2、3加入100μl55℃预热的上述制备实施例2制备的洗涤溶液i，混匀后磁力悬浮弃上清，重复一次。

②实验组1加入200μl47℃预热的stringentwashbuffer，实验组2、3加入200μl55℃预热的上述制备实施例2制备的stringent洗涤溶液，混匀后55℃孵育5min，磁力悬浮弃上清，重复三次，共四次。

③实验组1加入rochenimblegen商品化试剂盒洗脱试剂的洗涤溶液i，实验组2、3加入200μl上述制备实施例2制备的洗涤溶液i，涡旋2min，磁力悬浮弃上清。

④实验组1加入rochenimblegen商品化试剂盒洗脱试剂的洗涤溶液ii，实验组2、3加入200μl上述制备实施例2制备的洗涤溶液ii，涡旋1min，磁力悬浮弃上清。

⑤实验组1加入rochenimblegen商品化试剂盒洗脱试剂的洗涤溶液iii，实验组2、3加入200μl上述制备实施例2制备的洗涤溶液iii，涡旋30s，磁力悬浮弃上清。

⑥加入50μlpcr级别ddh2o重悬磁珠。

7.捕获后富集：洗脱后磁珠带着捕获的目标dna片段，进入样本的lm-pcr富集。lm-pcr反应体系如以下表3中所示(一个捕获样本做两管pcr反应)。

表3

pcr反应条件为：98℃预变性45s；98℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共14个循环；72℃延伸1min；4℃保温。

反应后，利用纯化磁珠ampurebeads纯化pcr扩增产物，得到捕获后的样本文库，质检后用于测序分析。

实验实施例1利用荧光定量pcr对目标区域及非目标区域进行富集倍数测定

利用sybrgreen方法测定富集前后目标区域及非目标区域的富集倍数。反应体系如以下表4中所示。

表4

pcr反应条件为：95℃10min；95℃10s，60℃1min，共40个循环；95℃10s，65℃1min。通过采集的信号测得样本的ct值，测得样本的ct值取决于反应中模板dna的初始浓度，ct值越低则模板dna初始浓度越高，由此根据富集前后样本ct差值变化可以评估其富集倍数。基于以上实验得到三个实验组的目标区域及非目标区域富集情况如附图所示。图1显示实验组2，3中4个目标区域富集倍数明显高于实验组1中4个目标区域富集倍数，因此自制试剂的杂交捕获效率明显高于商品化试剂盒。图2显示实验组2，3中2个非目标区域富集倍数实验组明显低于实验组1中2个非目标区域富集倍数，因此自制试剂的洗脱效率明显高于商品化试剂盒，可以有效去除背景非目标片段。

实验实施例2高通量测序与数据分析

采用二代测序平台进行高通量测序，将捕获的序列在illuminanextseq500测序平台进行序列测定(测序试剂均购自illumina商业测序试剂盒)，对得到的数据进行分析可知其上的标签序列，根据标签序列确定其对应的样本dna来源，根据目标区域比对，可得到目标区域有效数据，进而得到样本的目标区域信息。利用二代测序手段对上面方法获得的测序文库进行了测序并且获得了测序数据，有关分析结果如以下表5中所示。

表5测序后数据分析结果

实验采用相同的液相杂交捕获探针，在相同的实验条件下评估自制杂交试剂及洗涤试剂的效果。结果显示，所有样本均取得了良好的测序捕获效果，平均测序深度都在15000x以上，且各位点均一性较好，覆盖率均达到100％。结果显示自制试剂实验组在捕获效率和数据有效性方面明显高于商品化试剂，且大大缩短了杂交时间至16h，因此本发明提供的试剂及方法能够达到检测结果优于商品化试剂盒效果。

针对本发明，本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施实施例，而在实际操作中可在操作细节上作出适当改变，而不偏离发明的精神和范围。本发明的保护范围由所附的权利要求定义，但同时还包含权利要求所限定的内容的等同变换形式，例如，本领域的技术人员显而易见地理解，将根据本发明的思想并且实验可行地进行配制得到的3×、4×、5×、6×等的储备溶液作为杂交捕获溶液也毫无疑义地落入本发明的保护范围内。