多功能双酶梭菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种多功能新型双酶梭菌及其在发酵产氢、提高乙酸产量中的应用。

背景技术：

双酶梭菌是一种严格厌氧的发酵产氢菌，可以利用葡萄糖等发酵底物产生氢气和挥发性短链脂肪酸，其革兰氏染色为阳性。

随着化石燃料使用带来的气候变化和空气污染问题日益凸显，生物氢因其清洁可再生且具有高燃烧热(122kj/g)等特点，因此，具有巨大的应用前景。生物氢主要由产氢微生物通过暗发酵产生，这类微生物主要有梭菌属clostridium、肠杆菌属enterobacter和芽孢杆菌属bacillus等，其中梭菌属因其底物多样，易于培养，产氢量高等特点受到广泛关注和研究。然而，氢气产量低、速率慢仍是制约大规模生物制氢产业发展的瓶颈，因此，新型高效产氢菌的分离是走出当前困境的重要途径。

异化铁还原菌是一类具备将胞内有机物氧化和胞外变价金属矿物中高价金属还原藕联发生能力的微生物，在此藕联过程中，胞外矿物作为电子受体接收来自胞内有机物氧化产生的电子从而完成电子的传递过程。根据胞外传递的电子能否用于微生物的能量代谢，异化铁还原菌可分为，呼吸型异化铁还原菌和发酵型异化铁还原菌，前者胞外电子传递过程藕联呼吸链产生能量，而后者没有能量的储存。这种微生物氧化有机物产生的电子传递到胞外还原变价矿物中高价金属离子的过程称为胞外电子传递。相比革兰氏阳性发酵型的异化铁还原菌，革兰氏阴性呼吸型的异化铁还原菌胞外电子传递的机制研究已经取得了重大进展，而革兰氏阳性菌因其具有较厚的细胞壁及荚膜结构，胞外电子传递过程的研究相对困难。

电活性微生物是一类能够产生电流或接收电流从而完成生命代谢活动的微生物，已有的研究结果表明，尽管很多异化铁还原菌具有电活性，但并不是所有的异化铁还原菌都具有产生电流的能力。目前发现的电活性微生物主要集中于革兰氏阴性地杆菌属geobacter和希瓦氏菌属shewanella,而具有电化学活性的革兰氏阳性梭菌clostridium却很少有报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种多功能双酶梭菌及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种多功能双酶梭菌，菌株为双酶梭菌clostridiumbifermentansez-1，已于2017年3月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmccno.13913。所述双酶梭菌ez-1株，clostridiumbifermentansstrainez-1，分离自黄河三角洲土壤。

所述菌株厌氧培养于pyg培养基中，培养基pyg成分为：蛋白胨：0.2～5g/l，胰蛋白胨：0.2～5g/l，酵母提取物：0.2～10g/l，葡萄糖：5～10g/l，cacl2：0.008g/l，mgso4·7h2o：0.016g/l，k2hpo4：0.04g/l，kh2so4：0.04g/l，nahco3：0.04g/l，nacl：5g/l，l-cysteine：0.25g/l；温度：30℃；ph：6.3(±0.2)。

一种多功能双酶梭菌的应用，所述双酶梭菌在发酵产生氢气和挥发性短链脂肪酸中的应用。

所述双酶梭菌能够利用葡萄糖为底物快速生长并产生氢气、挥发性短链脂肪酸(乙酸和丁酸)。

一种多功能双酶梭菌的应用，所述双酶梭菌在还原三价铁中的应用。所述三价铁可为可溶性的(如，柠檬酸铁)、无定形的(如，水铁矿)、晶型的(如，磁铁矿)三价铁。

所述双酶梭菌作为异化铁还原菌在代谢产乙酸中的应用。

一种多功能双酶梭菌的应用，所述菌株在微生物燃料电池中的应用。

进一步的说是30℃，黑暗条件下，该菌在微生物燃料电池中具有电流输出的能力，最大电流输出密度可达6.3ma/m²。

一种产氢气的方法，将双酶梭菌clostridiumbifermentansez-1在利用葡萄糖于30～37℃厌氧发酵培养4～48h，即获得氢气和挥发性短链脂肪酸。

所述菌株以1～10％的接种量接种于pyg培养基中厌氧培养。

一种产乙酸的方法，将培养至对数生长期的双酶梭菌clostridiumbifermentansez-1接种至含纳米铁氧化物的pyg培养基中于30～37℃下黑暗培养4～48h，即获得乙酸。

所述纳米铁氧化物为磁铁矿和水铁矿，其中，培养基中磁铁矿(fe3o4)终浓度为2.5～10mm/l；水铁矿(feooh)终浓度为5.0～10mm/l；所述菌株(od600＝2)的接种量为1～10％。

本发明所具有的优点：

本发明中分离得到的双酶梭菌同时具备发酵产氢、产电和异化铁还原能力，是一株多功能新型菌株，具有广阔的应用领域，并且通过添加纳米铁氧化物，从而可改变该菌株代谢途径进而增强发酵产物乙酸途径；具体为：

1)本发明分离获得的能快速生长产氢的革兰氏阳性双酶梭菌clostridiumbifermentansez-1，其特点在于易于培养，生长快且产氢速率高。同时具有异化铁还原和产电能力，是研究胞外电子传递的合适材料。此外，将有机质转换为电能具有广阔的应用前景。

2)本发明分离得到的双酶梭菌在适当浓度的金属氧化物、磁铁矿和水铁矿的存在下，可以调节代谢途径，增强发酵产物乙酸途径，这种通过添加金属氧化物来调节菌株代谢途径进而增强目标产物产量的方法具有较强的应用潜势。

附图说明

图1为本发明获得菌株(cgmccno.13913)在pyg固体培养皿上形成的单菌落形态图；

图2为本发明获得菌株(cgmccno.13913)在显微镜下(400×)形态图；

图3为本发明获得菌株(cgmccno.13913)的生长曲线(od600)图；

图4为本发明获得菌株(cgmccno.13913)发酵产氢图；

图5为本发明获得菌株(cgmccno.13913)还原柠檬酸铁中三价铁图；

图6为本发明获得菌株(cgmccno.13913)还原纳米磁铁矿和水铁矿中的三价铁生成二价铁图；

图7为本发明获得菌株(cgmccno.13913)在不同浓度铁氧化物添加条件下，乙酸的生成情况图；

图8为本发明获得菌株(cgmccno.13913)在微生物燃料电池中产生电流图。

具体实施方式

通过附图说明和具体实施例对本发明的内容作进一步详细说明。

实施例1

双酶梭菌clostridiumbifermentansez-1的分离鉴定：

1)取富集的黄河三角洲土壤上清，按10-10⁶倍梯度稀释，接种环蘸取稀释10⁶倍的土壤上清，在含有2％琼脂糖pyg培养皿上进行分区划线，30℃厌氧培养箱中培养24h～48h，得到单菌落，菌落呈圆形白色如图1所示。

2)挑选单菌落移入20μl无菌水,取2μl菌悬液用于pcr扩增，剩余的18μl接入10mlpyg液体培养基中于30℃条件下暗培养24～48h，在倒置显微镜下观察细菌形态如图2所示。

3)pcr体系:2μlbuffer缓冲液；2μldntp底物；0.5μltaq酶；0.5μlba907r反向引物；0.5μlba27f正向引物；2μl单菌落悬浊液模板；2.5μl无菌水。

pcr程序：95℃，5min，细菌裂解，dna解链；55℃，30s，复性，引物及酶结合；72℃，1.5min，延伸；循环30次。

引物：反向引物ba907r：5’-agagtttgatcctggctcag-3’；正向引物ba27f：5’-ccgtcaattcctttragttt-3’。

4)16srdna测序，将测序结果在greengens上进行序列比对，结果显示该菌与双酶梭菌clostridiumbifermentans有97.99％的相似性。

实施例2

双酶梭菌clostridiumbifermentansez-1厌氧发酵及产物鉴定：

1)培养基pyg：蛋白胨：0.2～5g/l，胰蛋白胨：0.2～5g/l，酵母提取物：0.2～10g/l，葡萄糖：5～10g/l，cacl2：0.008g/l，mgso4·7h2o：0.016g/l，k2hpo4：0.04g/l，kh2so4：0.04g/l，nahco3：0.04g/l，nacl：5g/l，l-cysteine：0.25g/l；ph6.3(±0.2)

2)将上述pyg培养基分装于25ml血清瓶中，每瓶10ml，加硅胶塞。除氧：抽真空6min，冲氮气30s；抽真空3min，冲氮气30s；抽真空1min，冲氮气30s。铝盖密封，121℃，20min高压蒸汽灭菌。

3)向除氧注射器中接种双酶梭菌clostridiumbifermentansez-1，接种量为1％，进行生长情况测定，结果如图3所示。取200μl顶部气体进行气相色谱(gc)检测，检测结果如图4所示；取100μl液体，去离子水稀释10×后进行高效液相色谱检测(hplc)，检测结果如图5所示。

由上述各图可见，该双酶梭菌在pyg液体培养基37℃暗培养条件下，能快速发酵葡萄糖产生氢气、乙酸和丁酸生物制品，相比已报道的暗发酵产氢梭菌，该菌可将发酵延滞期缩短到4h以内。

实施例3

双酶梭菌clostridiumbifermentansez-1异化铁还原能力检测：

1)向高压蒸汽灭菌后的pyg培养基中分别添加：磁铁矿(fe3o4)终浓度为2.5～10mm/l；水铁矿(feooh)终浓度为5.0～10mm/l；柠檬酸铁终浓度为10～40mm/l。

2)而后接种在pyg液体培养基中培养至对数期的双酶梭菌，接种量为1％，30℃，黑暗培养48h。

3)用菲啰嗪法检测培养前后培养基中二价铁浓度的变化情况如图6所示。

由上述各图可见，该双酶梭菌具有较强的铁还原能力，不仅能将可溶性和无定形铁还原，还能将纳米磁铁矿中的晶型铁还原。可见该菌株革兰氏阳性菌双酶梭菌均有对三价铁的还原能力，尤其是对晶型铁纳米磁铁矿的还原能力显著。

实施例4

纳米铁氧化物调节双酶梭菌clostridiumbifermentansez-1代谢途径，增强乙酸产量：

1)向高压蒸汽灭菌后的pyg培养基中分别添加：磁铁矿(fe3o4)终浓度为2.5～10mm/l；水铁矿(feooh)终浓度为5.0～20mm/l。

2)而后接种在pyg液体培养基中培养至对数期的双酶梭菌，接种量为1％，30℃，黑暗培养48h。

3)hplc检测不同浓度铁氧化添加对乙酸生成量的影响情况结果如图7所示。

由上述各图可见，纳米铁氧化物可以调节该双酶梭菌的代谢途径，在磁铁矿(fe3o4)终浓度为2.5～10mm/l，水铁矿(feooh)终浓度为5.0～20mm/l时，这两种纳米铁氧化物可以增强产乙酸代谢途径，从而提高乙酸的产量；而当铁氧化物的浓度过高时则会抑制双酶梭菌的发酵过程，如添加20mm/l水铁矿，48h后葡萄糖有残留。

实施例5

双酶梭菌clostridiumbifermentansez-1电化学活性检测：

1)组建“h”型微生物燃料电池，以石墨片(30mm×25mm×3mm)作为电极，外电路连接1kω电阻，以质子交换膜将阴阳两室隔开，阳极为pyg液体培养基，阴极为铁氰化钾溶液。

2)微生物燃料电池阳极室接种1％的在pyg液体培养基中培养至指数期的双酶梭菌，将连有多行扫描器的数字电压表的正负极分别连接到微生物燃料电池的阳极和阴极，每30s记录一次电压，结果如图8所示。

由图8可见，该双酶梭菌具有产电能力，最大电流输出密度可达6.3ma/m²。可见菌株双酶梭菌clostridiumbifermentans具有一定的电活性。