一种检测中华鳖IGFBP1基因片段中与生长相关单核苷酸位点的试剂盒及应用的制作方法

本发明属于水生动物分子生物学技术领域，涉及一种包含如seqidno：1所示中华鳖基因核苷酸的核酸分子。本发明还涉及igfbp1基因多核苷酸序列中的单核苷酸多态性位点和检测所述单核苷酸多态性位点的方法，以及该位点和中华鳖生长性状的关联分析。

背景技术：

动物的生长性状由于直接影响着水产动物的经济价值，已作为一个重要的经济性状成为当前研究的热点。提高生长速度可以直接降低养殖和劳动力投入，有利于经济效益的提高。因此，筛选具有优良生长性状的养殖品种，提高水产动物的生长性能，是水产养殖业长久以来的研究目标。传统的选育方法是依表型进行选择，周期长，效率低，因此需利用分子标记技术从基因型层面，筛选与经济性状相关分子标记，辅助选育，以提高育种效率。目前，比较直接快速的解决办法之一就是利用分子标记的方法筛选到与这些生长性状相关的基因或标记，从而进行遗传改良。

胰岛素样生长因子(insulin-iikegrowthfactors,igfs)是一类具有胰岛素样代谢和促有丝分裂功能的蛋白质，是胚胎和动物出生后生长的主要决定因素。igf介导生长激素的促生长作用。神经内分泌生长轴上的igf系统包括两个配体(igf-i、igf-ii)、两个igf受体(igf-ir、igf-iir)以及igf结合蛋白(igfbps)，鱼类在内的脊椎动物的生长主要受胰igfs信号通路的控制。胰岛素样生长因子结合蛋白1(insulin-likegrowthfactorbindingpro-teins1,igfbp1)的主要功能是对igf-1进行结合运载和延长半衰期，并进行组织和细胞识别定位，调节igfs通路的生物学功能。研究表明，igfbp1在血液循环中的代谢变化最快，以磷酸化、部分磷酸化、非磷酸化等形式在不同时期的不同组织中以不同比例存在，磷酸化的igfbp1增加了对igf-1的亲和力，导致其与细胞表面的结合力下降，抑制其活性。此外，魏可鹏等(2012)在建鲤igfbp1基因上找到了两个与增重相关的snp位点，作为建鲤增重相关的分子标记应用于育种实践。

技术实现要素：

本发明的主要目的是找到在中华鳖生长中具有重要作用的igfbp1基因上的单核苷酸多态性位点，并建立检测和分型的方法，将位点基因型与生长性状进行关联分析，为中华鳖生长标记辅助育种提供一种有用的分子标记。

本发明要克服的主要技术问题为，针对现有技术的不足，提供一种检测中华鳖igfbp1基因片段中与生长相关单核苷酸位点的试剂盒及应用。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述检测中华鳖igfbp1基因片段中与生长相关单核苷酸位点的试剂盒包含如下引物：

pcr扩增正向引物(上游外引物(fw))：5′-cctggatctcctgaattgaa-3′(seqidno.2)；

pcr扩增反向引物(下游外引物(rw))：5′-gccatttcccactgatattg-3′(seqidno.3)；

突变位点检测上游内引物(fn)：5’-cactcatggtaggactaag-3’(seqidno.4)；

突变位点检测下游内引物(rn)：5’-atgctggtctagataatat-3’(seqidno.5)。

其中，所述中华鳖igfbp1基因片段序列如seqidno.1所示，该序列的243bp处有1个a/g的碱基突变。

检测中华鳖igfbp1基因片段中与生长相关单核苷酸位点的方法包括如下步骤：

(1)以中华鳖个体的dna为模板，用上述pcr扩增正向引物和反向引物进行pcr扩增，得pcr扩增产物，采用直接测序法比对得到snp位点；

(2)用上述突变位点检测上游内引物和下游内引物和pcr扩增正向引物和反向引物联合进行分型鉴定；

(3)用琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物中aa、ag和gg基因型的分布。

本发明所述的中华鳖igfbp1基因片段可用于中华鳖分子标记辅助选择。还可用于制备检测生长相关试剂。

下面对本发明作进一步说明：

本发明将中华鳖转录组测序结果比对到中华鳖基因组数据库中，找寻igfbp1基因上疑似存在的snp。以中华鳖基因组为模板设计引物对疑似存在单核苷酸突变位点的片段进行扩增，并采用直接测序法，软件比对发现第243bp处确实存在一个snp。确定位点真实存在之后，再采用四引物突变特异性扩增系统法(amplificationrefractorymutationsystem,arms)对位点进行分型，并在大群体样本中进行该位点不同基因型和中华鳖生长性状的关联分析。

igfbp1基因分子标记的筛选

实验材料：取中华鳖裙边组织提取dna，随机取样12只中华鳖个体。

引物设计：将中华鳖转录组测序结果比对到中华鳖基因组数据库中，以含有snp位点的序列为模板，运用primerpremier6.0设计引物。设计引物的原则：长度为18-25bp，gc含量在40％-60％，退火温度在45-55℃之间。引物序列为：正向引物为5′-cctggatctcctgaattgaa-3′，反向引物为5′-gccatttcccactgatattg-3′，产物长度为640bp。

具体操作：分别以12个中华鳖个体的dna为模板，采用上述引物进行pcr扩增。pcr反应体系(共25μl)：mix12.5μl(含染液，instantpcrkit3.0)，dna模板(50ng/μl)1μl，上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl，ddh2o10.5μl。

pcr反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸7min，最后4℃保存。

电泳：取5μlpcr产物点样于1.5％普通琼脂糖凝胶(含gelstain)上，点5μldl1,000bpdnamarker作为参照。0.5v/cm电泳0.5h。电泳结束后于凝胶成像仪下观察扩增结果，如图1所示。将纯化后的pcr产物送铂尚生物公司进行测序，软件对比测序结果如图2。

igfbp1基因单核苷酸分型的方法建立

实验材料：在同批次同池养殖中华鳖中随机取样245个个体。中国台湾鳖23个，黄沙鳖20个，日本鳖20个。以上全部个体均取裙边组织提取dna。引物设计：根据四引物armspcr扩增原理，在igfbp1基因突变位点(a/g)设计一对特异性引物，并在突变位点两侧设计一对参照引物。上游内引物(fn)，5’-cactcatggtaggactaag-3’，下游内引物(rn)，5’-atgctggtctagataatat-3’；上游外引物(fw)，5′-cctggatctcctgaattgaa-3′，下游外引物(rw)，5′-gccatttcccactgatattg-3′(参考igfbp1基因分子标记的筛选中的引物)。当基因型为a/a纯合时，扩增产物由引物fw、rw产生的640bp和引物fw、rn产生的261bp两条带组成；当基因型为g/g纯合时，扩增产物由引物fw、rw产生的640bp和引物fn、rw产生的416bp两条带组成；当基因型为g/a杂合时，扩增产物由引物fw、rw产生的640bp，引物fn、rw产生的416bp和引物fw、rn产生的261bp三条带组成。

由上述外引物fw、rw对得到了含snp的基因片段，序列见表seqidno.1。

pcr反应体系(共25μl)：mix12.5μl(含染液，instantpcrkit3.0)，dna模板(50ng/μl)1μl，上游外引物(10pmol/μl)0.5μl，下游外引物(10pmol/μl)0.3μl，上游内引物(10pmol/μl)0.5μl，下游内引物(10pmol/μl)0.7μl，ddh2o9.5μl。

pcr反应程序：采用降落pcr。94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃、62℃、60℃各退火循环5次，58℃退火循环15次30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸7min，最后4℃保存。

电泳：取5μlpcr产物点样于1.5％普通琼脂糖凝胶(含gelstain)上，点5μldl1,000bpdnamarker作为参照。0.5v/cm电泳1h。电泳结束后于凝胶成像仪下观察扩增结果并拍照，部分结果如图3所示，图中包括本发明中igfbp1基因四引物突变特异性扩增系统法的3种基因型aa、ag和gg的电泳结果。图中m：dna分子量标准(dl1,000bpdnamarker)。

igfbp1基因不同基因型与生长性状的关联分析

实验材料：材料与igfbp1基因单核苷酸分型的方法建立章节一样，测量其体质量、背甲长、背甲宽、腹甲长、体高、裙边宽度共6个性状并记录。所有个体igfbp1a/g基因型分型结果。

具体操作：采用spss22软件一般线性模型(generallinearmodel,glm)中的多元方差分析模块进行相关分析，因变量为体质量、背甲长、背甲宽、腹甲长、体高和裙边宽度6个形态性状，自变量为筛选到的snp位点的不同基因型。

利用上述制备的中华鳖分子标记应用于其他品系的鳖，从而完成了本发明。

本发明将为中华鳖标记辅助育种选择奠定坚实基础，为提高中华鳖生产经济效益，指导中华鳖育种实践提供理论依据。

附图说明

图1是本发明的igfbp1基因片段的pcr扩增产物的电泳结果图；图中：1-13表示不同泳道。泳道1-12：1-12号个体。泳道13：dl1,000bpdnamarker。

图2是本发明12个个体采用直接测序法测序后的软件比对结果。

图3是本发明的igfbp1基因a/g位点四引物法电泳结果；图中：1-16表示不同泳道。泳道1-5：ag基因型；泳道6-10：aa基因型；泳道11-15：gg基因型。泳道16：dl1,000bpdnamarker。

具体实施方式

以中华鳖基因组为模板设计引物对igfbp1基因片段进行扩增，并采用直接测序法，测序数据显示在243处有一个a/g的碱基突变。采用四引物法armspcr对突变位点进行分型，将不同基因型与生长性状进行关联分析，并检测了该标记在其它品系鳖中的分布情况。

中华鳖基因组数据库中，以含有候选snp位点的序列为模板，运用primerpremier6.0设计引物。引物序列为：正向引物为5′-cctggatctcctgaattgaa-3′；反向引物为5′-gccatttcccactgatattg-3′；产物长度为640bp。

pcr反应体系(共25μl)：mix12.5μl(含染液，instantpcrkit3.0)，dna模板(50ng/μl)1μl，上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl，ddh2o10.5μl。

pcr反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸7min，最后4℃保存。

电泳：取5μlpcr产物点样于1.5％普通琼脂糖凝胶(含gelstain)上，点5μldl1,000bpdnamarker作为参照。0.5v/cm电泳0.5h。电泳结束后于凝胶成像仪下观察扩增结果。将纯化后的pcr产物送铂尚生物公司进行测序，运用软件比对测序结果。

四引物法armspcr对igfbp1分型

本发明人以中华鳖igfbp1为研究的对象，用于关联分析的中华鳖来自于同批次同池养殖的群体，共245个个体；此外还有中国台湾鳖23个，黄沙鳖20个，日本鳖20个。

申请人设计根据四引物法的原理，针对igfbp1基因上的这一突变位点设计了引物，游内引物(fn)，5’-cactcatggtaggactaag-3’，下游内引物(rn)，5’-atgctggtctagataatat-3’；上游外引物(fw)，5′-cctggatctcctgaattgaa-3′，下游外引物(rw)，5′-gccatttcccactgatattg-3′(参考igfbp1基因分子标记的筛选中的引物)。

pcr反应体系(共25μl)：mix12.5μl(含染液，instantpcrkit3.0)，dna模板(50ng/μl)1μl，上游外引物(10pmol/μl)0.5μl，下游外引物(10pmol/μl)0.3μl，上游内引物(10pmol/μl)0.5μl，下游内引物(10pmol/μl)0.7μl，ddh2o9.5μl。

pcr反应程序：采用降落pcr。94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃、62℃、60℃各退火循环5次，58℃退火循环15次30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸7min，最后4℃保存。

电泳：取5μlpcr产物点样于1.5％普通琼脂糖凝胶(含gelstain)上，点5μldl1,000bpdnamarker作为参照。0.5v/cm电泳1h。电泳结束后于凝胶成像仪下观察扩增结果并拍照，结果显示igfbp1基因四引物突变特异性扩增系统法产生3种基因型aa(640bp、261bp)、ag(640bp、416bp、261bp)和gg(640bp、416bp)。

对igfbp1该位点基因型与生长性状进行关联分析

运用glm进行关联分析，igfbp1该位点与生长性状相关性结果见表1。aa基因型个体测量的6个生长性状(体质量、背甲长、背甲宽、腹甲长、体高、裙边宽度)的平均值均高于ag型和gg型个体的平均值，其中aa基因型和gg基因型个体在体质量、背甲宽、腹甲长和体高上存在显著差异(p<0.05)，而ag基因型个体与aa基因型和gg基因型个体均不存在显著性差异(p>0.05)。结果显示该位点对生长具有影响作用。

表1igfbp1基因snp基因型与生长性状的相关性

对igfbp1位点的基因频率、基因型频率进行检测，并分析其遗传结构

igfbp1基因a/g位点的多态性在不同品系鳖中的分布情况如表2所示，由表可知，在中国台湾鳖、黄沙鳖和日本鳖中g为优势等位基因，中国台湾鳖中该基因频率高达0.8043，黄沙鳖和日本鳖中为1。在中华鳖中a为优势等位基因，基因频率为0.5143。从基因型分布频率来看，gg型占有优势，aa型个体在中国台湾鳖、黄沙鳖和日本鳖中未发现。在中华鳖中gg型(65个)较aa型(72个)少，ag型最多为108个。

表2不同品种igfbp1基因a/g位点的基因频率和基因型频率分布

序列表

<110>湖南农业大学

<120>一种检测中华鳖igfbp1基因片段中与生长相关单核苷酸位点的试剂盒及应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>640

<212>dna

<213>中华鳖(patentin)

<400>1

cctggatctcctgaattgaaaggtgaccctgaatgccaacagtatcttggttcacaagaa60

taaggctaaacatatgacagcatttctgtttgctcatgcaaagtcttttgtagggtcctg120

atctgccattatttagggctgattcaccatggtacttaaacatgtgctaactttgagcat180

aggagcagaagggactttgagaggtcatctagtcctgtctcctgcactcatggtaggact240

aagtattatctagaccagcatatcagcaaaactgatgttggtaatgctcactcccatgag300

gaatgccattgaatttagtgggactaatcatgtgcttaaagtgacacacatgtctaagtg360

attgcagaatcaggctccattacttgtatattatatattatattatatatgaactacttt420

tgtactctacagattctataatatgtaaacctgttgaattatttattttactgtaaatgt480

attttttttctgtggtattattaatttatattctcaaacacttcataactttatgtgtaa540

atagataatattgctcttaatataggcatttttctattctgaaagagcactggtggaaaa600

gcttcaggtggaataacactcaatatcagtgggaaatggc640