从外周血游离DNA中检测循环肿瘤DNA的方法、试剂盒及其测序结果的分析方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种从外周血游离dna中检测循环肿瘤dna的方法、试剂盒及其测序结果的分析方法。

背景技术：

血浆游离dna又称cfdna（cellfreedna），是指外周中游离于细胞外的dna，cfdna的来源既包括正常细胞，也有异常细胞（如肿瘤细胞）或者外源的微生物（如病毒dna），具体包括自身正常细胞代谢的凋亡小体，肿瘤细胞碎片，外泌体等。

循环肿瘤dna（circulatingtumordna）ctdna是指从原发肿瘤甚至是转移形成的新肿瘤细胞破裂掉落下来到循环外周血中的dna。ctdna在临床医学中具有重要意义，通过检测ctdna在肿瘤的早期检测，肿瘤的靶向治疗和后期的疾病监控等方面具有重要的临床价值。

ctdna与所有cfdna一样是以核小体微单位，以单个、双联或者三联的形式进入血液，片段长度主要在166bp左右（即缠绕在每个组蛋白上面的dna的长度），并逐步分解，通常半衰期只有2个小时。一般10ml外周血中cfdna含量约在32ng(newmanetal,2016)。

ctdna含量非常少，以10ml外周血为例，从中可以提取到cfdna含量约30ng，ctdna在所有cfdna中的比例非常少，按1%计算,只有约300pg，也就是大约45个细胞裂解的dna量，实际情况下，如果是做早期筛查，ctdna的含量可能相当于5000个细胞中只有1~2个细胞是肿瘤细胞，所以对检测方法的敏感性要求非常高。

目前用于液体活检中目标基因检测的方法主要分为四类：一代测序（sanger），二代高通量测序（ngs），数字液滴pcr（ddpcr），和arms（又称等位基因特异性pcr）。对于肿瘤基因的筛查来说，ngs检测在同类中的性价比远高过其他几种方法。利用高通量测序技术来测定肿瘤患者中ctdna片段，根据分析得到的ctdna所携带的肿瘤基因信息，就能够全面地反映肿瘤的特征。这一技术凭借着准确、灵敏、无创、高通量、可以以相对低的成本一次测上万个位点，甚至更多等特点，可以从肿瘤防治诊断、治疗参考、用药指导、病情监控、复发预警等方面为医生及患者提供有效助力。

中国专利申请（申请号cn201410771006.9）公开了一种利用囊胚腔液游离dna检测胚胎染色体异常的方法，包括以下步骤：囊胚腔液游离dna的获取、囊胚腔液dna的检测、游离dna全基因组扩增、全基因组扩增产物分析、基因组dna进行片段化处理、片段化目的dna进行定量分析和片段大小分析、文库构建、上机测序、生物信息分析。该方法避免了传统的dna分析方法只能对单细胞基因组的部分区域进行研究的不足，能完整地分析单细胞基因组的遗传信息，操作简便，省时高效；同时，使用囊胚腔液游离dna作为检测样本，取材方便、安全，导致后期胚胎发育出现异常的概率小，能保证胚胎在后续发育中不会受到影响。

中国专利申请（申请号cn201610018232.9）公开了一种基于大规模数据挖掘的癌症检测试剂盒，所述试剂盒包括：dna提取试剂盒、高通量测序文库制备试剂、基因序列比对软件、染色体覆盖度计算软件。其中，所述dna提取试剂用于提取外周血游离dna，通过所述高通量测序文库制备试剂制备高通量测序文库，通过对测序文库高通量测序，利用所述基因序列比对软件将测序数据与人类参考基因组作比较，通过染色体覆盖度计算软件进行数据分析以区分癌症和非癌症病人，具体操作为：通过计算每一条染色体测序覆盖度，除以总测序量，来计算相对覆盖度；健康情况下，人每条染色体均为两个拷贝，染色体之间的拷贝数差异非常小；反之，如果相对覆盖度超过一定的阈值，则判断为疑似癌症患者。并进一步分析判断肿瘤类型和可能原发灶器官。

然而，目前采用ngs方法的主流检测过程（包括中国专利申请cn201410771006.9、cn201610018232.9中公开的技术方案）均会涉及到pcr扩增和测序，这两个过程都会出现一些系统错误，如illuminahiseq平台的测序错误率在0.1%，在普通大量样本模板检测中问题并不大。但是，在肿瘤早期筛查中，由于本身模板类就是在万分之一到千分之一的范围之内，这些测序错误跟我们的检测下线在一个数量级，就会对结果造成非常严重的干扰，其次，由于pcr引入的错误也无法进行有效识别。所以目前急需要开发一种新的方法，用于鉴别真正的基因突变和这些系统错误。

技术实现要素：

针对上述技术问题，本发明提供了一种从外周血游离dna中检测循环肿瘤dna的方法，所述方法包括如下步骤：

s1.将cfdna进行末端补平，并在cfdna的3’端添加a碱基；

s2.将经过所述s1处理后得到的cfdna末端连上接头，得到连接产物，所述接头含有分子标签序列和index序列；

s3.利用通用引物primer1.0和primer7对上述连接产物进行扩增；

s4.利用探针对所述s3得到的扩增产物进行捕获和富集；

s5.利用通用引物primer7和primer5对所述s4得到的富集产物进行扩增，并进行测序。

可选地，所述分子标签序列为4-9bp的随机脱氧核苷酸序列。

可选地，所述index序列为4bp的脱氧核苷酸序列。

可选地，所述接头为p5和p7序列退火形成，所述p5为如seqidno.1所示的脱氧核苷酸序列，所述p7为如seqidno.2所示的脱氧核苷酸序列。

可选地，所述primer1.0为如seqidno.3所示的脱氧核苷酸序列，所述primer7为如seqidno.4所示的脱氧核苷酸序列。

可选地，所述primer5为如seqidno.5所示的脱氧核苷酸序列。

本发明还提供了一种用于从外周血游离dna中检测循环肿瘤dna的试剂盒，所述试剂盒包括含有分子标签序列和index序列的接头、接头连接试剂、连接后扩增所用的通用引物、富集产物扩增引物。

可选地，所述分子标签序列为4-9bp的随机脱氧核苷酸序列，index序列为4bp的脱氧核苷酸序列。

可选地，所述接头为p5序列和p7序列退火形成，所述p5为如seqidno.1所示的脱氧核苷酸序列，所述p7为如seqidno.2所示的脱氧核苷酸序列。

本发明还提供一种对上述测序结果的分析方法，所述分析方法为：

s01.通过分子标签将归属相同原始模板的扩增产物测序结果进行归类；

s02.比对归属相同原始模板的多个扩增产物的测序结果，识别并排除由于pcr扩增或者测序中引入错误的测序结果。

相对于现有技术，本发明实施例具有以下优点:

1、本发明结合分子标签技术及超深度测序对ctdna进行检测，可以有效提高测序灵敏度，目前可以检测到0.05%的突变率。给接头添加分子标签序列后，在经过pcr和测序以后，可以通过分子标签将归属相同原始模板的扩增产物测序结果进行鉴别分类。理论上来说，来源于同一个分子标签的某类dna分子应该携带相同的序列，因此可通过分子标签鉴别真正的基因突变和这些系统错误，去除pcr和测序过程中引入的系统错误，避免他们干扰最后的测序结果，最终达到提高ctdna测序的灵敏度的效果。

2、本发明将传统的6-8个碱基的index缩短至4bp，此长度的index不仅完全有效地分辨来源于不同的样本并且可以控制序列长度，而且节约了成本。同时，在index后添加4-9bp的随机碱基序列，便于在合成随机碱基时控制碱基平衡，尽量避免连续的a和t碱基分布。

3、本发明提供的试剂盒由于采用多对通用引物，可用于检测多种癌症基因，应用范围广，并且检测准确度高。

4、可通过本发明提供的血液中ctdna含量检测，进而对癌症进行早筛以及复发监控，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例中含有分子标签的接头连接到cfdna的示意图；

图2为本发明实施例中四碱基分子标签的分布；

图3为采用本发明实施例的方法对美国cap实验室认证的horizoncfdna标准品的突变率检测的准确度验证结果；

图4为图3中a部分的放大图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种从外周血游离dna中检测循环肿瘤dna的方法，可用于对癌症进行早筛以及复发监控等。

所述癌症为实体瘤或血液病，具体地，所述的癌症包括但不限于头颈部癌症、消化道癌症、脑癌、肺癌、生殖系统癌症、泌尿系统癌症、皮肤癌、淋巴癌、白血病；其中所述头颈部癌症为口腔癌、鼻咽癌、舌癌或喉癌；所述消化道癌症为食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌或肠癌；所述生殖系统癌症为乳腺癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌或睾丸癌；所述泌尿系统癌症为膀胱癌或肾癌。

本发明中超深度测序法采用的测序设备包括但不限于illumina、roche/454测序仪(nextseq系列，hiseq系列，miseq系列，xten，以及后续测序仪系列)、bgi(华大公司，bgi500系列以及后续测序仪)的测序仪、lifetech测序仪器(ion，proton以及后续测序仪器系列)、pacbio测序仪器(rsii，sequel以及后续测序仪器)或基于nanopore的测序仪器(genia，nanopore以及类似的第三代测序仪)。

本发明中的具体操作参考相应采用的产品说明书提供的实验方法，在此不做详述。

本发明实施例一中，所述从外周血游离dna中检测循环肿瘤dna的方法包括如下步骤：

s0.双链叉状接头（adaptor）的制备。

接头由序列p5，p7退火形成。本实施例是基于illumina平台的，因此p5，p7序列采取固定碱基序列。本实施例中，p7上设计有index（索引序列）和随机碱基序列。所述index用以区分不同来源样本，index后添加的随机碱基序列作为分子标签，用以区分不同的模板链，四种碱基需随机分布并达到平衡。p5则采用短序列。优选地，p5及p7按1：1的摩尔数混合后退火形成叉状的接头的产量最高。

优选地，index序列长度为4bp时不仅完全有效地分辨来源于不同的样本并且可以控制序列长度。在index后添加的随机碱基序列为4-9bp，在合成随机碱基时控制碱基平衡，尽量避免连续的a和t碱基分布。

优选实施例中，所述p5为如seqidno.1所示的脱氧核苷酸序列，所述p7为如seqidno.2所示的脱氧核苷酸序列。其中，分子标签为随机四碱基序列，index为ttag。所述p5和p7序列结合形成叉状接头的连接效率最高。并且分子标签加在叉状结构的末端的设计，可以有效避免空泡结构的形成，进一步提高连接效率和提高准确度。在本实例中只采用了ttag作为index，但不限于这一种index，可以参考illumina提供的其他index。

其中，seqidno.1(acactctttccctacacgacgctcttccgatc-s-t)中“c-s-t”表示c和t之间以硫代磷酸酯键进行连接。所述seqidno.2的序列中位于5’端进行磷酸化修饰。

s1.将cfdna进行末端补平，并在cfdna的3’端添加a碱基。

s2.将经过所述s1处理后得到的cfdna末端连上接头，得到连接产物，所述接头含有分子标签序列和index序列。

本实施例中采用kapa(hyperkit或者hyperpluskit)对模板cfdna进行末端补平加a尾后，将含有分子标签的接头连接到模板cfdna链上，如图1所示。

具体操作参考产品提供的实验方法。本方案不限于使用kapa试剂盒建库，可以采用相同原理的类似试剂盒建库。

s3.利用通用引物primer1.0和primer7对上述连接产物进行扩增。所述primer1.0为如seqidno.3所示的脱氧核苷酸序列，所述primer7为如seqidno.4所示的脱氧核苷酸序列。由于分子标签是位于接头上，在这一过程中分子标签会随模板链扩增。

s4.利用探针对所述s3得到的扩增产物进行捕获和富集。

在本实施例中使用的是idtdna探针，所述探针是长为120nt的单链碱基。该探针经由生物素标记修饰，可以被m270磁珠捕获。被捕获的目标模板的pcr扩增产物再通过通用引物primer7和primer5扩增以获得足量产物进行测序。

s5.利用通用引物primer7和primer5对所述s4得到的富集产物进行扩增，并进行测序。本实施例中，所述primer5为如seqidno.5所示的脱氧核苷酸序列。

在经过pcr和测序以后，可以通过分子标签将样本中原始的dna分子都鉴别分类。由于经过pcr扩增以后的分子都跟原始模板携带同样的分子标签，所以理论上来说，来源于同一个分子标签的某类dna分子应该携带相同的序列，如果后期中间的产物在pcr过程中发生的突变，就可以通过标签去除这些突变序列，避免他们干扰最后的测序结果。同样的，测序错误也可以通过这个方法进行鉴别。

本发明实施例二提供了一种用于从外周血游离dna中检测循环肿瘤dna的试剂盒，所述试剂盒包括含有分子标签序列和index序列的接头、接头连接试剂、连接后扩增所用的通用引物、富集产物扩增引物。

优选地，所述分子标签序列为4-9bp的随机脱氧核苷酸序列，index序列为4bp的脱氧核苷酸序列。

优选地，所述接头为p5序列和p7序列退火形成，所述p5为如seqidno.1所示的脱氧核苷酸序列，所述p7为如seqidno.2所示的脱氧核苷酸序列。

优选地，所述试剂盒还包括对cfdna进行末端修复及3’端添加a碱基的试剂、用于pcr扩增的试剂、用于对扩增产物进行捕获和富集的试剂盒。

本发明实施例三提供一种对上述测序结果的分析方法，所述分析方法为：

s01.通过分子标签将归属相同原始模板的扩增产物测序结果进行归类；

s02.比对归属相同原始模板的多个扩增产物的测序结果，识别并排除由于pcr扩增或者测序中引入错误的测序结果。

验证实验

由于horizon提供的不同突变频率的标准品，可以用来检测实验方法的灵敏度，因此采用本发明的检测方法对美国cap实验室认证的horizoncfdna标准品进行突变位点检测，能有效地验证本发明的检测方法的准确度。

本实施例中对突变频率为0.05%，0.1%，0.5%,1%及0%(wildtype)的的标准品进行超深度测序，平均测序深度达到40000层。。图2为分子标签的分布情况，分子标签是随机合成的四个碱基组成，对分子标签的测序结果表明，四个碱基的分布比较均匀。具体图4为图3的a部分的放大图。图3和图4结果表明通过该方法检测位点频率与标准品突变频率相近，且本发明的检测方法可以对cfdna的0.05%水平的突变位点进行准确的定量检出，上述实验结果说明本方案的灵敏度高。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<120>从外周血游离dna中检测循环肿瘤dna的方法、试剂盒及其测序结果的分析方法

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