虎斑乌贼神经肽LFRFamide生殖调控剂的制作方法

本发明涉及神经肽
技术领域：
，本发明具体是一种虎斑乌贼神经肽lfrfamide生殖调控剂。
背景技术：
：头足类（cephalopoda）属于软体动物门头足纲，广泛分布在各个海域，在生物的系统演化的过程中占有重要地位。其肉质鲜美可口，肌肉含有相当丰富的营养物质，尤其是蛋白含量非常高。除了可以被食用外，更重要的是还具有重要的研究价值，其墨囊可以促进血液凝固且还含有抗菌成分，海螵蛸可以用作医学药材，耳石可以用来分析物种存在的年轮和海洋环境随时间和空间的变化特点。另外头足类还是海洋生态系统中重要的生物因子，在生态系统食物链中作为捕食者和被捕食者，对维持海洋生态系统的稳定具有重要的作用。神经肽是广泛存在于动物体内的小分子多肽，由神经组织分泌，具有调节神经活动、机体生长、发育等各种生理功能，神经肽同时还能充当生长因子、营养因子等信息分子。神经肽是一类比较古老的信息分子，真菌乃至细菌体内都存在神经肽。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种虎斑乌贼神经肽lfrfamide生殖调控剂，用于优化我国虎斑乌贼的规模化人工繁殖。本发明针对
背景技术：
中提到的问题，采取的技术方案为：虎斑乌贼神经肽lfrfamide生殖调控制剂，包括虎斑乌贼神经肽lfrfamide，神经肽lfrfamide基因cdna全长860bp，开放阅读框(openreadingframe，orf)567bp，编码188个氨基酸，5’非编码区(5’-utr)91bp，3’非编码区(3’-utr)202bp，前体蛋白相对分子质量(mw)为21.5kda，等电点(pi)为9.40。神经肽lfrfamide生殖调控制剂的制备方法包括总rna提取、cdna第一链的合成、虎斑乌贼lfrfamide核心序列的扩增、race获得lfrfamide基因cdna的全长和序列信息分析。作为优选，总rna提取步骤为取脑组织样品浸入trizol，匀浆后静置，加入氯仿后剧烈震荡，静置后离心，取最上层上清液，加入异丙醇摇匀静置，离心后取沉淀，在沉淀中加入70~80%浓度的乙醇，用枪头吹吸沉淀，离心，用枪头吸除液体部分，保留的沉淀即为总rna。提取的总rna必须要测定其吸光度r值，一般r值在1.8-2.0之间说明提取出的rna为有效的总rna，可以继续为后续操作使用，如果小于1.8则表明提取出的rna含有较多的杂质，会影响结果的准确性，所以不能使用；如果r值大于2.0则说明提取出来的rna已经降解，也不能使用。作为优选，cdna第一链的合成步骤为：利用从脑组织提取的总rna进行反转录，合成cdna第一链。作为优选，虎斑乌贼lfrfamide核心序列的扩增步骤为：根据ncbi数据库中已报道的5种软体生物lfrfamide基因序列，通过分析氨基酸序列的保守区，设计简并引物来获得虎斑乌贼lfrfamide基因核心片段；利用已获得的核心片段序列设计5’race和3’race引物；克隆lfrfamide所需引物为：lfrfamide-f：caaacgcaacagcctcttccg；lfrfamide-r：agtgcggcttcgtccatacc；5’-lfrfamide-outter：gctgcgttttagtccttcg；5’-lfrfamide-inner：ttcggggtcgtccttgct；3’-lfrfamide-outter：agagacggactcgaagacctttacg；3’-lfrfamide-inner：ctcagcacaacaggcggcagcaac；5’raceadapter：cgagtccgtctctttt；5’raceouterprimer：acuacuacuaggggcgtcgacgta；5’raceinnerprimer：acuacuacuaggggcgtcga；3’raceadapter：gcgagcacagaattaatatttttttttttt；3’raceouterprimer；gcggatccgaattaatacgact；3’raceinnerprimer：gcgagcacagaattaatacgact；m13-f：tgtaaaacgacggccagt；m13-r：caggaaacagctatgacc；以成熟虎斑乌贼脑组织cdna为模板，利用简并引物lfrfamide-f和lfrfamide-r进行lfrfamide基因核心片段的pcr扩增，pcr扩增程序如下：95℃，5min；94℃，30s，52℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，12min；用1%琼脂糖电泳检测pcr产物，找到符合预期大小的条带，用凝胶回收试剂盒进行割胶回收纯化。作为优选，race获得lfrfamide基因cdna的全长步骤为：以虎斑乌贼脑组织总rna为模板，获得扩增3’race片段所需的模板cdna后，利用巢式pcr来扩增3’race未知片段，得到3’端race模板cdna；以虎斑乌贼脑组织总rna为模板，获得扩增5’race片段所需的模板cdna后，利用巢式pcr来扩增5’race片段，得到5’端race模板cdna；使用lasergene软件对lfrfamide基因的3’端、5’端和核心片段的序列进行拼接，从而获得完整的虎斑乌贼lfrfamide基因的cdna全长序列。作为优选，序列信息分析步骤为：采用在线工具对lfrfamide基因进行开放阅读框（orf）预测，以及推测该orf所编码的氨基酸序列。其中，lfrfamide基因cdna全长为：agccgaatcgcgtttctcatacagaatacaaagcaattcttagaacctgggcttaacaaatacagcgaaccggccaacggtcagatcaaatatggaaacaaaagtgatgagtttgttggcgactgtgctaaccgtgttcattgtgcagataaattgcgaagacctacacaaaatacaaacagacacttccggcatttctaattttatcggtctaccagatggagaggaaggcgaactagtgagatccccgattgttgacgaatcagcgctcggcattgacgatgtcgacaaacgcaacagcctcttccgattcggtaagcgtggaaacctcttccgattcggtaaacgcggaaacctcttccggttcggcaagcgtggaaacctcttccgttttggacgcggtggcaacaaggacgaccccgaaaacgaaggactcaaacgcaccatctttagattcggtaaaagagacggactcgaagacctttacgactacgaggatccctcagtacaacaggtggcaccaacagctggagacaagcgcggatcattcttccggtatggacgaagccgcactttcttccgatacggcagaagcactgataagaacgccgagaagaggccacacacacccttccgatttggaagagaagaagagtaaactaatgactccatagaattttaccttaaaaagattaaagagagacaaagagagaaaatatacaaagaagactgagttgacaaagcacgggaaagcaaaataacaaaaatttggaaaaaaattataaataataaaatgaattttattaataattctatgctactttaaaaaaaaaaaaaaaaa。与现有技术相比，本发明的优点在于：首次克隆了虎斑乌贼lfrfamide的神经肽基因cdna序列全长。对上述基因的开放阅读框进行前体蛋白预测，分析其结构与特征。制备得到的虎斑乌贼神经肽lfrfamide生殖调控制剂对虎斑乌贼的色素囊变化调控、取食和生殖活动均有影响，可优化我国虎斑乌贼的规模化人工繁殖。附图说明图1为虎斑乌贼总rna电泳结果图；图2为lfrfamide基因pcr电泳结果图；图3为3′race扩增电泳条带图；图4为5′race扩增电泳条带图；图5为虎斑乌贼lfrfamide基因cdna全长图；图6为lfrfamide基因氨基酸序列同源比对图；图7为与lfrfamide同源氨基酸序列构建的nj系统进化树。附图标记说明：图5中预测的氨基酸序列显示在碱基序列下方，推测的信号肽序列用实线下划线标出，预测的flps用虚线下划线标出，基本剪切位点用六边形框标出，c-端酰胺化的甘氨酸用圆形框标出，用长方形框分别标示了预测的起始密码子（atg）、终止密码子（taa）和多腺苷化信号（aataaa）。具体实施方式下面通过附图和实施例对本发明方案作进一步说明：实施例1：虎斑乌贼神经肽lfrfamide，作用机理的探测方法包括神经肽lfrfamide基因克隆和序列分析、神经肽lfrfamide组织特异性表达分析和神经肽lfrfamide脑组织表达定位分析。神经肽lfrfamide基因克隆和序列分析：①rna提取准备工作：提rna过程中所使用的镊子、剪刀于烘箱中180℃烘烤4h以上。不能置于烘箱烘烤的枪头、电动匀浆器转头和离心管等实验器材均在配好的0.1%depc水中浸泡过夜以确保无rnaase，取出后在高压灭菌条件下30min，用烘箱烘干备用。②总rna提取：取干净的1.5ml离心管(rnaasefree)，用无rnaase枪头加入500μltrizol（4℃），用depc处理过的镊子夹取约30mg脑组织样品浸入trizol，使用电动匀浆器匀浆30s，补加500μltrizol；轻轻摇晃离心管，使组织充分溶解到trizol中，室温静置5分钟；在离心管中加入200μl的氯仿，剧烈震荡15s后，室温静置5分钟；4℃、12000rpm离心15min；离心后，离心管内分为3层，取最上层的上清液于新离心管中；向离心管中加500μl的异丙醇，摇匀，室温静置10分钟；离心机中4℃、12000rpm离心10分钟；离心后，除去上清液，保留沉淀；加入1ml的75%的乙醇，用枪头吹吸沉淀；离心机中4℃、7500rpm离心5分钟，用枪头吸除液体部分，保留沉淀；室温静置约20分钟待rna呈半干的透明状态，用depc水溶解后备用（按析出沉淀质量大小加入适量的depc水）；取3μl的rna液将其点样到1%的琼脂糖凝胶上，在200v，150ma的电泳仪下跑胶约15分钟，取出胶在uvp紫外凝胶成像仪中分析rna条带情况。虎斑乌贼总rna在uvp紫外凝胶成像仪中呈现的图像如图1所示，28s存在一定降解，但不影响后续实验。进一步经过紫外分光光度计测定，a260/a280值在1.8-2.0之间，可作为模板进一步用于cdna第一链合成。③cdna第一链的合成：使用takara公司生产的m-mlv（rnaseh-）反转录试剂盒，利用虎斑乌贼脑组织提取的总rna进行cdna第一条链合成实验，具体操作步骤如下：脑组织提取的总rna进行cdna第一条链合成实验，具体操作步骤如下：0.2ml离心管中加入以下反应体系：总rna5.0μloligodt1.0μl混匀反应体系，离心，将离心管置于pcr仪内，70℃孵育10min后立刻冰上静置2min；在上述离心管中加入以下反应体系：5×m-mlvbuffer2.0μldntpmixture(10mm)0.5μlrnaseinhibitor(40u/μl)0.25μlm-mlvrtase(200u/μl)0.25μldepc处理水1.0μl混匀反应体系，离心，将离心管置于pcr仪内，42℃孵育1h，70℃孵育15min后，迅速冰上静置15min；将合成的cdna置于-20℃冰箱保存备用。④虎斑乌贼lfrfamide核心序列的扩增：根据ncbi数据库中已报道的5种软体生物lfrfamide基因序列，通过分析氨基酸序列的保守区，设计简并引物来获得虎斑乌贼lfrfamide基因核心片段。利用已获得的核心片段序列设计5’race和3’race引物，使用primer5.0软件搜索设计。克隆过程中所需引物信息见表1：表1：克隆lfrfamide所需引物primernameprimersequence(5’-3’)lfrfamide-fcaaacgcaacagcctcttccglfrfamide-ragtgcggcttcgtccatacc5’-lfrfamide-outtergctgcgttttagtccttcg5’-lfrfamide-innerttcggggtcgtccttgct3’-lfrfamide-outteragagacggactcgaagacctttacg3’-lfrfamide-innerctcagcacaacaggcggcagcaac5’raceadaptercgagtccgtctctttt5’raceouterprimeracuacuacuaggggcgtcgacgta5’raceinnerprimeracuacuacuaggggcgtcga3’raceadaptergcgagcacagaattaatatttttttttttt3’raceouterprimergcggatccgaattaatacgact3’raceinnerprimergcgagcacagaattaatacgactm13-ftgtaaaacgacggccagtm13-rcaggaaacagctatgacc以成熟虎斑乌贼脑组织cdna为模板，利用简并引物lfrfamide-f和lfrfamide-r进行lfrfamide基因核心片段的pcr扩增。反应体系如下：灭菌水15.5μl10×pcrbuffer2.5μlmgcl2(25mm)2.5μldntp(10mm)1.0μllfrfamide-f1.0μllfrfamide-r1.0μl脑组织cdna1.0μltaq酶0.5μl加样完成之后，pcr扩增程序如下：95℃，5min；94℃，30s，52℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，12min；1.用1%琼脂糖电泳检测pcr产物，电泳结果如图2所示，与预期大小一致，该核心序列长度为263bp。找到符合预期大小的条带，用凝胶回收试剂盒进行割胶回收纯化，具体操作步骤如下：（1）跑胶，利用凝胶成像系统观察目的条带，找到条带后用干净的刀片将其切下，放入rnaasefree的1.5ml离心管中，称其重量，按每克胶加1mlsolutionⅰ的计算量，向装有胶块的离心管中加入solutionⅰ，56℃水浴10min，每2-3min震荡一次帮助加速溶解；（2）将含有琼脂糖胶的solutionⅰ混合液转移至离心柱中，10000rpm离心2min，若混合液过多，可分多次进行；（3）收集（2）中的溶液，并将其移入吸附柱ac中，相同离心率条件下，离心1min，弃废液，后将离心柱放回收集管中；（4）向吸附柱中加入700μl漂洗液，10000rpm离心1min，弃废液，将离心柱放回到收集管中；（5）为尽可能地去除漂洗液，再次加入500μl漂洗液至吸附柱中，相同离心率条件下，离心1min，倒废液，将离心柱放回管中，离心1min；（6）换一个干净的收集管，在吸附膜的中间部位加30μldepc处理水，12000rpm条件下离心2min，收集溶液；（7）取4μl回收的dna检测，5μl用于连接，其余-20℃保存；2.目的片段的克隆：（1）pcr产物与pucm-t载体16℃连接过夜，之后与dh5α感受态混匀，冰上静置30min，42℃处理90s，迅速冰浴静置5min；（2）加入1mllb液体培养基，将含有菌液的离心管置于恒温摇床中，37℃200rpm摇床1h；（3）将离心管从恒温摇床中取出，并置于离心机中，室温4000rpm离心5min，除去1ml上清液，枪头吹吸重悬菌体；（4）涂板，培养箱中37℃培养16h；（5）蓝白斑筛选，重新接种菌落，载体引物m13-f/m13-r进行克隆的阳性检测。筛选克隆的pcr体系如下：菌液16.5μl10×pcrbuffer2.5μlmgcl2(25mm)1.5μldntp(10mm)1.0μlm13-f1.0μlm13-r1.0μltaq酶0.5μl菌液送至上海生工测序。⑤race获得lfrfamide基因cdna的全长：1.3’端race模板cdna制备：以虎斑乌贼脑组织总rna为模板，获得扩增3’race片段所需的模板cdna后，利用巢式pcr来扩增3’race未知片段。实验操作根据试剂盒提供说明书进行；1）0.2ml离心管中加入以下反应体系：脑组织总rna1μg3’raceadapter1μldepc处理水补至5μl混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，70℃孵育2min后，快速移至冰上静置2min；2）向第一步1）中的反应液中加入以下反应体系：5×第一链缓冲液2.0μldntp(10mm)1.0μldtt1.0μlpowerscriptreversetranscriptase1.0μl混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，42℃孵育1.5h后，70℃孵育7min，加入100μl灭菌水稀释产物。将稀释后的模板cdna置于-20℃保存；3’端race的pcr扩增：利用巢式pcr方法，进行两轮pcr反应扩增出lfrfamide基因3’端race片段序列。反应体系如下：1）巢式pcr第一轮反应。0.2ml离心管中加入以下反应体系：灭菌水29.1μl10×advantage2pcr缓冲液4.0μldntp(10mm)0.8μl50×advantage2polymerasemix0.8μl3’racecdna2.5μl3’-lfrfamide-outter5.0μl3'raceouterprimer1.0μl混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，反应程序为：94℃2min；94℃5s，68℃10s，72℃3min，20个循环；72℃5min；2）将第一轮1）中扩增产物用作此轮模板。第二轮反应体系如下：灭菌水29.1μl10×advantage2pcr缓冲液4.0μldntp(10mm)2.5μl50×advantage2polymerasemix0.8μl第一轮pcr产物0.8μl3’-lfrfamide-inner5.0μl3'raceinnerprimer1.0μl混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，反应程序为：94℃2min；94℃5s，68℃12s，72℃3min，20个循环；72℃6min。电泳检测pcr产物，扩增后的产物经过琼脂凝胶电泳后在成像系统中的条带如图3所示，由图3可知3′race产物为359bp条带；3）将pcr产物进行切胶回收和克隆连接，并将阳性克隆送至上海生工测序；2.5’端race模板cdna制备：以虎斑乌贼脑组织总rna为模板，获得扩增5’race片段所需的模板cdna后，利用巢式pcr来扩增5’race片段。实验操作根据试剂盒提供说明书进行；1）0.2ml离心管中加入以下反应体系：脑组织总rna1μg5’raceadapter1μldepc处理水补至15.5μl混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，70℃孵育10min后，快速移至冰上静置2min；2）向上一步1）中的反应液中加入以下反应体系：10×pcrbuffer2.5μlmgcl2(25mm)2.5μldntp(10mm)1.0μl0.1mdtt2.5μl混匀反应液，轻微离心，将离心管置于pcr内，42℃孵育1min；加入1μl的sperscripttmⅱrt，42℃孵育50min后，70℃孵育15min；加入1μl的rnasemix，37℃孵育30min；3）纯化cdna：加入120μl的solutionⅰ至cdna中，将混合液移至离心柱中，在10000rpm离心率条件下，离心30s，将离心柱取中，吸出液体；加入350μl的solutionⅱ，12,000rpm离心20s，除上清，重复2次；70%乙醇洗涤2次；12000rpm离心60s，除乙醇；更换离心管，向离心柱中加入50μl灭菌水，相同离心率条件下，离心60s，便可获得纯化产物；4）加尾反应，反应体系如下：depc处理水6.5μl5×tailingbuffer5.0μl2mmdctp2.5μl已纯化cdna10.0μl混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，94℃孵育3min后，迅速冰上静置1min；加入1μl的tdt；37℃孵育10min，65℃热激tdt10min；加入100μl灭菌水稀释产物。将稀释后的模板cdna置于-20℃保存；5’端race的pcr扩增：1）巢式pcr第一轮反应。0.2ml离心管中加入以下反应体系：灭菌水31.5μl10×pcrbuffer5.0μlmgcl2(25mm)3.0μldntp(10mm)1.0μl5’raceouterprimer2.0μl5’-lfrfamide-outter2.0μl加尾cdna5.0μltaq酶0.5μl混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，反应程序为：94℃2min；94℃30s，60℃35s，72℃45s，32个循环；72℃8min。2）将第一轮1）中扩增产物用作此轮模板。第二轮反应体系如下：灭菌水31.5μl10×pcrbuffer5.0μlmgcl2(25mm)3.0μldntp(10mm)1.0μl5’raceinnerprimer1.0μl5’-lfrfamide-inner1.0μl第一轮pcr产物5.0μltaq酶0.5μl混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，反应程序为：94℃2min；94℃30s，62℃30s，72℃40s，30个循环；72℃8min。电泳检测pcr产物，扩增后的产物经过琼脂凝胶电泳后在成像系统中的条带如图4所示，由图4可知5′race产物为487bp条带；3）将pcr产物进行切胶回收和克隆连接，并将阳性克隆送至上海生工测序。⑥序列信息分析方法：使用lasergene软件对lfrfamide基因的3’端、5’端和核心片段的序列进行拼接，从而获得完整的虎斑乌贼lfrfamide基因的cdna全长序列。predictprotein和scratchproteinpredictor等在线工具可用来对lfrfamide基因进行开放阅读框（orf）预测，以及推测该orf所编码的氨基酸序列。应用在线分析站点signalpv3.0对氨基酸序列进行信号肽预测。应用ncbi对氨基酸序列进行blast(blastxandblastn)分析，应用clustalw2对lfrfamide及其同源基因的氨基酸序列进行比对分析。lfrfamide前体蛋白相对分子质量同等电点的估算使用的是expasy-protparam在线分析软件。使用megav5.0软件进行基于nj法的进化树构建，重复1000次循环。如图5所示，虎斑乌贼神经肽lfrfamide基因cdna全长860bp，开放阅读框567bp，编码188个氨基酸，5’非编码序列91bp，3’非编码序列202bp。使用在线信号肽预测工具对lfrfamide基因前体蛋白氨基酸序列进行信号肽预测分析发现，lfrfamide基因前体蛋白含有一段长22个氨基酸的信号肽。进一步对开放阅读框序列进行分析后发现，虎斑乌贼lfrfamide基因可能编码4种不同的类lfrfamide多肽（flps）成熟产物：1拷贝的六肽nslfrfamide，3拷贝的六肽gnlfrfamide，1拷贝的五肽tifrfamide，1拷贝的七肽phtpfrfamide。前体蛋白相对分子质量(mw)为21.5kda，等电点(pi)为9.40。在氨基酸序列中，每个flp的c端均连接精氨酸-脯氨酸-甘氨酸，表明这些flp可能都可能存在酰胺化后修饰现象。而n-端连接的赖氨酸-精氨酸残基和在c-端连接赖氨酸-精氨酸或精氨酸残基都可能在所有这些flp的翻译后修饰过程中充当氨基酸序列的内部剪切位点。⑦lfrfamide基因氨基酸序列同源比对及系统进化分析：用clustalw2在线分析网站（http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/）对虎斑乌贼lfrfamide前体蛋白进行保守性分析。如图6所示，比对结果表明同源序列比对结果显示虎斑乌贼（s.pharaonis）lfrfamide基因与曼氏无针乌贼（s.japonica）和商乌贼（s.officinalis）sofarp2相似性均为96%，与静水椎实螺（lymnaeastagnalis）、太平洋牡蛎（crassostreagigas）、海蜗牛（aplysiacalifornica）相似度分别是54%、40%和41%。⑧虎斑乌贼系统进化分析：选取45条flp序列，基于nj法进行进化树的构建。如图7所示，虎斑乌贼lfrfamide与商乌贼的sofarp2、曼氏无针乌贼lfrfamide亲缘关系较近，属flps的lfrfamide亚族成员。虎斑乌贼lfrfamide基因cdna序列全长860bp，编码188个氨基酸，前体蛋白包含一段长22个氨基酸的信号肽和4种不同的成熟肽产物：1拷贝的六肽nslfrfa、1拷贝的五肽tifrfa、1拷贝的七肽phtpfrfa和3拷贝的六肽gnlfrfa。这种由单个基因编码多种不同拷贝产物的特点与典型的软体动物flps基因结构相同。虎斑乌贼lfrfamide基因flps产物n-端结构与曼氏无针乌贼、静水椎实螺、太平洋牡蛎、海蜗牛的lfrfamide同源序列产物存在差异。如静水椎实螺同源序列的产物有ntlfrfa、qgslfrfa、ggslfrfa、gtllrfa、tlfrfa和pqgslfrfa海蜗牛的有ggalfrfa、gslfrfa和stlfrfa。同flps家族成员fmrfamide产物的n-端扩展结构同样多变，而在同一物种中发现存在不同fmrfamide受体以及不同fmrfamide对同一组织的不同作用效价等，推测lfrfamide与fmrfamide类似，其n-结构在识别、激活受体过程中起调节作用。通过对虎斑乌贼lfrfamide基因氨基酸序列与其他同源序列的比对分析，发现lfrfamides基因c-端的frf是高度保守的，而n-端氨基酸组成结构多变，推测c-端结构在识别、激活受体过程中是必不可少的。frf的c-端接着甘氨酸，表明lfrfamide成熟产物可能存在翻译后酰胺化修饰现象，该酰胺化修饰作用可能与防止多肽降解有关，这在静水椎实螺中已经得到证实。虎斑乌贼lfrfamide基因氨基酸序列与曼氏无针乌贼lfrfamide基因氨基酸序列和商乌贼sofarp2基因氨基酸相似度均为96%，表明它们亲缘关系较近，而它与静水椎实螺、太平洋牡蛎、海蜗牛lfrfamide同源序列比对相似度分别为54%、40%和41%，且它们的成熟产物的n-端之间存在较大差异，推测lfrfamide基因在软体动物进化过程中，成熟肽c-端frf结构对动物体起重要作用。gnlfrfamide在商乌贼外围组织的定位以及静水椎实螺的northern杂交实验表明，在软体动物门物种中至少存在2个独立且分属不同亚族的flps基因。在过去的研究中，sofarp2属于farps亚族，但分析进化树（图7）结果，发现sofarp2与属于lfrfamide亚族的曼氏无针乌贼lfrfamide和静水椎实螺lfrfamide基因关系更近，且虎斑乌贼和曼氏无针乌贼、商乌贼同属一支，属flps的lfrfamide亚族成员。目前对于fmrfamide和lfrfamide之间的关系尚不清楚，但曼氏无针乌贼lfrfamide的表达模式与商乌贼fmrfamide的表达模式相似，如lfrfamide基因和fmrfamide基因在色素囊的调节作用中都扮演重要角色。虎斑乌贼神经肽lfrfamide基因cdna全长860bp，开放阅读框(openreadingframe，orf)567bp，编码188个氨基酸，5’非编码区(5’-utr)91bp，3’非编码区(3’-utr)202bp，前体蛋白相对分子质量(mw)为21.5kda，等电点(pi)为9.40。前体蛋白包含一段长22个氨基酸的信号肽和4种不同拷贝数的成熟多肽产物。成熟多肽c-端phe-arg-phe(frf)残基较为保守，构建进化树分析后将其归属到lfrfamide亚族。本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12