一种快速鉴定杂交水稻种子纯度的方法与流程

本发明涉及杂交水稻种子纯度鉴定领域，尤其涉及一种快速鉴定杂交水稻种子纯度的方法。
背景技术：
：杂交水稻的推广对大幅度提高我国的粮食产量起了巨大的推动作用。但由于种子纯度问题给农户造成严重减产的事件也常有发生。我国目前鉴定种子纯度的常规方法是田间种植鉴定，往往需要3-4个月的时间。一方面由于环境条件的影响，可能影响纯度鉴定的准确性；另一方面，由于田间鉴定需要时间长，妨碍了种子的销售，有的作物当年的种子要等到第二年才能销售。建立一套准确、快速、稳定、简单的杂交水稻种子纯度鉴定方法，对于我国杂交水稻的推广应用具有重大意义。技术实现要素：为克服现有技术的不足，本发明提供一种快速鉴定杂交水稻种子纯度的方法。本发明提供的一种快速鉴定杂交水稻种子纯度的方法，包括以下步骤：(1)提取供试水稻种子基因组dna或供试水稻种子培育成幼苗后提取幼苗基因组dna；(2)引物筛选：以seqidno.1～48所述的24对引物进行筛选，找出供试水稻种子双亲互补的带型清晰的多态性引物；(3)纯度鉴定：取符合统计学要求数量的供试水稻种子或幼苗的基因组dna作为模板，以(2)筛选得到的带型清晰的多态性引物分别进行pcr扩增；(4)扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察并统计结果：真正的杂交f1带具有双亲互补的带型，是双带；而混杂的亲本和其他常规稻种子为单带；杂交水稻种子纯度(％)＝(供试幼苗数-异品种幼苗数)÷供试幼苗数×100％；所述异品种苗数即供试水稻种子中混杂的与双亲互补的带型不同带型的苗数。本发明的方法中，步骤(1)提取dna的方法不需要用液氮研磨、以及氯仿抽提、离心纯化和dna沉淀的步骤。本发明的方法中，步骤(1)提取dna的方法可参考中国专利cn105002163a的提取dna的方法进行。步骤(1)提取水稻幼苗dna的方法为在水稻幼苗中加入氢氧化钠水溶液，沸水中煮20s～40s后加入盐酸水溶液和缓冲溶液，继续在沸水中煮1～3min，得到水稻dna样品；所述缓冲溶液包括tris溶液和igepal-630溶液；所述氢氧化钠水溶液、盐酸水溶液和缓冲溶液的体积比为2:2:1。24对引物是发明人从我国生产上推广的500个杂交稻组合中筛选得到的可用于杂交水稻品种鉴定的24对特异性引物，见表1。表1用于纯度鉴定的24对ssr多态性引物其中，步骤(2)符合统计学要求数量为96的n倍，n为大于1的整数。本领域技术人员可根据24对引物所对应的各品种水稻，可从中选择1对或多对具有双亲互补带型的引物进行检测，例如在本发明的实施例中，对于y两优1号(f1)种子的纯度检测，选择rm242(seqidno.5-6)对其进行pcr检测，按照本发明所述的方法即能够实现对y两优1号(f1)种子的纯度检测。通常选择具有双亲互补带型的引物进行检测的误差在0.3％以内。每个品种检测192粒种子，每96粒为一组，若两组之间异品种幼苗数的误差在3株以上，则重复做96粒。步骤(2)pcr扩增体系为，总体系为10μl时，10×buffer1μl，2mm的dntp0.5μl，5u/μl的taqgold0.04μl，模板dna1μl，上下游引物各0.1μl，h2o7.26μl。步骤(2)pcr扩增方法为，94℃预变性4分钟；94℃变性15秒，55℃结合15秒，72℃延伸30秒，扩增35个循环；72℃延伸5分钟。本发明的优点在于，本发明以遗传物质dna为依据，杂种f1具有父母本共同的遗传基础，对品种或组合有特异性，本方法筛选得到的引物，f1具有双亲互补的带型，凝胶通过染色后，能清楚的分辩出来。因而具有准确可靠的特点。单粒种子幼苗进行dna提取、扩增。以单粒种子为对象进行dna提取进行真实性检验的方法，跟单本种植进行单株真实性鉴定本质相同。单粒种子的真实性鉴定结果比种植鉴定的人为误差及环境误差更小，因而更加科学、可信。本发明方法简便快捷，经济实用，从种子或幼苗dna提取至得到纯度结果可在3小时内完成，可用于杂交水稻种子的质量检测。与大田种植鉴定相比，本发明方法节约时间，提高效率，整个试验在室内完成，完全不占用土地资源，节约土地：本发明方法可以对一个有争议的样品短期内可以进行若干次试验，这是种植鉴定无法比拟的优点。附图说明图1为引物rm242对y两优1号(f1)种子进行纯度鉴定的结果，上排自左至右分别为dnamarker和泳道1-24；泳道1为恢复系种子(父本种子)，泳道2为f1种子，泳道3为不育系种子(母本种子)，其他为待检测的不同y两优1号(f1)种子dna检测结果。上排泳道7、9、11是恢复系种子dna图谱，下排泳道6、8、10不育系种子dna图谱，其他为真正的杂交种子)。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明实施例所用的水稻材料均为公知共用的水稻材料。实施例1快速鉴定水稻种子纯度的方法1、幼苗的培养取500粒种子，用清水冲洗干净，浸种1-2天(依气温而定)，32℃发芽3-7天，剪取1厘米长的幼苗放入96孔pcr板中(如是种子刚萌动，则将萌动的种子倒立放入孔中)。幼苗可立即用于dna的提取，或贮存于-20℃冰箱中保存备用。2、dna提取幼苗放入96孔pcr板的96个孔中，每孔1根苗。每孔加入40μldna提取试剂1，在沸水中30秒，然后加入40微升dna提取试剂2和20微升dna提取试剂3，放入沸水中2分钟，分别提取得到不同品种的dna样品，用1μl进行pcr扩增。结果表明，采用本发明提供的方法可在2.5小时内得到水稻品种的纯度结果。dna提取试剂1：250mmnaoh。dna提取试剂2：250mmhcl。dna提取试剂2：500mmtris(ph8.0)，0.25％(v/v)igepal-630。3、引物筛选：以seqidno.1～48所述的24对引物进行筛选，找出供试水稻种子双亲互补的带型清晰的多态性引物；4、pcr反应采用3筛选得到的带型清晰的多态性引物，以步骤2得到的水稻dna为模板，分别进行pcr。pcr反应在96孔pcr板中进行，反应体积为10微升。扩增反应条件为：94℃变性4分钟；然后是94℃15秒，55℃15秒，72℃30秒进行35个循环；最后72℃延伸7分钟。反应采用96孔pcr盘在pcr扩增仪上进行。表1不同体系pcr的配制情况1管25管100管10xbuffer1μl(1x)25μl100μldntp(2mm)0.5μl12.5μl50μltaqgold(5u/μl)0.04μl(0.02u/μl)1.0μl4.0μldna1μl(2-5ng/μl)primer(5μm)0.2μl5μl20μlh2o7.26μl181.5μl726.0μl总体积10μl250μl1000μl5、凝胶电泳：扩增产物在4％的琼脂糖凝胶进行电泳分离，溴化乙锭染色后在紫外光下观察拍照。通常情况下，通常选择具有双亲互补带型的引物进行检测的误差在0.3％以内。本领域技术人员可根据24对引物所对应的各品种水稻，可从中选择1对或多对具有双亲互补带型的引物进行检测。以水稻y两优1号(f1)种子的纯度检测为例，可选择rm242(seqidno.5-6)对其进行pcr检测，按照本发明的方法即能够实现对y两优1号(f1)种子的纯度检测，结果见图1。通过本发明的方法，可以清楚地鉴定出水稻y两优1号(f1)种子的父本和母本以及真正的杂交种子。6、结果统计本实施例中，由于采用96孔板，故纯度鉴定每个品种检测192粒种子，以每96粒作为一组，若两组之间异品种幼苗数的误差在3株以上，则重复作96粒。真正的杂交种子是双带，而混杂的亲本和其他常规稻种子为单带。品种纯度(％)＝(供试幼苗数-异品种幼苗数)÷供试幼苗数×100％采用上述方法即可实现快速鉴定杂交水稻种子纯度，准确率高，省时省力，具有良好的推广应用前景。序列表<110>湖南省农业生物技术研究中心<120>一种快速鉴定杂交水稻种子纯度的方法<160>48<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ccactttcagctactaccag20<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cacccatttgtctctcattatg22<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tcgaagccatccaccaacgaag22<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4tccgtacgccgacgaggtcgag22<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ggccaacgtgtgtatgtctc20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6tatatgccaagacggatggg20<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7tgccctgttattttcttctctc22<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ggtgatcctttcccatttca20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9tctgcaagccttgtctgatg20<210>10<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10taagtcgatcattgtgtggacc22<210>11<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11ggcttcatctttggcgac18<210>12<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12ccggattcacgagataaactc21<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13cccaggctagctcatgaacc20<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14gctacgtttgagctaccacg20<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15agcagctatagcttagctgg20<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16actgcacatgagcagagaca20<210>17<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17gcgaaaacacaatgcaaaaa20<210>18<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18gcgttggttggacctgac18<210>19<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19acagtatccaaggccctgg19<210>20<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20cacgtgagacaaagacggag20<210>21<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21tctttggaggcgagc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