本发明属于植物鉴定领域，特别涉及一种鉴别“龙头凤尾”型优质铁皮石斛的方法及其应用。
背景技术：
铁皮石斛(dendrobiumofficinalekimuraetmigo)为兰科石斛属多年草本附生植物，是名贵中药西枫斗的原植物，具有养阴生津，温胃明目，润喉护嗓，补肾益力的功效，是养阴要药，唐代医学经典《道藏》中，其被誉为“中华九大仙草之首”，1987年被列入国家重点保护的濒危珍稀植物名录。而“龙头凤尾”型铁皮石斛更是极品，价格昂贵，国际市场价格为3000美元/公斤。铁皮石斛富含多糖等有效成分，现代医学研究表明其对咽喉疾病、心脑血管疾病、糖尿病、白内障等具有不错的疗效，还具有抗肿瘤，抗衰老，增强人体免疫力及抗炎等作用。
随着野生资源的减少和药材需求的上升，云南、浙江、江苏、广东等几个大产区的铁皮石斛基地相继建成，人工栽培的铁皮石斛药材顺理成章的成为了市场药材商品的主源。规范其生产全过程，最大限度保证药材内在质量的可靠性是实施中药材gap核心，更是临床用药有效、安全、稳定的保证。然而，由于中药材原植物来源甚多、商品规格、品名繁多，受多重因素的影响，药材的质量和临床疗效不稳定，消费者对其品质大多持保留态度，对于其混乱的市场更是“雾里看花”。因此，选育铁皮石斛有效成分(多糖含量)含量高的优质基因型，培育优质铁皮石斛新品种，获得来源稳定且高产优质的铁皮石斛原药材是企业品牌打造及实施gap建设中药材规范化基地的一项重要内容。
传统的石斛质量鉴定以形态、感官为主，如茎粗、质重、嚼之粘牙、味甘、无渣等传统方法为指标，但这种方法并不能完全体现药材的内在质量，也不利于产业管理的规范化。
因此，有必要研究一种能鉴别“龙头凤尾”型优质铁皮石斛的方法。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种鉴别“龙头凤尾”型优质铁皮石斛的方法。
本发明的另一目的在于提供所述鉴别“龙头凤尾”型优质铁皮石斛的方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种鉴别“龙头凤尾”型优质铁皮石斛的方法，包括如下步骤：
(1)提取待检测石斛的基因组；
(2)使用如下三对引物对步骤(1)获得的基因组进行pcr，当获得目的条带时，表明待检测的石斛是“龙头凤尾”型优质铁皮石斛；当没有获得目的条带时，表明待检测的石斛不是“龙头凤尾”型优质铁皮石斛；
三对引物对以及目的条带的长度如下：
sc-1l：5’-tggctaccacgtgatagatgt-3’；
sc-1r：5’-gtttcttaggaggaattgctcag-3’；
sc-2l：5’-tccagcggaaagggagatac-3’；
sc-2r：5’-actttccctcccaagctgag-3’；
sc-3l：5’-ctcgccatatcgtcgagca-3’；
sc-3r：5’-acgttctgttatggggtcct-3’；
sc-1l和sc-1r扩增的目的条带长度为523bp；
sc-2l和sc-2r扩增的目的条带长度为1017bp；
sc-3l和sc-3r扩增的目的条带长度为1196bp。
所述的优质铁皮石斛指的是外型茎节粗短、多糖含量≧45％的铁皮石斛；优选为茎节节长≦15厘米、直径≧7毫米，多糖含量≧45％的铁皮石斛；更优选为茎节节长为8-15厘米、直径为7-9毫米，多糖含量为45～46％的铁皮石斛。
步骤(1)中所述的基因组可通过常规方法或植物基因组提取试剂盒进行提取。
步骤(2)中所述的pcr的条件优选为：94℃预变性4分钟；94℃变性50秒、58℃退火45s、72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。
步骤(2)中所述的pcr可为三对引物分别对待检测石斛的基因组进行扩增，或是三对引物在同一反应体系中对待检测石斛的基因组进行扩增。
所述的鉴别“龙头凤尾”型优质铁皮石斛的方法在鉴定和/或生产优质铁皮石斛中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明发明人经过对不同多糖含量的石斛的遗传多样性进行研究，得到了外型茎节粗短、多糖含量≧45％的优质铁皮石斛的特异性位点，以此位点进行引物设计，得到一种鉴别“龙头凤尾”型优质铁皮石斛的方法。这有利于优质铁皮石斛的育种、生产以及产业管理的规范化。具体优点如下：
1)样品用量少，仅需少量样品就可以完成整个操作；
2)准确度、灵敏度高；
3)方法简单，采用pcr技术进行检测，时间短，当日即可完成；
4)及早诊断，三年生的铁皮石斛多糖含量才能稳定，若通过含量测定或者外型判断需要培育三年，通过该方法，在幼苗期即可诊断。
附图说明
图1是对11种石斛进行检测的pcr扩增电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
所用的石斛c1、c2、c3三种类型是从浙江天台山海拔500～1000米的高山区域采集的野生铁皮石斛经过东莞市睿绅生物技术有限公司长期驯化形成的铁皮石斛品系，表现出不同的园艺特性和多糖含量，可从东莞市睿绅生物技术有限公司购买得到；其他石斛(c4～c11)均由东莞市睿绅生物技术有限公司提供，分别从中国(奉化)第八届石斛产业发展论坛及中国(农陵)第十届石斛产业发展论坛设立的石斛展销市场购得，供测试品种如表1所示。铁皮石斛‘c1’茎长为8-15厘米，直径7-9毫米，与其他十个石斛品种的相比，茎较粗，茎节短，且测得其多糖含量高达45.34％，为“龙头凤尾”型铁皮石斛；c2～c11等10个石斛品种不具备“龙头凤尾”特质。
表1测试的石斛品种特性一览表
实施例1
1、基因组dna的提取(植物基因组dna提取试剂盒dp305，北京天根生化)：
(1)取植物新鲜组织约100g，加入液氮充分研磨。
(2)将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μl65℃预热缓冲液gp1的离心管中(实验前在预热的gp1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％)，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品次数。
(3)用酚：氯仿＝1:1配比的混合液进行等体积抽提。
(4)加入700μl氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min。
(5)小心将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μl缓冲液gp2，充分混匀。
(6)将混匀的液体转入吸附柱cb3中，12000rpm离心30s，弃掉废液。
(7)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
(8)向吸附柱cb3中加入600μl缓冲液pw，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
(9)重复操作步骤(8)。
(10)将吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附柱材料中残余的漂白液。
(11)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，即得。
(12)dna质量和浓度检测用超微量紫外可见分光光度计在230nm、260nm和280nm时吸光值，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳(电压120v约20min)并用凝胶成像系统(bio-rad)观察拍照，检测dna样品的提取效果(完整性)，同时用超微量紫外分光光度计测定其浓度和纯度，根据检测结果将dna浓度稀释至20ng/μl，-20℃保存备用。
2、pcr扩增
(1)通过对不同多糖含量的石斛的遗传多样性进行研究，得到外型茎长、茎节粗度、多糖含量≥45％的铁皮石斛性状与“龙头凤尾”优质铁皮石斛相关的特异性位点，使用在线程序blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)分析测序dna的同源性，分析发现三个特异位点，根据特异位点设计三对特异性引物(表2)，并由华大基因合成。
表2特异位点的引物设计
(2)pcr扩增
pcr扩增采10μl体系，不足用ddh2o补足，具体如下：5μlex-taqpcrmastermix(rr003a,takara)，1μl2.5mm引物(分别为引物对sc1、sc2、sc3)，1μl模板dna和ddh2o。使用96孔arktiktmpcr仪(thermofisherscientific)进行反应：94℃预变性4分钟；94℃变性50秒、58℃退火45s、72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。扩增反应结束后，取8μl扩增产物，加入2μl6倍浓度的上样缓冲液，在1.0％的琼脂糖凝胶(含核酸染料
用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测的pcr结果，电泳图如图1所示：在“龙头凤尾”型铁皮石斛‘c1’中扩增了3个明确的目标条带，大小片段分别为523bp、1017bp、1196bp：但在其他10种其他石斛栽培品种中没有扩增出三个目标条带。因此，本实验筛选出了引物sc1、sc2和sc3用于将“龙头凤尾”型铁皮石斛‘c1’与其他10种石斛栽培品种区分开来。
实施例2
1、石斛试管苗基因组dna的提取
取石斛c1～c11的植物无菌试管苗各100g提取植物dna，提取方法同实例一之基因组dna的提取。
2、pcr分析
方法同实施例1，同样采用三个引物对sc1、sc2和sc3分别进行pcr，其结果在“龙头凤尾”型铁皮石斛‘c1’中扩增了3个明确的目标条带，在其他10种其他石斛栽培品种中没有扩增出目标条带。因此，本实例证明，引物sc1、sc2和sc3在试管苗时期就可以将“龙头凤尾”型铁皮石斛‘c1’与其他10种石斛栽培品种区分开来。
实施例3
1、“龙头凤尾”型铁皮石斛‘c1’自交及育苗
5月，将铁皮石斛‘c1’第一批花蕾绽放时的当天上午，取雄蕊花药与同花的雌蕊柱头自交，10月中旬荚果成熟时，摘下荚果，表面消毒，将荚果内的种子取出置于ms基本培养基上无菌培养(不加任何外源激素)，2个月后分化出试管小苗，单株培养扩繁形成单克隆植株。
2、单克隆植株植物dna提取
方法同实施例2之植物试管苗基因组dna的提取。
3、pcr分析
方法同实施例1，同样采用三个引物sc1、sc2和sc3分别进行pcr，其结果在“龙头凤尾”型铁皮石斛‘c1’自交单克隆植株中均扩增了3个明确的目标条带，说明每个单克隆植株均含有“龙头凤尾”型铁皮石斛‘c1’之特异基因片段。
4、栽培特性观察及多糖含量测定
将“龙头凤尾”型铁皮石斛‘c1’自交系试管苗植株移栽后栽培3年，按照《中国药典》(2015版)方法检测其三年生茎石斛多糖含量，其平均值达45.10％。
实施例4
1、“龙头凤尾”型铁皮石斛‘c1’与“c2”自交及育苗
5月份，将铁皮石斛‘c1’与常规铁皮石斛“c2”在第一批花蕾绽放时前，首先去掉“c2”雄蕊花药，取‘c1’雄蕊花药与“c2”的雌蕊柱头杂交；或者先去掉“c1”雄蕊花药，取‘c2’雄蕊花药与“c1”的雌蕊柱头杂交。10月中旬荚果成熟时，摘下荚果，表面消毒，将荚果内的种子取出置于ms基本培养基
上无菌培养(不加任何外源激素)，2个月后分化出试管小苗，单株培养扩繁形成单克隆植株。
2、杂交试管苗单克隆植株dna提取
方法同实例二之植物试管苗基因组dna的提取。
3、pcr分析
方法同实施例1，同样采用三个引物sc1、sc2和sc3分别进行pcr，其结果在杂交单克隆植株中有5个杂交单克隆植物扩增出3个明确的目标条带，而4个单克隆植株不能扩增出3个目标条带。说明在杂交的单克隆植株只有部分植株均含有“龙头凤尾”型铁皮石斛‘c1’之特异基因片段，而另一部分部分植株不含有“龙头凤尾”型铁皮石斛‘c1’之特异基因片段，因为常规铁皮石斛“c2”作为母本不含有特异基因片段，导致杂交后代部分植株不含有特异基因片段。
该实例同样也证明三对引物sc1、sc2和sc3分别进行pcr，可以鉴定“龙头凤尾”型铁皮石斛。
实例5
(1)从北京同仁堂药店购买“龙头凤尾”铁皮枫斗(铁皮石斛加工的干品)200g，其石斛多糖为45％，单茎枫斗(茎长约8～10cm)。将枫斗用粉碎机进行粉碎，过50目，取100g提取植物dna，提取方法同实例1。
(2)pcr分析
pcr扩增方法同实施例1。采用三个引物对sc1、sc2和sc3分别进行pcr，结果扩增出3个明显的目标条带。证明干品的“龙头凤尾”铁皮石斛与三个特异片段的关联性，同样pcr扩增方法可以用于干品优质铁皮石斛的检测。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>广东轻工职业技术学院
<120>一种鉴别“龙头凤尾”型优质铁皮石斛的方法及其应用
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>sc-1l
<400>1
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<210>2
<211>23
<212>dna
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<212>dna
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<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
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<211>19
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ctcgccatatcgtcgagca19
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>sc-3r
<400>6
acgttctgttatggggtcct20