本发明涉及分子生物学
技术领域：
，进一步涉及筛查遗传性血小板减少症相关基因突变的检测试剂盒及其医学解读数据库，具体涉及一种检测遗传性血小板减少症相关基因群的检测试剂盒。
背景技术：
：遗传性血小板减少症是一类以血小板减少为特征的罕见疾病，临床表现主要为淤点、瘀斑或不同程度的出血症状，没有特异性。迄今为止，在国内，遗传性血小板减少症仍缺乏认识，诊断率低，由于缺乏筛查手段，常被误诊为免疫性血小板减少症，使遗传性血小板减少症一直处于被低估的状态。遗传性血小板减少症涉及到的疾病种类众多，可以根据血小板体积分布曲线、平均血小板体积等参数进行大致鉴别或分类，另外采用edta-k2抗凝血行血涂片及mgg染色或瑞氏染色，可以对血小板形态及颗粒观察，此外流式细胞术检测特定血小板表面蛋白也可以帮助进行临床诊断和鉴别。但是在一些情况下，血细胞计数仪无法准确计数血小板，而且上述检测方法操作繁琐复杂，并且仍然存在很大误诊或漏诊的可能。近年来，对于遗传性血小板减少症分子发病基础研究取得了显著进展，目前已知的主要关于遗传性血小板减少症的致病基因有列表中列出的18个基因，因此通过基因检测能够快速有效的对疾病进行诊断并作出分型。其中分子生物学的实验方法主要有巢式pcr、一代测序等。pcr方法不能直观的得到具的突变序列，而一代测序的方法受到测序通量的影响，无法一次性检测多个基因的全部外显子区域。而二代测序作为一种高通量的检测方法，可以一次性准确测量多个基因的外显子以及相关序列，使精准诊断遗传性血小板减少症成为可能。技术实现要素：本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种检测遗传性血小板减少症相关基因群的检测试剂盒，以解决现有技术中遗传性血小板减少症的诊断方法较为局限，缺乏从分子生物学的角度诊断遗传性血小板减少症的依据。本发明要解决的另一技术问题是现有技术中遗传性血小板减少症的诊断方法准确性较低。为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：一种检测遗传性血小板减少症相关基因群的检测试剂盒，该试剂盒检测如表1所示的18个基因的突变情况：表1遗传性血小板减少症基因群列表上述18个基因，由198个热点突变组成，其突变位点为本领域常规的突变位点，较佳地包括了indel突变位点(插入或缺失引起的序列改变insertionordeletion，indel)、无义突变位点、拼接区突变位点或错义突变位点，更佳地本发明所述的18个基因外显子区域的热点突变如表2所示。表2热点突变列表本发明所述的18个基因外显子区域的热点突变可用于对遗传性血小板减少症做出辅助诊断，本领域遗传性血小板减少症常规的诊断方法有血常规中血小板数量、外周血涂片显微镜检测、血小板功能检测，本发明所述方法较佳地从分子生物学角度对遗传性血小板减少症做出诊断。本发明提供一组检测本发明所述遗传性血小板减少症相关基因外显子区域的多重pcr引物，所述引物的扩增范围包括18个与遗传性血小板减少症相关基因的外显子区域，扩增得到的单个片段长度为275bp左右。利用本发明提供的多重pcr引物，结合二代测序技术，能够检测本发明所述突变基因群中的全部外显子区域。其中所述的二代测序试剂为本领域常规使用的试剂，只要能够满足对所得序列进行二代测序的要求即可。所述试剂制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为市售可得。本发明所述检测试剂盒更佳地还包括将检测对象中提取的基因组dna制成可供测序使用的文库的试剂，该种试剂为本领域常规使用试剂，只要能够满足多重pcr对基因组dna质量的要求即可。所述试剂制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为市售可得。本发明所述检测试剂盒较佳地还包括：dntp溶液，dna聚合酶，用于分离或纯化核酸的是beckman磁珠。本发明所述的样本为检测对象的组织，只要能从检测样本中抽提检测对象的基因组dna即可。所述检测样本较佳地为骨髓、血液、实体瘤样本中的一种或几种，优选地为骨髓样本。一种本发明所述试剂盒的使用方法，其包括以下步骤：(1)利用本发明所述检测试剂盒抽提检测对象的骨髓，提取基因组dna；(2)用多重pcr引物对基因组dna中发明中所述18个遗传性血小板减少症相关基因的外显子区域进行扩增；(3)将步骤(2)中扩增所得的片段制成可供iontorrent测序平台测序的文库；(4)对步骤(3)中所得dna文库进行测序，得到下机数据；(5)对(4)中的下机数据进行生物信息学分析，而后利用医学解读数据库进行解读做出诊断即可。以上各个步骤的具体操作方法详见试剂盒说明书。本发明所用的试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：利用本发明提供的可用于筛查遗传性血小板减少症相关基因突变的基因群，结合高通量测序技术，可以实现在形态学和流式细胞学之外对遗传性血小板减少症进行辅助诊断，特别是对于疾病后续的治疗方向和效果做出预判具有特殊的优势。本发明提供的用于筛查遗传性血小板减少症相关基因突变的基因群的检测试剂盒具有检测效率高、检出率高等优点。具体实施方式以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。材料和方法：在中国医学科学院血液病医院和协和华美医学诊断中心2017年1月至2017年10月诊断的患者中，根据以下标准，我们进行连续性入组(12名)。入选标准为：经临床症状和相关实验室检查诊断为血小板减少症的患者，并且临床医生筛选需要进行基因检测已进行辅助确认是否为遗传性血小板减少症。12名患者的诊断结果如表3所示：表3患者诊断结果列表收集3ml患者外周血提取基因组dna待测，该检测经过中国医学科学院血液病医院伦理委员会批准。样本处理：样本中基因组利用天根dna提取试剂盒(货号：dp318-03)进行抽提，具体操作方法参见试剂盒的使用说明书。用多重pcr引物对基因组dna进行扩增，实验操作方法参见life公司试剂盒的使用说明书。文库的构建：对扩增得到的dna片段使用life公司生产的iontorrent平台建库试剂盒进行测序文库的构建，实验操作方法参见life公司试剂盒的使用说明书。高通量测序：将构建好的测序文库经油包水处理后在iontorrent平台上进行高通量测序，油包水处理方法和高通量测序方法请参考高通量测序仪iontorrent以及其配套设备onetouch的使用说明书。生物信息学分析：首先，使用ionreport软件(v4.6,thermofisher,carlsbad,ca,usa)过滤低质量的测序片段，并将合格的测序片段比对到人类参考基因组hg19(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.html)，使用torrentvariantcaller(v4.6.0.7)子程序检测突变位点，软件参数使用的是默认的设置。此软件已经被优化用于处理iontorrent测序平台特有的错误类型。最后对找出的突变包括snp和indel使用annovar(http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)软件进行注释，注释内容包括突变在基因组中的位置，关联的基因，基因外显子编号，核苷酸水平变异，对应的蛋白水平变异，以及该突变在dbsnp数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)，千人基因组数据库1000genomes(http://www.1000genomes.org/),外显子组整合数据库exac(http://exac.broadinstitute.org/)和人类基因突变数据库hgmd(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)中的注释，polyphen(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和sift(http://sift.jcvi.org/)功能预测结果等。进一步使用一下原则筛选致病突变位点：(1)根据突变所在的基因组位置和类型，过滤掉对蛋白产物序列不产生影响的突变；(2)利用1000genomes数据和exac数据，注释每个突变在人群中的比例，如果比例小于等于1％则不认为是多态性位点；(3)检索人类基因突变数据库，查询一个突变在hgmd中是否有记载，其出现在遗传性血小板减少症等相关疾病中；(4)利用蛋白质功能预测软件polyphen-2和sift预测该突变是否影响蛋白功能；(5)如果经过(2)(3)(4)后，一个突变满足“非多态性”、“遗传性血小板减少症记载过”和“影响蛋白功能”这三条中至少两条的，将被判为与疾病可能相关。最后，如果一个突变虽然不满足(5)但是在hgmd中有记录，则被判读为意义不明的突变。最后如果一个突变在文献中被明确记载与疾病高度相关，则直接判为热点突变。统计分析：统计每个基因携带致病突变的比例，筛选出突变率最高的基因，使用的软件为excel。医学解读：用医学解读数据库对生物信息学分析得出的基因突变型做出分子病理诊断。所用的医学解读数据库如下：(1)已知actn1基因突变与血小板型出血性疾病15相关，血小板型出血性疾病15是一类常染色体显性遗传病。患者通常没有或仅有轻微的出血倾向。实验室研究显示血小板数量减少，血小板体积增大，红细胞大小不均。电镜显示血小板可无其他异常，血小板功能没有明显的缺陷。(2)已知ankrd26基因突变与遗传性血小板减少症2型相关，遗传性血小板减少症2型是一种常染色体显性遗传病。特征为血小板数量减低，血小板体积大小正常，中度出血倾向，正常的血小板功能，巨核细胞数量和成熟阶段正常，提示血小板产生和释放障碍。(3)已知cycs基因突变与遗传性血小板减少症4型相关，遗传性血小板减少症4型是一种常染色体显性遗传病。特征不很明确。患者血小板通常具有正常的大小和形态，仅数量轻微部分减少，但出血期并未延长。(4)已知etv6基因突变与血小板减少伴肿瘤易感相关。血小板减少伴肿瘤易感是一种常染色体显性遗传病，临床特征为血小板减少、红细胞增大且易患all，亦可发生其他实体肿瘤。(5)已知gata1基因突变与x连锁性血小板减少症伴红细胞生成障碍相关，x连锁性血小板减少症伴红细胞生成障碍是一种x连锁隐性遗传病。血小板成熟障碍导致血小板减少伴小血小板，可伴有不同程度的红细胞生成障碍。(6)已知gp1ba，gp1bb，gp9基因突变与巨大血小板综合征相关，巨大血小板综合征通常为常染色体隐性遗传病，显性遗传少见，杂合子无出血倾向或仅有轻微的出血。主要是由于gpib/ⅸ复合物先天性质或量的缺陷所致。以出血时间延长、血小板数量减少、血小板体积巨大为特征，血小板有粘附缺陷，瑞斯托霉素诱导的聚集反应减低，对凝血酶特别是低浓度的凝血酶的反应也降低。(7)已知gp1ba基因突变与血小板型vwd相关，血小板型vwd是一种常染色体显性遗传病，基本缺陷是gpib的分子异常。血小板对瑞斯托霉素诱导聚集能力增强，血浆fviii-vwf水平降低，临床表现与2b型vwd类似。(8)已知hoxa11基因突变与无巨核细胞性血小板减少伴桡尺骨骨性融合相关，无巨核细胞性血小板减少伴桡尺骨骨性融合是一种常染色体显性遗传病，患者出生时有严重的红细胞正常性的血小板减少以及巨核细胞缺如，但是和camt不同，本病患者主要表现出近端桡尺骨性融合，亦可出现其他骨骼异常，例如屈指和髋臼变浅。(9)已知mpl基因突变与先天性无巨核细胞血小板减少症相关，先天性无巨核细胞血小板减少症是一种遗传性骨髓衰竭综合征，骨髓中巨核前体细胞降低或缺失是其显著特征。患者通常发生严重的血小板减少症，但在出生时一般不伴有其他身体异常。如不及时治疗，camt可能进展为重型再生障碍性贫血或白血病。(10)已知myh9基因突变与myh9相关疾病相关，myh9相关疾病是一组常染色体显性遗传病。may-hegglin综合征临床表现为不同程度的出血及感染，实验室检查为血小板减少和巨大畸形、粒细胞胞浆中有包涵体(dohle小体)。其他综合征除了血小板异常外，还可能出现肾炎、听力障碍、白内障等其他异常。(11)已知nbeal2基因突变与灰色血小板综合征相关，灰色血小板综合征是一种常染色体隐性遗传病。瑞氏染色后增大的血小板在光镜下呈灰色。本病以血小板α颗粒及其所含蛋白质减少或缺失为特征。临床上以轻中度出血为主要表现，常伴有血小板减少、脾肿大及骨髓纤维化等。(12)已知prkacg基因突变与血小板型出血性疾病19相关，血小板型出血性疾病19是一种常染色体隐性遗传病，患者幼年起病，主要临床证为反复出血，表现有鼻衄以及自发性血肿等，女性患者多有月经过多。实验室检查表现为严重的血小板减少，90％血小板增大。骨髓活检显示异常的巨核细胞聚集，但巨核细胞的分化以及倍体没有明显异常。(13)已知rasgrp2基因突变与血小板型出血性疾病18相关，血小板型出血性疾病18是一种常染色体隐性遗传病，患者出血症状不一，且在婴幼儿时期即可出现。患者血小板聚粘附功能缺陷，可能伴有巨核细胞发育障碍。(14)已知rbm8a基因突变与血小板减少伴桡骨缺失(tar)综合症相关，血小板减少伴桡骨缺失(tar)综合症是一种常染色体隐性遗传病，临床特征为巨核细胞生成障碍导致血小板减少，伴双侧桡骨缺如。患者幼年即可出现出血症状，骨髓中巨核细胞以及血小板前体细胞减少。(15)已知runx1基因突变与家族性血小板紊乱伴aml易感相关，家族性血小板紊乱伴aml易感是一种常染色体显性遗传病，患者从出生起患者血小板计数水平轻度下降，血小板大小正常，往往有出血倾向。从已报道的家系中，有超过1/3的家庭成员易于进展为aml。(16)已知tubb1基因突变与遗传性巨血小板减少症相关，遗传性巨血小板减少症通常为常染色体显性遗传病，以出血时问延长、血小板减少、血小板巨大为临床特征。骨髓巨核细胞数量和形态可正常。(17)已知was基因突变与wiskott-aldrich综合征相关，wiskott-aldrich综合征是一种x连锁隐性遗传病。是以湿疹、血小板减少伴小血小板、反复感染、易患淋巴系统恶性肿瘤和自身免疫性疾病为特征的原发性免疫缺陷病。使用本发明试剂盒检测结果：12名患者所检测出18个基因的阳性率如下表4所示：表418个基因阳性率列表突变基因突变病例数突变率突变基因突变病例数突变率actn100mpl00ankrd26216.67％myh9216.67％cycs00nbeal200etv618.33％prkacg00gatal00rasgrp200gp1ba00rbm8a00gp1bb00runx100gp900tubb100hoxa1100was18.33％经统计后表明：12例患者中检测到7例为遗传性血小板减少症，其中有2例遗传性血小板减少症2型，2例myh9相关疾病，etv6突变相关的血小板减少症、wiskott-aldrich综合征各1例；其余5例为免疫性血小板减少症患者或再生障碍性贫血患者，而且得出的结论与临床最终诊断相一致。由此可见，使用二代测序的方法对遗传性血小板减少症患者进行辅助诊断，能够有效的与获得性的血小板减少症进行区分，具有诊断准确、获得信息量大的特点。以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12