本发明涉及一种ffpe组织样本的超低频建库方法，主要解决基于ngs测序过程中，ffpe样本的建库测序问题。
背景技术：
：目前ffpe样本的建库方法主要有两类：第一类为双链dna建库方法，该方法不足之处主要表现在以下几个方面：1、双链dna所需建库样本量较大，因此，无法满足临床上的某些组织样本的需要，比如穿刺组织的ffpe样本，5～10年的ffpe样本等；2、由于在建库过程中需要多步纯化过程，因此某些较短的或者超短的dna，单链的dna，严重损伤的dna均被损失，无疑给原本就珍贵的样本雪上加霜，从而造成某些超低频率的突变无法检出；3、由于建库过程需要对某些严重降解的样本进行末端修复，pcr富集，上机测序等，这些过程均存在着引入技术突变的可能性，从而导致检测的不准确。第二类为单链dna建库方法，该方法的不足之处在于：1、在单链建库过程中，单链接头与单链dna的连接具有偏好性，连接效率比较低，导致依然需要较大的起始建库样本量；2、在现有的单链建库中依然存在着与双链dna建库共有的问题，那就是同样存在着无法排除因人为操作引入的突变。技术实现要素：本发明目的在于解决现有技术中的上述问题，提供一种ffpe组织样本的超低频建库方法。本发明为达到上述目的，所采用的技术手段是：一种ffpe组织样本的超低频建库方法，其步骤如下：步骤一、ffpe样本dna的提取；步骤二、dna片段化处理：确定提取的ffpedna样本的降解程度，根据降解程度决定是否打断；步骤三、dna的去磷酸化与变性：使用去磷酸化酶fastap，对dna5’与3’端去磷酸化；步骤四、单链接头的添加：在连接酶的作用下，将单链接头与变性的单链dna进行连接；步骤五、链霉素磁珠捕获与洗脱：利用链霉素与生物素结合的特性，使用带有链霉素的磁珠对步骤四中的连接产物进行捕获，然后变性，洗脱；步骤六、引物退火与延伸：根据单链接头的部分序列，设计引物，并在dntp、酶条件下，进行延伸反应；步骤七、双链第二接头的添加与文库洗脱：使用连接酶将双链第二接头与延伸获得的靶双链dna分子进行连接，使用洗脱洗去残留接头；步骤八、lm-pcr扩增，引入barcode：使用带barcode的引物序列，进行带磁珠的pcr反应，靶向富集dna分子；步骤九、磁珠纯化pcr扩增产物。进一步的，所述步骤一中ffpe样本dna的提取是指：单链接头的获得：按照以下序列信息合成两条序列，adaptor序列：5’pho-gctaccccac-nnnnnnnnnnnn-agatcggaag-xxxxxxxxxxxx-teg-biotin3’；splinter序列：3’nnnnnn-cgatggggtg5’；adaptor序列的纯化：总反应体系为20ul：2ulof10µma序列,16ul1xt4rna连接酶buffer,1ulklenowfragmentofe.colidnapolymerasei,1ult4多久核苷酸激酶；反应条件为37℃，20min,95℃，2min；splinter序列的纯化：总反应体系为20ul：4ulof10µmsplinter序列,14ul1xt4rna连接酶buffer,1ulklenowfragmentofe.colidnapolymerasei,1ult4多聚核苷酸激酶；反应条件为37℃，20min,95℃，2min；将上述20ul的adaptor序列与20ul的splinter序列组成40ul反应体系，pcr仪上杂交，95℃，10s，逐步降低温度至10℃，降温速率为0.1℃/s，合成单链接头；双链第二接头的获得：按照以下序列信息合成两条序列：5’cgacgctcttc-ddc3’5’pho-ggaagagcgtcgtgtagggaaagag*t*g*t*a3’总反应体系为50ul:20ul500µm上链序列，20ul500um下链序列，9.5ultebuffer,0.5ul5mnacl；反应条件为：pcr仪上杂交，95℃，10s，逐步降低温度至10℃，降温速率为0.1℃/s；反应结束后，加入50ul的tebuffer，合成双链第二接头。相关试剂配制：1xbwt+sdsbuffer：1mnacl，10mmtris-hcl(ph8.0)，1mmedta(ph8.0)，0.05%tween-20，0.5%sds；0.1xbwt+sdsbuffer：0.1mnacl，10mmtris-hcl(ph8.0)，1mmedta(ph8.0)，0.05%tween-20，0.5%sds；stringencywashbuffer：49.5ml的ddh20，250ul的20%(wt/vol)sds，250ul的20×sscbuffer；0.1xbwtbuffer：0.1mnacl，10mmtris-hcl(ph8.0)，1mmedta(ph8.0)，0.05%tween-20；tebuffer：49.4ml的ddh20，500ul的1mtris-hcl(ph8.0)，100ul的0.5medta(ph8.0)。进一步的，所述根据降解程度决定是否打断是指：根据凝胶电泳显示的降解程度，将提取的ffpedna样本分为四种类型：无降解，有主带且主带大小大于2k；轻度降解，有主带但主带范围在1k～2k之间；中度降解，无主带，条带弥散，片段范围在100bp～2kb之间；严重降解，无主带，片段大小小于500bp；严重降解的样本，无需打断，直接建库，无降解、轻度降解与中度降解的需要进行超声打断。进一步的，所述步骤三中，去磷酸化反应体系为：8ul10xt4rnaligationbuffe；2ul2%tween20；1ulfastap；xulffpedna；34.6-xulddh20；去磷酸化反应条件为35～39℃，6～15min，然后90～100℃变性1～5min，立即冰浴。进一步的，所述步骤四中，单链接头为带有uid标签与splinter序列的接头，其中uid标签用于标记每条单链dna分子。进一步的，所述步骤四中，连接酶为t4dna连接酶，连接反应的体系为：32ul50%peg-8000；0.4ul100mmatp；1ul单链接头；1ult4dnaligase；45.6ul步骤三变性产物；连接反应温度35～39℃，反应时间35～80min。进一步的，所述步骤五中，使用myonec1磁珠，进行捕获；文库洗脱过程中，先将样本90～100℃变性处理1～10min，立即冰浴后，进行洗脱buffer，洗去splinter序列，弃上清。更进一步的，所述步骤六中，延伸反应使用48ulbuffer回溶磁珠，buffer体系为：39.1ulddh20；5ul10xklenowreactionbuffer；0.4ul25mmdntp；2.5ul1%tween-20和1ul延伸引物(100um)；引物退火条件为：65℃，2min。进一步的，所述步骤七中，连接酶为t4dna连接酶，进行双链第二接头的添加，连接体系为：73.5ulddh20；10ul10xt4dna连接酶buffer；10ul50%peg-4000；2ul第二接头(100um)；2.5ul1%tween-20；2ult4dna连接酶，连接条件为：15～30℃，反应时间35～80min。本发明有益效果在于：针对ffpe组织样本等降解样本的二代测序建库时，提供一种解决办法，其次在建库的初期通过对每一个dna进行标记，从而为后续排除因技术引入突变提供条件。具体实施方式实施例1一种ffpe组织样本的超低频建库方法，其步骤如下：步骤一、ffpe样本dna的提取；步骤二、dna片段化处理：提取过程，需要根据凝胶电泳显示的降解程度，将提取的ffpedna样本分为四种类型：无降解，有主带且主带大小大于2k；轻度降解，有主带但主带范围在1k～2k之间；中度降解，无主带，条带弥散，片段范围在100bp～2kb之间；严重降解，无主带，片段大小小于500bp；严重降解的样本，无需打断，直接建库，无降解、轻度降解与中度降解的需要进行超声打断；步骤三、dna的去磷酸化与变性：使用去磷酸化酶fastap，对dna5’与3’端去磷酸化；步骤四、单链接头的添加：在连接酶的作用下，将单链接头与变性的单链dna进行连接；步骤五、链霉素磁珠捕获与洗脱：利用链霉素与生物素结合的特性，使用带有链霉素的磁珠对步骤四中的连接产物进行捕获，然后变性，洗脱；步骤六、引物退火与延伸：根据单链接头的部分序列，设计引物，并在dntp、酶条件下，进行延伸反应；步骤七、双链第二接头的添加与文库洗脱：使用连接酶将双链第二接头与延伸获得的靶双链dna分子进行连接，使用洗脱洗去残留接头；步骤八、lm-pcr扩增，引入barcode：使用带barcode的引物序列，进行带磁珠的pcr反应，靶向富集dna分子；步骤九、磁珠纯化pcr扩增产物。实施例2步骤一、单链接头的获得：按照以下序列信息合成两条序列：adaptor序列（a）：5’pho-gctaccccac-nnnnnnnnnnnn-agatcggaag-xxxxxxxxxxxx-teg-biotin；序列(a)为接头序列，由5部分组成，包括10nt的碱基序列区，12nt的uid区，10nt的illumina接头区，10个c3-spacer区以及与链霉素结合的生物素区；splinter序列（b）：3’nnnnnn-cgatggggtg5’；序列(b)为splinter序列，由2部分组成，包括6nt的随机序列区与10nt的互补区，adaptor（a）的纯化：总反应体系为20ul：2ulof10µma序列,16ul1xt4rna连接酶buffer,1ulklenowfragmentofe.colidnapolymerasei,1ult4多久核苷酸激酶；反应条件为37℃，20min,95℃，2min。splinter序列（b）纯化：总反应体系为20ul：4ulof10µmsplinter序列,14ul1xt4rna连接酶buffer,1ulklenowfragmentofe.colidnapolymerasei,1ult4多聚核苷酸激酶；反应条件为37℃，20min,95℃，2min。单链接头的合成：将上述20ul的adaptor序列与20ul的splinter序列组成40ul反应体系，pcr仪上杂交，95℃，10s，逐步降低温度至10℃，降温速率为0.1℃/s。双链第二接头的获得：按照一下序列信息合成两条序列：5’cgacgctcttc-ddc3’5’pho-ggaagagcgtcgtgtagggaaagag*t*g*t*a3’双链第二接头的合成：总反应体系为50ul:20ul500µm上链序列，20ul500um下链序列，9.5ultebuffer,0.5ul5mnacl；反应条件为：pcr仪上杂交，95℃，10s，逐步降低温度至10℃，降温速率为0.1℃/s；反应结束后，加入50ul的tebuffer。相关试剂配制：1xbwt+sdsbuffer：1mnacl，10mmtris-hcl(ph8.0)，1mmedta(ph8.0)，0.05%tween-20，0.5%sds；0.1xbwt+sdsbuffer：0.1mnacl，10mmtris-hcl(ph8.0)，1mmedta(ph8.0)，0.05%tween-20，0.5%sds；stringencywashbuffer：49.5ml的ddh20，250ul的20%(wt/vol)sds，250ul的20×sscbuffer；0.1xbwtbuffer：0.1mnacl，10mmtris-hcl(ph8.0)，1mmedta(ph8.0)，0.05%tween-20；tebuffer：49.4ml的ddh20，500ul的1mtris-hcl(ph8.0)，100ul的0.5medta(ph8.0)。步骤二、打断：根据提取ffpe样本的降解程度，选择打断或者不打断，dna的降解程度采用2%琼脂糖凝胶电泳进行判断，判断标准为无降解有主带，且主带大小大于2k轻度降解有主带，但主带范围在1k-2k之间中度降解无主带，条带弥散，片段范围在100bp-2kb之间严重降解无主带，片段大小小于500bpdna样本的打断标准为，严重降解的样本无需打断，直接进行下一步骤；如果为无降解或者轻度/中度降解的样本需要进行打断。步骤三、磷酸化与热变性：反应体系为45.6ul：8ul10xt4rna连接buffer,2ul2%tween20,ulfastap，xulffpedna；34.6-xulddh20；去磷酸化反应条件为：37℃，10min。变性条件为：95℃，2min；立即冰浴。步骤四、生物素uid单链接头的连接：此步骤分为2个部分，1）单链接头的合成；2）单链接头与变性dna的连接。反应体系为80ul：32ul50%peg-8000；0.4ul100mmatp；1ul单链接头；1ult4dnaligase；45.6ul磷酸化变性产物，反应条件为：37℃，1h。步骤五、磁珠捕获与洗脱：使用myonec1磁珠捕获片段，使用洗脱试剂进行洗脱：磁珠的准备：使用500ul的1xbwt+sdsbuffer洗涤20ulmyonec1磁珠两次，250ul的1xbwt+sdsbuffer重悬；磁珠捕获：将连接产物95℃孵育1min，快速转移至冰上，冰浴冷却2-5min，加入重悬磁珠250ul，室温条件下摇管20min，磁力架上，弃上清，200ul0.1xbwt+sds重悬磁珠，磁力架上弃上清；洗脱去除splinter序列：100ul45℃预热的stringencywashbuffer重悬磁珠，45℃加热振荡孵育3min，磁力架上，弃上清，200ul0.1xbwt重悬磁珠，磁力架上，弃上清。步骤六、引物退火与延伸：延伸引物序列为：5’gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct3’延伸反应体系为：总体系为48ul，39.1ulddh20，5ul10xklenowreactionbuffer，0.4ul25mmdntp，2.5ul1%tween-20，1ul退火引物，将其与上述磁珠混合；延伸反应条件为：65℃，2min，立即转移冰上冷却2-5min，加入2ulklenowfragment，25℃，5min，35℃，25min，期间每间隔2s，混匀样本60s。延伸后洗脱：将延伸产物置磁力架上，弃上清，200ul0.1xbwt+sdsbuffer重悬磁珠，磁力架上，弃上清，100ulstringencywashbuffer，45℃条件下重悬磁珠，45℃，热浴振荡3min，磁力架上，弃上清，200ul0.1xbwtbuffer重悬磁珠，磁力架上，弃上清。步骤七、双链第二接头添加与洗脱：双链第二接头的添加，分为两个步骤：1）双链第二接头的合成；2）双链第二街头的连接。总反应体系为100ul:73.5ulddh20，10ul10xt4dna连接酶buffer，10ul50%peg-4000，2ul双链第二接头(100µm),2.5ul1%tween-20，2ult4dna连接酶，用反应液重悬延伸后洗脱的磁珠，反应条件为22℃，1h；连接后洗脱：连接产物磁力架上，弃上清，200ul0.1xbwt+sdsbuffer重悬磁珠，磁力架上，弃上清，100ulstringencywashbuffer，45℃条件下重悬磁珠，45℃，热浴振荡3min，磁力架上，弃上清，200ul0.1xbwtbuffer重悬磁珠，磁力架上，弃上清，20ultebuffer回溶磁珠，然后95℃，热浴2min。lm-pcr扩增，引入barcode:扩增引物序列为：5’aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctctt3’，5’caagcagaagacggcatacgagatnnnnnnnngtgactggagttcagacgtgt3’，其中每个粗体部分代表barcode序列lm-pcr反应体系为：总反应体系为50ul：25ul2xkapahifihotstartreadymixr，2.5ul上游引物，2.5ul下游引物，20ultebuffer回溶的磁珠，进行pcr反应。磁珠纯化pcr扩增产物：beckman磁珠纯化pcr产物。本发明针对ffpe组织样本等降解样本的二代测序建库时，提供一种解决办法，其次在建库的初期通过对每一个dna进行标记，从而为后续排除因技术引入突变提供条件。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12