一种利用具有还原TCA途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥珀酸的方法与流程

本发明涉及一种利用具有还原tca途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥珀酸的方法，属于代谢工程和微生物发酵领域。

背景技术：

琥珀酸又称丁二酸，广泛地应用于清洁剂、表面活性剂、食品添加剂、抗菌剂以及制药行业，被美国能源部选为十二种最具商业价值的平台化合物之首(werpyandpedersen,usdepartmentofenergy.2005)。以可再生资源作为原料利用微生物发酵法生产的琥珀酸摆脱了对石油化工原料的依赖，是一种绿色平台产品。

琥珀酸的微生物合成主要依赖各种细菌，例如产琥珀酸放线杆菌和大肠杆菌等。这些微生物可以高效生产琥珀酸，就目前琥珀酸的产量、产率与生产力而言，细菌似乎更具有优势，但是细菌对酸和渗透压力耐受性低，发酵过程中需要不断调节ph，增加下游工业处理成本。而酵母可以进行低ph的生物发酵，除去菌体后的发酵液可以直接蒸发结晶，这使产物的下游处理成本大大降低。从长远来看，利用酵母作为平台菌株，将大大降低琥珀酸的生物合成成本并促进其商业化生产。酿酒酵母是研究、应用最为广泛的模式微生物之一，近年来许多研究人员尝试以酿酒酵母为宿主生产琥珀酸。raab等人通过代谢工程改造策略敲除了酿酒酵母sdh1、sdh2、idh1和idp1四个基因，最终实现了琥珀酸的氧化生产。摇瓶培养中，敲除菌株的琥珀酸产量和产率均很低分别为3.62g/l和0.11mol/mol葡萄糖(raabetal.,2010)。由上所述，酿酒酵母合成琥珀酸的能力与大肠杆菌等细菌宿主差距较大，这严重阻碍了其工业应用前景。

解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)是一种重要的非常规酵母，具有安全性高、耐酸能力强、分泌多种代谢产物和能够利用多种碳水化合物等优点，它被视为潜在的生物技术工程菌株受到越来越多的关注。yuzbashev等人首次报道了利用基因敲除技术构建了缺失琥珀酸脱氢酶活性的解脂酵母工程菌株，然后经过一系列化学诱变和定向筛选，得到的突变株在合成培养基中琥珀酸产量可达50.2g/l(yuzbashevetal.,2016；yuzbashevetal.,2010)。除此之外的一系列研究也证明了解脂耶氏酵母具有良好的琥珀酸生产潜能(jostetal.,2015；lietal.,2016；yangetal.,2017)。在本课题组先前工作中，通过敲除解脂耶氏酵母野生型菌株po1f(atccmya-2613)中的sdh5基因得到一株琥珀酸脱氢酶缺陷型菌株pgc01003，该工程菌以甘油作为碳源经过400h发酵能够生产160g/l琥珀酸(gaoetal.,2016)。尽管pgc01003菌株琥珀酸产量已经达到较高水平，仍然存在着发酵过程需要调节ph增加下游处理成本和发酵周期长等问题。随后，我们在pgc01003菌株基础上敲除ylach以消除乙酸溢流，同时过表达酿酒酵母来源的丙酮酸羧激酶scpck和解脂耶氏酵母自身琥珀酰-coa合酶ylscs2，在低ph条件下最终筛选得到的工程菌株pgc202琥珀酸产量、产率和生产力分别达到110g/l、0.5g/g甘油和0.8g/l/h(cuietal.,2017)。

在好氧发酵过程中，微生物主要通过氧化tca途径合成琥珀酸。这一合成途径涉及co2的释放，理论琥珀酸产率较低仅为0.65g/g葡萄糖。实际上，自然界存在另外一条琥珀酸合成途径，即还原tca途径，由苹果酸脱氢酶(mdh)、延胡索酸酶(fum)和延胡索酸还原酶(frd)三个酶组成，其中延胡索酸还原酶是关键限速酶。还原tca途径不仅没有碳损失而且可以羧化固定co2分子用于琥珀酸合成，理论产率较氧化tca途径更高，因此还原tca途径是更加适宜于琥珀酸合成的。然而，还原tca途径通常存在于特定的严格或者兼性厌氧微生物，真核琥珀酸生产菌株中还原tca途径的构建和表达尤为困难。解脂耶氏酵母作为一种严格好养微生物，不具有还原tca路径的关键酶延胡索酸还原酶(frd)，这大大制约了其理论生产效率的提高和工业生产应用前景。因此，如何突破在严格厌氧菌中表达还原tca路径，高转化率的合成琥珀酸，已经成为目前琥珀酸合成研究中的瓶颈。

鉴于此，如果通过基因工程和代谢工程改造的方法精确调控解脂耶氏酵母积累琥珀酸，外源引入和增强还原tca生物合成途径的通路流量有望增加琥珀酸的理论产量和产率。经检索，利用具有还原tca途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥珀酸的方法未见报道。

参考文献：

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yuzbashev,t.v.,bondarenko,p.y.,sobolevskaya,t.i.,yuzbasheva,e.y.,laptev,i.a.,kachala,v.v.,fedorov,a.s.,vybornaya,t.v.,larina,a.s.,sineoky,s.p.,2016.metabolicevolutionand¹³cfluxanalysisofasuccinatedehydrogenasedeficientstrainofyarrowialipolytica.biotechnologyandbioengineering.113,2425-2432.

yuzbashev,t.v.,yuzbasheva,e.y.,sobolevskaya,t.i.,laptev,i.a.,vybornaya,t.v.,larina,a.s.,matsui,k.,fukui,k.,sineoky,s.p.,2010.productionofsuccinicacidatlowphbyarecombinantstrainoftheaerobicyeastyarrowialipolytica.biotechnologyandbioengineering.107,673-682.

技术实现要素：

针对解脂耶氏酵母好氧发酵生产琥珀酸过程中存在的理论产率低的缺陷，本发明提供了一种利用具有还原tca途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥珀酸的方法。

本发明所述利用具有还原tca途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥珀酸的方法，步骤是：

a)构建工程菌株解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)pgc91tbfrd-ecfum；

b)以改良ypd或者ypg培养基在好氧条件下培养构建的工程菌株生产琥珀酸；

其特征在于：

构建工程菌株解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)pgc91tbfrd-ecfum的方法是：

(1)以表达载体pki-1构建pki1-tbfrd质粒，以解脂耶氏酵母pgc91(po1fδsdh5δach1ylpyc)菌株为出发菌，构建过表达tbfrd基因的解脂耶氏酵母pgc91tbfrd(po1fδsdh5δach1ylpyctbfrd)；(2)以表达载体pki-1构建pki1-fum质粒，以解脂耶氏酵母pgc91tbfrd(po1fδsdh5δach1ylpyctbfrd)菌株为出发菌，构建得到过表达ecfum基因的工程菌株，命名为解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)pgc91tbfrd-ecfum(po1fδsdh5δach1ylpyctbfrdecfum)；该工程菌株引入了还原tca途径，能表达延胡索酸还原酶tbfrd和延胡索酸酶ecfum；其中所述延胡索酸还原酶来源于布氏锥虫(trypanosomabrucei)，所述延胡索酸酶来源于大肠杆菌(escherichiacoli)；

其中：上述构建过程中筛选培养基为ynbg，配方以重量百分比计为：酵母含氮碱基ynb(withammoniumsulfate,solarboandwithoutaminoacids)，0.67％；甘油，2％；casaminoacids，0.2％；尿嘧啶，0.05％；潮霉素，0.05％。

以改良ypd或者ypg培养基在好氧条件下培养构建的工程菌株生产琥珀酸的方法是：好氧条件为30±1℃，摇瓶培养转速120-220rpm，培养96±4h；改良ypd培养基的配方以重量百分比计为：2％蛋白胨，1％酵母粉，2％-6％葡萄糖，余量为水；改良ypg培养基的配方以重量百分比计为：2％蛋白胨，1％酵母粉，2％-6％甘油，余量为水；整个培养过程不外源添加酸碱剂维持发酵液中性ph值，后期发酵液ph为4.0-5.0；培养过程中，每间隔12-24h取样，在600nm波长下检测菌液的光吸收值，监测琥珀酸的含量。

其中：上述好氧条件优选为30℃，摇瓶培养转速180rpm，培养96h。

本发明公开了一种利用具有还原tca途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥珀酸的方法，其中所述解脂耶氏酵母工程菌株外源表达了还原tca途径中的关键酶：延胡索酸还原酶(frd)和延胡索酸酶(fum)，相对于传统氧化tca途径而言理论产率大幅提高。并且分离纯化琥珀酸的步骤省却了电渗析或者酸化超滤过程，没有副产物硫酸铵的产生。

综上，本发明首次在严格好氧微生物解脂耶氏酵母中引入异源还原tca途径，所述酵母工程菌株可以高效利用葡萄糖或者甘油进行琥珀酸合成代谢。在同时过表达布氏锥虫(trypanosomabrucei)来源tbfrd以及大肠杆菌(escherichiacoli)来源的ecfum以增强还原tca途径代谢通量时，最高琥珀酸产率可达0.85g/g葡萄糖，约为氧化tca途径理论产率的132％。这是目前已报道真核微生物中琥珀酸最高产率。与此同时，该工程菌株对酸性条件耐受性好，发酵过程中不需要添加酸碱中和剂调节ph。这将有效减少甚至消除琥珀酸分离纯化过程中副产物硫酸铵的产生，省却了电渗析或者酸化超滤步骤，降低生产成本。因此本发明所述工程菌具有可观的应用价值和前景。

附图说明

图1还原tca途径的过表达有利于琥珀酸的高效合成。

其中pgc91为对照菌株，pgc91tbfrd以pgc91为宿主表达了布氏锥虫来源的tbfrd，pgc91tbfrd-ecfum同时过表达了布氏锥虫来源的tbfrd和大肠杆菌来源的ecfum。

图2以甘油为唯一碳源生产琥珀酸。

其中pgc91为对照菌株，pgc91tbfrd以pgc91为宿主表达了布氏锥虫来源的tbfrd，pgc91tbfrd-ecfum同时过表达了布氏锥虫来源的tbfrd和大肠杆菌来源的ecfum。

图3不同转速条件对pgc91tbfrd-ecfum工程菌株琥珀酸合成的影响。

其中共设置三个实验组，摇瓶培养转速分别为120rpm、180rpm和220rpm。

具体实施方式

本发明所涉及解脂耶氏酵母菌株pgc91(po1fδsdh5δach1ylpyc)，其由原始菌株po1f(atcc编号mya-2613；基因型mataura3-302leu2-270xpr2-322axp2-deltanu49xpr2::suc2，购自atcc)构建完成(见cuietal.,2017)。还涉及携带可回收筛选标记的过表达载体pki-1(主要包含有一个强启动子uas8b-tef和终止子cyc1、两侧连接lox位点的leu2营养缺陷型基因)，其构建步骤为pcr扩增并将启动子uas8b-tef和终止子cyc1融合，随后插入到含有leu2营养缺陷型基因的载体jmp114中。jmp114和pub4-cre质粒的构建见文献(fickersetal.,2003)。

ypg固体培养基配方：

酵母粉，1％；蛋白胨，2％；甘油，2％；琼脂粉，2％；余量为水。

ynbg固体培养基配方：

ynb，0.67％；甘油，2％；余量为水。

实施例1工程菌株的构建

(1)tbfrd基因的过表达

菌种：解脂耶氏酵母pgc91(po1fδsdh5δach1ylpyc)

a.表达载体的构建

根据genbank公布的tbfrd基因序列(kt026107.1)，经密码子优化以后由通用生物系统(安徽)有限公司安排合成。以及同时根据表达质粒pki-1序列设计引物：

tbfrd-f：

ataagaatcattcaaaggttatggtggacggtcgatcttc

tbfrd-r：

acataactaattacatgattttaggagccagagggctcgg

以密码子优化合成的tbfrd基因序列为模板，使用tbfrd-f/tbfrd-r引物pcr(聚合酶链式反应)扩增得到携带相应末端同源序列的组装片段。pcr反应条件：97℃预变性5min，94℃变性60s，56℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

pki-1通过bsp119i内切酶消化后，回收纯化。利用gibson组装克隆试剂盒(newenglandbiolabs(neb),england)将上述酶切片段和pcr产物连接，构建完成pki1-tbfrd质粒。通过noti内切酶消化后，回收纯化浓缩整合片断。

b.liac转化感受态的制备

i.从甘油管取50μlpgc91(po1fδsdh5δach1ylpyc)菌液，涂布ypg平板，30℃过夜培养

ii.刮取适量po1f细胞，重悬悬于1mltebuffer中

iii.10，000rpm离心1min，倒掉上清液

iv.细胞悬于600μllithiumacetate(0.1mph6.0)，30℃水浴、静止培养1h

v.3000rpm离心2min，倒掉上清液

vi.用80-120μl的lithiumacetate轻悬细胞。

c.片段转化，筛选重组子

i.取40μl感受态细胞，加5μl过表达整合片断和2μl鲑鱼精dna，30℃水浴培养15min

ii.加350μlpeg4000-lithiumacetate(0.1mph6.0)及16μl1mdtt(40mm)，30℃水浴静止培养1h

iii.加40μldmso(nearly10％final)，39℃热击10min

iv.加600微升lithiumacetate(0.1mph6.0)，室温放置15min

v.取200μl混合液涂布ynbg筛选平板，30℃培养2-3d。

vi.随机挑选重组子，利用下列引物进行pcr验证

chrom-tbfrd-f：cagccacagattttcact

chrom-tbfrd-r：gcggagtaacacttgaca

测序进一步验证过表达片段整合到基因组上。

vii.lox位点专一重组

将pub4-cre转入上述tbfrd基因组整合工程菌，ypg-hyg培养基中30℃培养1-2d，cre重组酶组成型表达。利用接种环蘸取菌液在ypg-hyg筛选平板上划线，将长出的单克隆同时转入ynbg-ura平板和ypg-hyg筛选平板上培养，在ypg-hyg平板上生长而在ynbg-ura平板上不生长的筛选标记基因已被cre重组酶删除。利用检测引物chrom-ura-f/chrom-ura-r和chrom-leu-f/chrom-leu-r进一步鉴定。

chrom-ura-f：cgaagctcgagctaacgtc

chrom-ura-r：cagttaatcttctggtaag

chrom-leu-f：agcatcatggcggcagacag

chrom-leu-r：aggccgtcaaggtgctcaag

将得到的阳性重组子在ypg培养基中连续传代2-3d，筛选出去除pub4-cre质粒的工程菌株，命名为工程菌株pgc91tbfrd(po1fδsdh5δach1ylpyctbfrd)。

其中：

上述ypg-hyg培养基为：酵母粉，1％；蛋白胨，2％；甘油，2％；潮霉素，0.05％，余量为水。

上述ynbg-ura培养基为：ynb，0.67％；甘油，2％；尿嘧啶，0.05％，余量为水。

上述ypg平板为：含有2％琼脂的ypg固体培养基。

上述ynbg平板为：含有2％琼脂的ynbg固体培养基。

上述ynbg-ura筛选平板为：含有2％琼脂的ynbg-ura固体培养基。

上述ypg-hyg筛选平板为：含有2％琼脂的ynbg-hyg固体培养基。

(2)ecfum基因的过表达

菌种：解脂耶氏酵母pgc91tbfrd(po1fδsdh5δach1ylpyctbfrd)

a.表达载体的构建

根据genbank公布的ecfum基因序列(nc_000913.3)以及过表达质粒pki-1序列设计引物：

ecfum-f：

ataagaatcattcaaaggttatgaatacagtacgcagcga

ecfum-r：

acataactaattacatgattttaacgcccggctttcatac

以大肠杆菌mg1655基因组为模板，使用ecfum-f/ecfum-r引物pcr(聚合酶链式反应)扩增得到携带相应末端同源序列的组装片段。pcr反应条件：97℃预变性5min，94℃变性60s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

pki-1通过bsp119i内切酶消化后，回收纯化。利用gibson组装克隆试剂盒(newenglandbiolabs(neb),england)将上述酶切片段和pcr产物连接，构建完成pki1-fum质粒。通过noti内切酶消化后，回收纯化浓缩整合片断。

b.liac转化感受态的制备

i.从甘油管取50μlpgc91tbfrd(po1fδsdh5δach1ylpyctbfrd)菌液，涂布ypg平板，30℃过夜培养

ii.刮取适量po1f细胞，重悬悬于1mltebuffer中

iii.10，000rpm离心1min，倒掉上清液

iv.细胞悬于600μllithiumacetate(0.1mph6.0)，30℃水浴、静止培养1h

v.3000rpm离心2min，倒掉上清液

vi.用80-120μl的lithiumacetate轻悬细胞。

c.片段转化，筛选重组子

i.取40μl感受态细胞，加5μl过表达整合片断和2μl鲑鱼精dna，30℃水浴培养15min

ii.加350μlpeg4000-lithiumacetate(0.1mph6.0)及16μl1mdtt(40mm)，30℃水浴静止培养1h

iii.加40μldmso(nearly10％final)，39℃热击10min

iv.加600微升lithiumacetate(0.1mph6.0)，室温放置15min

v.取200μl混合液涂布ynbg筛选平板，30℃培养2-3d。

vi.随机挑选重组子，利用下列引物进行pcr验证

chrom-fum-f：gcgtagcagatgaactg

chrom-fum-r：aacgcccggctttcatac

测序进一步验证过表达片段整合到基因组上，并最终得到工程菌株，命名为工程菌株解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)pgc91tbfrd-ecfum(po1fδsdh5δach1ylpyctbfrdecfum)。

其中：

上述ypg平板为：含有2％琼脂的ypg固体培养基。

上述ynbg筛选平板为：含有2％琼脂的ynbg固体培养基。

实施例2不同菌株生产琥珀酸效率的比较

工程菌株：解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)pgc91、pgc91tbfrd和pgc91tbfrd-ecfum。

冷冻甘油管保存的解脂耶氏酵母pgc91、pgc91tbfrd和pgc91tbfrd-ecfum划线接种于ypg平板(2％蛋白胨，1％酵母粉，2％甘油，2％琼脂粉)，30℃培养30h。

将上述平板上长出的单菌落接入装有50ml的ypd液体培养基(2％蛋白胨，1％酵母粉，2％葡萄糖)的250ml三角瓶中，30℃，220rpm转速振荡培养活化。

种子培养：分别取1ml活化的培养液转接到装有50ml发酵培养基(2％蛋白胨，1％酵母粉，4％葡萄糖)的250ml三角瓶中，30℃，220rpm好氧培养24h。

发酵培养：分别取2ml活化的培养液转接到装有50ml发酵培养基(2％蛋白胨，1％酵母粉，6％葡萄糖)的250ml三角瓶中，30℃，180rpm好氧培养96h，发酵过程中不外源添加酸碱剂维持发酵液中性ph值。

发酵过程中，每间隔12-24h取样，然后再600nm波长下检测菌液的光吸收值。即取1ml菌液10，000-12，000rpm转速离心2min。弃去上清，用等体积的h2o重悬，稀释至合适倍数后使用分光光度计检测其光吸收值。

发酵液中的碳源和有机酸等代谢物采用高压液相色谱仪(hplc)分析。具体方法为取1ml发酵液室温下12,000rpm离心2min，取上清，然后用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，用高效液相色谱检测有机酸和葡萄糖浓度。

检测条件为：色谱柱为hpx-87h(bioradlabs,300mm×7.8mm)，检测器为示差折光检测器rid-10a，柱温为65℃，流动相为5mmh2so4溶液，流速为0.6ml/min。

解脂耶氏酵母pgc91菌株自身不含有延胡索酸还原酶，负责琥珀酸合成的主要是氧化tca和乙醛酸循环途径。我们在此基础上引入了还原tca途径的关键基因frd(布氏锥虫来源的tbfrd)和fum(大肠杆菌来源的ecfum)，以重构酵母代谢通量减少氧化tca代谢压力，提高琥珀酸合成理论产率。其中，tbfrd编码的nadh依赖的延胡索酸还原酶(tbfrd)催化延胡索酸生成琥珀酸，ecfum编码的延胡索酸酶(ecfum)催化苹果酸生成延胡索酸。由图1可知，单独过表达了tbfrd(编码布氏锥虫来源nadh依赖的延胡索酸还原酶)时，尽管工程菌pgc91tbfrd的琥珀酸较对照菌株pgc91有所下降，但是其对葡萄糖的产率可以达到0.7g/g(图1)，约为pgc91的145％。随后tbfrd和ecfum的协同表达有助于解脂酵母琥珀酸合成。在转速为180rpm条件下，pgc91tbfrd-ecfum琥珀酸产量、生产力和产率分别可以达到16.75g/l、0.17g/l/h和0.85g/g葡萄糖。证实还原tca途径过表达可以提高琥珀酸生产效率。

实施例3甘油作为唯一碳源时pgc91tbfrd-ecfum菌株的琥珀酸合成情况

工程菌株：解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)pgc91、pgc91tbfrd和pgc91tbfrd-ecfum。

冷冻甘油管保存的解脂耶氏酵母pgc91、pgc91tbfrd和pgc91tbfrd-ecfum划线接种于ypg平板(2％蛋白胨，1％酵母粉，2％葡萄糖，2％琼脂粉)，30℃培养30h。

将上述平板上长出的单菌落接入装有50ml的ypg液体培养基(2％蛋白胨，1％酵母粉，2％葡萄糖)的250ml三角瓶中，30℃，220rpm转速振荡培养活化。种子培养：取1ml活化的培养液转接到装有50ml发酵培养基(2％蛋白胨，1％酵母粉，4％葡萄糖)的250ml三角瓶中，30℃，220rpm好氧培养24h

发酵培养：取2ml活化的培养液转接到装有50ml发酵培养基(2％蛋白胨，1％酵母粉，6％甘油)的250ml三角瓶中，30℃，180rpm条件下好氧培养96h，发酵过程中不外源添加酸碱剂维持发酵液中性ph值。

发酵过程中，每间隔12-24h取样，然后再600nm波长下检测菌液的光吸收值。即取1ml菌液10，000-12，000rpm转速离心2min。弃去上清，用等体积的h2o重悬，稀释至合适倍数后使用分光光度计检测其光吸收值。

发酵液中的碳源和有机酸等代谢物采用高压液相色谱仪(hplc)分析。具体方法为取1ml发酵液室温下12,000rpm离心2min，取上清，然后用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，用高效液相色谱检测有机酸和葡萄糖浓度。

检测条件为：色谱柱为hpx-87h(bioradlabs,300mm×7.8mm)，检测器为示差折光检测器rid-10a，柱温为65℃，流动相为5mmh2so4溶液，流速为0.6ml/min。

甘油，作为一种生物柴油制备过程中的副产物，来源广泛且价格低廉。由图2结果可知，尽管甘油和葡萄糖吸收转运机制以及氧化还原性能有所差异，表达了还原tca途径的工程菌株pgc91tbfrd-ecfum同样可以高效代谢甘油合成琥珀酸。在甘油作为唯一碳源时，pgc91tbfrd-ecfum好氧发酵生产琥珀酸的产量和产率分别可达36.3g/l和0.62g/g甘油。甘油的还原性较葡萄糖更强，代谢过程中每消耗一分子甘油产生一分子nadh，因此解脂耶氏酵母工程菌株以甘油为底物时有利于菌体生长和代谢产物快速积累。虽然还原性强的甘油可以提供更多atp促进细胞生长，但是同时也会造成过量还原性副产物如甘露醇和赤藓糖醇等的溢流，造成琥珀酸产率较葡萄糖更低。

实施例4不同转速条件对pgc91tbfrd-ecfum菌株琥珀酸生产的影响

工程菌株：解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)pgc91tbfrd-ecfum。

冷冻甘油管保存的解脂耶氏酵母pgc91tbfrd-ecfum划线接种于ypg平板(2％蛋白胨，1％酵母粉，2％葡萄糖，2％琼脂粉)，30℃培养30h。

将上述平板上长出的单菌落接入装有50ml的ypg液体培养基(2％蛋白胨，1％酵母粉，2％葡萄糖)的250ml三角瓶中，30℃，220rpm转速振荡培养活化。种子培养：取1ml活化的培养液转接到装有50ml发酵培养基(2％蛋白胨，1％酵母粉，4％葡萄糖)的250ml三角瓶中，30℃，220rpm好氧培养24h

发酵培养：取2ml活化的培养液转接到装有50ml发酵培养基(2％蛋白胨，1％酵母粉，6％葡萄糖)的250ml三角瓶中，30℃，分别在120rpm、180rpm和220rpm条件下好氧培养96h，发酵过程中不外源添加酸碱剂。

发酵过程中，每间隔12-24h取样，然后再600nm波长下检测菌液的光吸收值。即取1ml菌液10，000-12，000rpm转速离心2min。弃去上清，用等体积的h2o重悬，稀释至合适倍数后使用分光光度计检测其光吸收值。

发酵液中的碳源和有机酸等代谢物采用高压液相色谱仪(hplc)分析。具体方法为取1ml发酵液室温下12,000rpm离心2min，取上清，然后用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，用高效液相色谱检测有机酸和葡萄糖浓度。

检测条件为：色谱柱为hpx-87h(bioradlabs,300mm×7.8mm)，检测器为示差折光检测器rid-10a，柱温为65℃，流动相为5mmh2so4溶液，流速为0.6ml/min。

通过研究不同转速或者溶氧水平下琥珀酸发酵性能，发现220rpm时解脂耶氏酵母工程菌株pgc91tbfrd-ecfum琥珀酸产量最高为24.6g/l，然而产率仅有0.57g/g葡萄糖(图3)。随着转速的降低琥珀酸产量呈现递减趋势，转速为120rpm条件下琥珀酸产量最低为10.3g/l。转速为180rpm情况下琥珀酸产量和产率均达到最佳。高转速有利于菌株生长和琥珀酸生产力的提高，但是低转速条件下琥珀酸产率更高。说明在摇瓶发酵过程中pgc91tbfrd-ecfum菌株会同时利用氧化tca途径和还原tca途径进行琥珀酸合成代谢。氧化tca途径在负责产生琥珀酸的同时还起到氧化功能的作用，其代谢通量直接影响菌株生长状况。还原tca途径作为一种高效琥珀酸合成途径，其琥珀酸理论产率是氧化tca途径的近两倍。适宜的转速或者溶氧水平有利于细胞生长和琥珀酸合成以及氧化tca途径和还原tca途径的平衡，在满足细胞生长的同时高效生产琥珀酸。

　　序列表

　　<110>山东大学

　　<120>一种利用具有还原tca途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥珀酸的方法

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