本发明涉及到生物工程领域，具体涉及一种生物法制备l-瓜氨酸和l-鸟氨酸的方法。
背景技术：
l-瓜氨酸是一种重要的非蛋白质氨基酸，因第一次从西瓜中分离得到而得名“瓜氨酸”，l-瓜氨酸是人体内尿素循环的重要中间代谢产物，对于维持人体血氨平衡具有重要的作用，l-瓜氨酸能够吸收和清除有害的自由基，从而起到抗氧化的作用，因此可以作为抗衰老、提高免疫力的保健品。在医药领域，l-瓜氨酸对防治前列腺疾病，包括前列腺炎、前列腺癌的作用明显。最近的研究表明，l-瓜氨酸在维持心血管正常功能的一氧化氮代谢中也发挥着重要作用。
目前l-瓜氨酸的制备方法主要有化学合成法、微生物发酵法及酶转化法
化学法合成l-瓜氨酸反应过程复杂、副产物多，产率低、纯度不高，已基本失去竞争力。
微生物发酵法生产l-瓜氨酸主要是通过诱变或者基因工程的方法获得l-瓜氨酸高产菌株，以廉价的葡萄糖等碳源为起始原料合成l-瓜氨酸。日本协和发酵公司培养能够利用烃类作为碳源的石蜡节杆菌arthrobacterparaffineus精氨酸需求型的突变株发酵生产l-瓜氨酸，发酵96小时积累7.1g/l的l-瓜氨酸。但是微生物发酵法生产l-瓜氨酸存在产量低，发酵周期长，常伴随副产物产生，而且后续分离困难等问题，仍不能满足工业化要求。
酶法转化生产l-瓜氨酸的优点是酶立体选择性强，产物浓度高，纯化步骤少，生产成本低，是目前工业上生产l-瓜氨酸的主要方法。北京化工大学姚海峰等以粪链球菌催化l-精氨酸，25小时内得到92.72g/ll-瓜氨酸；江南大学饶志明等以重组钝齿棒杆菌全细胞为催化剂，以l-精氨酸为底物生产l-瓜氨酸，采用分阶段补加l-精氨酸的策略，转化48小时，l-瓜氨酸产量达到301.4g/l。
l-鸟氨酸是一种非蛋白氨基酸，在人体内主要以游离态存在于肝脏。l-鸟氨酸最主要的生理功能是参与尿素循环，有着强大的氨解毒功能，因此被广泛应用于治疗肝性脑病、肝炎以及保护肝脏方面的药物研发。此外，l-鸟氨酸还有很多其他生物功能，如刺激生长激素分泌、改善睡眠、缓解疲劳，还能用作食品添加剂改善食品风味。
根据文献报道，l-鸟氨酸的制备方法主要有化学法、发酵法和酶转化法。
化学法合成鸟氨酸反应步骤多、收率低，且得到的是消旋体，需要拆分，不适宜大规模生产l-鸟氨酸产品。george等人利用丙烯醛、氰化氢、氨气、co2为原料合成l-鸟氨酸，但效果不理想，主要表现为反应步骤多、产品为消旋的dl-鸟氨酸。rivard等人利用ba(oh)2水解l-精氨酸，经水解、除盐和干燥后，得到l-鸟氨酸盐酸盐，水解过程中存在消旋现象，产品光学纯度不高。
发酵法因原料低廉受到研究者的青睐，近年来取得了很大进展，主要表现在生产菌株的选育和生产工艺的改造方面。日本研究人员早在20世纪50年代就利用紫外、氰化物等传统的诱变技术，获得了谷氨酸棒杆菌瓜氨酸缺陷型突变株，成功积累了l-鸟氨酸。万红贵等人公开了利用corynebacteriumglutamicumcgmccno.3663发酵制备l-鸟氨酸的方法，发酵液中l-鸟氨酸积累达到35～45g/l。但发酵法也有不足之处，菌种的不稳定性、发酵工艺参数控制、发酵液中l-鸟氨酸的分离提取等过程都存在亟待解决的问题。
酶法转化因具有专一性强、催化效率高、反应条件温和、反应周期短、产物易于分离等优点而日益受到重视，是低成本生产l-鸟氨酸的有效方法。高智慧等人利用重组表达的精氨酸酶基因工程菌酶法拆分dl-精氨酸制备d-精氨酸和l-鸟氨酸，产品l-鸟氨酸盐酸盐纯度95%以上。焦庆才等人采用固定化细胞酶法水解l-精氨酸，底物转化率95%以上，l-鸟氨酸得率80%以上。
酶法转化制备l-瓜氨酸过程需要精氨酸脱亚胺酶。目前，利用野生型菌株发酵制备精氨酸脱亚胺酶的过程中需要添加少量l-精氨酸诱导，l-精氨酸被分解代谢后变成l-鸟氨酸，在发酵液中积累。由于诱导过程中添加的l-精氨酸较少，因此发酵液中积累的l-鸟氨酸浓度较低，对其分离纯化成本相对较高，发酵液通常被当做废水处理，既污染环境又浪费资源。此外，利用l-精氨酸纯品做底物酶法转化制备l-瓜氨酸成本较高，精氨酸脱亚胺酶对底物l-精氨酸的纯度要求不高，因此利用发酵法生产l-精氨酸的发酵液或含有l-精氨酸的离子交换洗脱液以及l-精氨酸粗品配成的水溶液为底物酶法转化制备l-瓜氨酸可大大降低生产成本。
综上所述，酶法转化制备l-瓜氨酸和l-鸟氨酸具有较大优势，酶法转化过程中底物l-精氨酸和酶制剂的成本高低是该方法能否实现工业化的关键因素。因此，寻找来源丰富、成本低廉的l-精氨酸工业原料，建立低成本发酵制备酶制剂的工艺是实现酶法转化生产l-瓜氨酸和l-鸟氨酸的重要途径。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种高效、低成本生物法制备l-瓜氨酸和l-鸟氨酸的方法。
本发明的设计思想是在粪肠球菌发酵过程中流加l-精氨酸，诱导产生精氨酸脱亚胺酶，同时副产l-鸟氨酸，发酵液离心后得到的具有精氨酸脱亚胺酶活性的菌体细胞用来转化底物l-精氨酸制备l-瓜氨酸，而发酵液上清利用离子交换树脂分离得到l-鸟氨酸。
本发明在野生型菌株发酵制备精氨酸脱亚胺酶的过程中提高流加l-精氨酸浓度，在诱导产生精氨酸脱亚胺酶的同时，实现发酵液中l-鸟氨酸高浓度积累，最终利用离子交换树脂分离得到l-鸟氨酸；诱导产生的精氨酸脱亚胺酶以l-精氨酸的发酵液或含有l-精氨酸的离子交换洗脱液或l-精氨酸粗品配成的水溶液为底物酶法转化制备l-瓜氨酸，大大降低了生产成本。本发明一次发酵和转化可得到l-鸟氨酸和l-瓜氨酸两种高附加值产品，使生产成本大幅度降低，具有重大突出效果和工业化价值。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来达到：
一种生物法制备l-瓜氨酸和l-鸟氨酸的方法，其特征在于：所述方法由以下步骤构成：
一种生物法制备l-瓜氨酸和l-鸟氨酸的方法，其特征在于：所述方法按如下步骤进行：
1、菌种的培育及发酵：将粪肠球菌在培养基中培养、发酵，培养基包括如下组分：玉米浆0.5-2.0g/ml、蛋白质水解物0.5g/ml、牛肉膏1.0-2.0g/ml、麦芽糖0.5-1.0g/ml、乳糖0.5-1.0g/ml、nacl0.5g/ml、kh2po40.04-0.5g/ml、mgso4•7h2o0.02-0.05g/ml、葡萄糖1.0g/ml、蛋白胨0.5-1.0g/ml、蔗糖0.5g/ml、果糖1.0g/ml、豆饼水解液3g/ml、酵母膏0.5-1.0g/ml，培养基中的ph控制在7.2，在培养基中总碳源质量浓度为1-20g/l，总氮源质量浓度为1-20g/l，将种子液按体积比1-2%的接种量种于300l发酵罐中，发酵罐装液量为200l，通气量为12m³/h,罐压为0.05mpa，转速为100r/min，培养温度为35℃，发酵过程中流加l-精氨酸溶液，发酵时ph控制在6.8-7.2，发酵时间为15-24小时，发酵完成后离心发酵液，得到具有精氨酸脱酸亚胺酶活性的菌体细胞和含有l-鸟氨酸的发酵上清液；
2、制备l-瓜氨酸：用l-精氨酸的发酵液配制底物溶液，底物溶液的ph值为6.0-8.0，加入表面活性剂，再加入具有精氨酸脱亚胺酶活性的菌体细胞或酶粗提液，在30-50℃条件下进行酶促反应，反应时间为16-30小时，转化反应结束后，利用等电点结晶的方法分离得到产物l-瓜氨酸；
3、制备l-鸟氨酸：将含有l-鸟氨酸的发酵上清液经脱色处理后，上阳离子交换柱，l-鸟氨酸被吸附，用浓度为1mol/l的盐酸解吸，流出液用氢氧化钠中和至ph值至6.0，活性炭脱色、真空浓缩至有晶体析出，加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶、抽滤，用10升乙醇洗涤晶体，干燥后得到l-鸟氨酸。
所述的步骤1中所流加至发酵液中的l-精氨酸溶液的浓度为10-60g/l。
所述方法步骤2中底物溶液中的l-精氨酸的质量浓度为150-250g/l，表面活性剂为：吐温80、十六烷基三甲基溴化铵、tritonx-100，其浓度为0.1～1.0g/l。
与现有技术相比，本发明的积极效果为：
1、本发明通过提高流加l-精氨酸浓度，在发酵制备精氨酸脱亚胺酶的过程中，实现l-鸟氨酸高浓度积累，发酵液中l-鸟氨酸浓度达到45g/l；
2、本发明采用一次发酵制得的菌体和发酵液分别制备l-瓜氨酸和l-鸟氨酸两种产品，充分利用资源，工艺优化合理；
3、酶法转化制备l-瓜氨酸的过程中，采用了廉价的l-精氨酸的发酵液或含有l-精氨酸的离子交换洗脱液或l-精氨酸粗品为底物，充分利用了工业生产过程物料，省去了l-精氨酸的分离、精制工序，降低了生产成本，实施效果突出，具有良好的经济效益和社会效益；
4、生物法制备l-瓜氨酸和l-鸟氨酸具有反应条件温和，工艺流程简单，适合工业化大规模生产。
具体实施方式
下面结合实施例进一步对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。
实施例一
1、菌种的培育及发酵：将粪肠球菌在培养基中培养、活化，培养基配方为（g/ml）：玉米浆2.0%，蛋白质水解物0.5%，牛肉膏1%，麦芽糖1.0%，乳糖0.5%，nacl0.5%，kh2po40.5%，mgso4•7h2o0.03%，ph7.2，将种子液按照体积比1%的接种量接种于300l发酵罐中，发酵罐装液量200l，通气量12m3/h，罐压0.05mpa，转速100r/min，35℃培养，发酵过程中流加终浓度为10g/l的l-精氨酸，发酵时ph控制在6.8左右，发酵后期ph控制在7.2左右，发酵15小时结束，发酵液经离心后得具有精氨酸脱亚胺酶活性的湿细胞4kg，发酵液上清200l，发酵液上清中l-鸟氨酸含量7.2g/l。
2、制备l-瓜氨酸：用l-精氨酸的发酵液配制底物溶液，其中l-精氨酸含量为150g/l，ph6.0，加入1.0g/ltritonx-100，再加入4kg精氨酸脱亚胺酶湿菌体，总体积400l，30℃，50r/min酶促反应20小时，反应结束后取样检测转化液中l-瓜氨酸浓度为149.4g/l，对l-精氨酸摩尔转化率为99%，将转化液离心去除菌体，上清液去盐后升温至80℃活性炭脱色，板框压滤，滤液浓缩至有少量晶体析出，向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用10升乙醇洗涤晶体，干燥后得l-瓜氨酸50.8kg，收率85%，比旋光
3、制备l-鸟氨酸：含l-鸟氨酸的发酵液上清经脱色处理后，上阳离子交换柱，l-鸟氨酸被吸附，用1mol/l盐酸解吸，流出液用氢氧化钠中和至ph6.0，活性炭脱色、真空浓缩至有晶体析出，加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得l-鸟氨酸盐酸盐1.47kg，比旋光
实施例二
1、菌种的培育及发酵：将粪肠球菌在培养基中培养、活化，培养基配方为（g/ml）：玉米浆0.5%，nacl0.5%，kh2po40.05%，mgso4•7h2o0.02%，牛肉膏2%，葡萄糖1%，麦芽糖0.5%，ph7.2，将种子液按照体积比2%的接种量接种于300l发酵罐中，发酵罐装液量200l，通气量12m3/h，罐压0.05mpa，转速100r/min，37℃培养，发酵过程中流加终浓度为20g/l的l-精氨酸，发酵时ph控制在6.8左右，发酵后期ph控制在7.2左右，发酵15小时结束，发酵液经离心后得具有精氨酸脱亚胺酶活性的湿细胞4.4kg，发酵液上清200l，发酵液上清中l-鸟氨酸含量14.5g/l。
2、制备l-瓜氨酸：用l-精氨酸的发酵液配制底物溶液，其中l-精氨酸含量为200g/l，ph6.5，加入1.0g/l吐温-80，再加入4kg精氨酸脱亚胺酶湿菌体，总体积400l，40℃，50r/min酶促反应16小时，反应结束后取样检测转化液中l-瓜氨酸浓度为199.1g/l，对l-精氨酸摩尔转化率为99%，将转化液离心去除菌体，上清液去盐后升温至80℃活性炭脱色，板框压滤，滤液浓缩至有少量晶体析出，向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用10升乙醇洗涤晶体，干燥后得l-瓜氨酸67.8kg，收率85%，比旋光
3、制备l-鸟氨酸：含l-鸟氨酸的发酵液上清经脱色处理后，上阳离子交换柱，l-鸟氨酸被吸附，用1mol/l盐酸解吸，流出液用氢氧化钠中和至ph6.0，活性炭脱色、真空浓缩至有晶体析出，加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得l-鸟氨酸盐酸盐3.0kg，比旋光
实施例三
1、菌种的培育及发酵：将粪肠球菌在培养基中培养、活化，培养基配方为（g/ml）：玉米浆1.0%，蛋白质水解物0.5%，牛肉膏2%，麦芽糖1.0%，乳糖0.5%，nacl0.5%，kh2po40.5%，mgso4•7h2o0.03%，ph7.2，将种子液按照体积比1.5%的接种量接种于300l发酵罐中，发酵罐装液量200l，通气量12m3/h，罐压0.05mpa，转速100r/min，35℃培养，发酵过程中流加终浓度为30g/l的l-精氨酸，发酵时ph控制在6.8左右，发酵后期ph控制在7.2左右，发酵17小时结束，发酵液经离心后得具有精氨酸脱亚胺酶活性的湿细胞4.5kg，发酵液上清220l，发酵液上清中l-鸟氨酸含量20.3g/l。
2、制备l-瓜氨酸：用l-精氨酸的发酵液配制底物溶液，其中l-精氨酸含量为220g/l，ph7.0，加入1.0g/l十六烷基三甲基溴化铵，再加入4kg精氨酸脱亚胺酶湿菌体，总体积400l，45℃，50r/min酶促反应20小时，反应结束后取样检测转化液中l-瓜氨酸浓度为219g/l，对l-精氨酸摩尔转化率为99%，将转化液离心去除菌体，上清液去盐后升温至80℃活性炭脱色，板框压滤，滤液浓缩至有少量晶体析出，向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用10升乙醇洗涤晶体，干燥后得l-瓜氨酸75.3kg，收率86%，比旋光
3、制备l-鸟氨酸：含l-鸟氨酸的发酵液上清经脱色处理后，上阳离子交换柱，l-鸟氨酸被吸附，用1mol/l盐酸解吸，流出液用氢氧化钠中和至ph6.0，活性炭脱色、真空浓缩至有晶体析出，加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得l-鸟氨酸盐酸盐4.7kg，比旋光
实施例四
1、菌种的培育及发酵：将粪肠球菌在培养基中培养、活化，培养基配方为（g/ml）：蛋白胨1.0%，牛肉膏1.0%，蔗糖0.5%，果糖1.0%，nacl0.5%，kh2po40.3%，k2hpo40.1%，mgso4•7h2o0.05%，ph7.2，将种子液按照体积比1%的接种量接种于300l发酵罐中，发酵罐装液量200l，通气量12m3/h，罐压0.05mpa，转速100r/min，35℃培养，发酵过程中流加终浓度为40g/l的l-精氨酸，发酵时ph控制在6.8左右，发酵后期ph控制在7.2左右，发酵19小时结束，发酵液经离心后得具有精氨酸脱亚胺酶活性的湿细胞4.8kg，发酵液上清210l，发酵液上清中l-鸟氨酸含量29g/l。
2、制备l-瓜氨酸：用l-精氨酸的发酵液配制底物溶液，其中l-精氨酸含量为240g/l，ph7.0，加入1.0g/ltritonx-100，再加入4kg精氨酸脱亚胺酶湿菌体，总体积400l，50℃，50r/min酶促反应24小时，反应结束后取样检测转化液中l-瓜氨酸浓度为239g/l，对l-精氨酸摩尔转化率为99%，将转化液离心去除菌体，上清液去盐后升温至80℃活性炭脱色，板框压滤，滤液浓缩至有少量晶体析出，向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用10升乙醇洗涤晶体，干燥后得l-瓜氨酸82.2kg，收率86%，比旋光
3、制备l-鸟氨酸：含l-鸟氨酸的发酵液上清经脱色处理后，上阳离子交换柱，l-鸟氨酸被吸附，用1mol/l盐酸解吸，流出液用氢氧化钠中和至ph6.0，活性炭脱色、真空浓缩至有晶体析出，加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得l-鸟氨酸盐酸盐6.4kg，比旋光
实施例五
1、菌种的培育及发酵：将粪肠球菌在培养基中培养、活化，培养基配方为（g/ml）：豆饼水解液3%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，乳糖1.0%，蔗糖0.5%，麦芽糖0.5%，nacl0.5%，kh2po40.1%，mgso4•7h2o0.03%，ph7.2，将种子液按照体积比1%的接种量接种于300l发酵罐中，发酵罐装液量200l，通气量12m3/h，罐压0.05mpa，转速100r/min，35℃培养，发酵过程中流加终浓度为50g/l的l-精氨酸，发酵时ph控制在6.8左右，发酵后期ph控制在7.2左右，发酵22小时结束，发酵液经离心后得具有精氨酸脱亚胺酶活性的湿细胞5.1kg，发酵液上清230l，发酵液上清中l-鸟氨酸含量36.2g/l。
2、l-瓜氨酸：制备用l-精氨酸的发酵液配制底物溶液，其中l-精氨酸含量为250g/l，ph8.0，加入1.0g/ltritonx-100，再加入4kg精氨酸脱亚胺酶湿菌体，总体积400l，42℃，50r/min酶促反应30小时，反应结束后取样检测转化液中l-瓜氨酸浓度为249g/l，对l-精氨酸摩尔转化率为99%。将转化液离心去除菌体，上清液去盐后升温至80℃活性炭脱色，板框压滤，滤液浓缩至有少量晶体析出，向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用10升乙醇洗涤晶体，干燥后得l-瓜氨酸85.6kg，收率86%，比旋光
3、制备l-鸟氨酸：含l-鸟氨酸的发酵液上清经脱色处理后，上阳离子交换柱，l-鸟氨酸被吸附，用1mol/l盐酸解吸，流出液用氢氧化钠中和至ph6.0，活性炭脱色、真空浓缩至有晶体析出，加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得l-鸟氨酸盐酸盐8.8kg，比旋光
实施例六
1、菌种的培育及发酵：将粪肠球菌在培养基中培养、活化，培养基配方为（g/ml）：蛋白胨1%，酵母膏1%，葡萄糖1%，蔗糖0.5%，nacl0.5%，kh2po40.04%，mgso4•7h2o0.03%，ph7.2，将种子液按照体积比1%的接种量接种于300l发酵罐中，发酵罐装液量200l，通气量12m3/h，罐压0.05mpa，转速100r/min，35℃培养，发酵过程中流加终浓度为60g/l的l-精氨酸，发酵时ph控制在6.8左右，发酵后期ph控制在7.2左右，发酵24小时结束，发酵液经离心后得具有精氨酸脱亚胺酶活性的湿细胞5.4kg，发酵液上清230l，发酵液上清中l-鸟氨酸含量43.4g/l。
2、l-瓜氨酸：制备用l-精氨酸的发酵液配制底物溶液，其中l-精氨酸含量为250g/l，ph6.8，加入1.0g/l吐温-80，再加入4kg精氨酸脱亚胺酶湿菌体，总体积400l，45℃，80r/min酶促反应28小时，反应结束后取样检测转化液中l-瓜氨酸浓度为248.9g/l，对l-精氨酸摩尔转化率为99%，将转化液离心去除菌体，上清液去盐后升温至80℃活性炭脱色，板框压滤，滤液浓缩至有少量晶体析出，向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用10升乙醇洗涤晶体，干燥后得l-瓜氨酸84.6kg，收率85%，比旋光
3、制备l-鸟氨酸：含l-鸟氨酸的发酵液上清经脱色处理后，上阳离子交换柱，l-鸟氨酸被吸附，用1mol/l盐酸解吸，流出液用氢氧化钠中和至ph6.0，活性炭脱色、真空浓缩至有晶体析出，加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得l-鸟氨酸盐酸盐10.6kg，比旋光
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。本说明书（包括权利要求、摘要）中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
以上所述仅是本发明的非限定实施方式，还可以衍生出大量的实施例，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思和不作出创造性劳动的前提下，还可以做出若干变形和改进的实施例，这些都属于本发明的保护范围。