一种检测苦瓜枯萎病菌的PCR引物及通过PCR试剂盒检测的方法与流程

本发明涉及生物技术检测领域，具体是一种检测苦瓜枯萎病菌的pcr引物及通过pcr试剂盒检测的方法。

背景技术：

由尖孢镰孢菌(fusariumoxysporum)侵染引起的蔬菜瓜类枯萎病是一种典型土传病害，也是一种毁灭性维管束病害；近年来，由于设施农业的广泛推广，以及作物重茬面积不断扩大，瓜类枯萎病的发生和危害日益严重；瓜类枯萎病发病率一般在10％～30％，严重时高达80％，甚至绝产，且一旦发病，难以根除，已成为影响蔬菜瓜类生产的严重障碍之一。

尖孢镰孢菌对不同属(种)寄主植物以及同种寄主植物不同品种的致病性存在明显差异，因此具有高度的寄主专化性；目前，我国已明确报道的尖孢镰孢菌瓜类专化型有6个，分别为黄瓜专化型(fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、西瓜专化型(fusariumoxysporumf.sp.niveum)、甜瓜专化型(fusariumoxysporumf.sp.melonis)、苦瓜专化型(fusariumoxysporumf.sp.momodicae)、冬瓜专化型(fusariumoxysporumf.sp.benincasae)和葫芦专化型(fusariumoxysporumf.sp.lagenariae)；研究表明，瓜类枯萎病菌各专化型并非严格的寄主专化性，不同专化型菌株除强侵染相应的寄主植物外，也可侵染其它寄主植物，如尖孢镰孢菌黄瓜专化型菌株除强侵染黄瓜外，还可弱侵染甜瓜和西瓜；尖孢镰孢菌西瓜专化型菌株除强侵染西瓜外，还可弱侵染黄瓜和甜瓜；尖孢镰孢菌苦瓜专化型菌株除强侵染苦瓜外，还可弱侵染葫芦和丝瓜等等；因此，给瓜类枯萎病菌的早期鉴定带了巨大的困难；目前，对瓜类枯萎病菌的鉴定除采用形态学和分子生物学方法外，还必须结合病原菌分离物对不同寄主植物的致病性测定结果；对于由尖孢镰孢菌苦瓜专化型侵染引起的苦瓜枯萎病而言，早期诊断是指导该病害有效防控的关键；但是，目前关于尖孢镰孢菌苦瓜专化型的早期分子检测几乎还是空白，因此，急需一种特异性、灵敏、快速、简便的苦瓜枯萎病菌检测技术；现有的苦瓜枯萎病菌尖孢镰孢菌苦瓜专化型鉴定方法，由于目前并没有公认的鉴别寄主，且接种试验结果受环境条件的影响较大，因此，采用现有的鉴定方法获得的鉴定结果往往具有不确定性，加之，致病性测定的时间长(从接种到发病并表现典型的症状一般为9～13天)，费时费工，不利于苦瓜枯萎病的早期诊断，导致错失病害防控的最佳时机，给生产造成难以挽回的损失。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测苦瓜枯萎病菌的pcr引物及通过pcr试剂盒检测的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种检测苦瓜枯萎病菌的pcr引物，包括由上游引物和下游引物；所述的上游引物的核苷酸序列如seq.id.no.3，所述的下游引物的核苷酸序列如seq.id.no.4所示，分别来自urp-32f(seq.id.no.1)扩增的特异片段seq.id.no.2和经优化的特异性扩增片段seq.id.no.5。

一种通过pcr试剂盒检测苦瓜枯萎病菌的方法，包括以下步骤：

步骤一，提取待检样品基因组dna，使用pcr试剂盒进行pcr扩增；

步骤二，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含有苦瓜枯萎病菌；所述判断具体为：如果电泳结果在294bp位置出现单一的扩增条带，则说明样品中含有苦瓜枯萎病菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有苦瓜枯萎病菌。

作为本发明进一步的方案：所述pcr试剂盒含有引物fomm-spf和引物fomm-spr。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤一中所述的pcr试剂盒还含有pcr扩增缓冲液、阳性对照以及阴性对照。

作为本发明再进一步的方案：所述的阳性对照为含有苦瓜枯萎病菌特异性扩增片段的质粒dna。

作为本发明再进一步的方案：所述的阴性对照为无菌水。

作为本发明再进一步的方案：所述pcr扩增所采用的检测体系为25μl，反应体系包括：2×greentaqmastermix12.5μl，10μm的上下游引物各1μl，模板溶液1μl，最后用灭菌的去离子水补足至25μl。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤一中所述的pcr扩增所采用的扩增程序为：95℃预变性3min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为：94℃变性15s，57℃退火30s，72℃延伸20s，循环共30个；循环结束后72℃延伸5min，降温至16℃结束。

作为本发明再进一步的方案：所述引物fomm-spf和引物fomm-spr的摩尔比为1:1。

作为本发明再进一步的方案：所述引物fomm-spf和引物fomm-spr的浓度均为10μm。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明包括引物fomm-spf和引物fomm-spr，它们分别具有序列表中seq.id.no.3和seq.id.no.4的碱基序列；还制备了相应的pcr试剂盒并建立了相应的检测方法，该试剂盒含有引物fomm-spf和引物fomm-spr、pcr扩增试剂、尖孢镰孢菌苦瓜专化型阳性对照和阴性对照；具有特异、灵敏、快速、简便的特点，弥补了目前对尖孢镰孢菌苦瓜专化型早期检测的技术空缺，可作为保护地栽培、基础实验室等场所开展快速检测的良好方法；为生产上苦瓜枯萎病的预测预警、早期诊断和有效防控提供及时、准确的信息和指导。

说明书附图

图1是本发明pcr检测方法退火温度实验检测结果图，图中：1-53℃；2-55℃；3-57℃；4-60℃；5-62℃和6-65℃；m.dl2000分子质量标准。

图2是本发明pcr检测方法特异性实验结果图，图中：m-2000bpdna标准分子质量,1-尖孢镰孢菌古巴专化型，2-尖孢镰孢菌西瓜专化型，3-尖孢镰孢菌甜瓜专化型，4～9-苦瓜枯萎病菌分离物，10-假禾谷镰孢菌，11-燕麦镰孢菌,12-黄色镰孢菌,13-稻恶苗病菌,14-亚洲镰孢菌,15-禾谷镰孢菌。

图3是本发明特异性检测实验its检测各菌株的dna质量，图中样品与图2相对应：m-2000bpdna标准分子质量,1-尖孢镰孢菌古巴专化型，2-尖孢镰孢菌西瓜专化型，3-尖孢镰孢菌甜瓜专化型，4～9-苦瓜枯萎病菌分离物，10-假禾谷镰孢菌，11-燕麦镰孢菌,12-黄色镰孢菌,13-稻恶苗病菌,14-亚洲镰孢菌,15-禾谷镰孢菌。

图4是本发明pcr检测方法灵敏性试验结果图，图中：1-50ng；2-20ng；3-10ng；4-5ng；5-2ng；6-1ng；7-0ng；m,2000bpdnaladder。

图5是本发明pcr检测方法的土壤的检测结果图，图中：1-5×10¹个分生孢子；2-5×10²个分生孢子；3-5×10³个分生孢子；4-5×10⁴个分生孢子；5-5×10⁵个分生孢子；6-阴性对照-未加分生孢子的土壤；7-阳性对照-基因组dna；8-无菌水；m-2000bpdna标准分子量。

图6是本发明pcr检测方法检测接种苦瓜枯萎病菌后12天苦瓜植株带菌检测结果图，图中：1、2：接种的苦瓜子叶；3、4、6、7：接种的苦瓜根；5、8、9：接种的苦瓜叶柄，10-未接种苦瓜叶柄对照；11-未接种苦瓜根对照；12-阳性对照。

图7是本发明pcr检测方法检测不同土壤中苦瓜枯萎病菌的检测结果图。

图8是本发明pcr检测方法检测不同地区健康和罹病植物的检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

实施例

一种检测苦瓜枯萎病菌的pcr引物，包括上游引物和下游引物；所述的上游引物的核苷酸序列如seq.id.no.3，所述的下游引物的核苷酸序列如seq.id.no.4所示，分别来自urp-32f(seq.id.no.1)扩增的特异片段seq.id.no.2和经优化的特异性扩增片段seq.id.no.5。

一种通过pcr试剂盒检测苦瓜枯萎病菌的方法，包括以下步骤：

步骤一，提取待检样品基因组dna，使用pcr试剂盒进行pcr扩增；

步骤二，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含有苦瓜枯萎病菌；所述判断具体为：如果电泳结果在294bp位置出现单一的扩增条带，则说明样品中含有苦瓜枯萎病菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有苦瓜枯萎病菌。

所述pcr试剂盒含有引物fomm-spf和引物fomm-spr。

所述步骤一中所述的pcr试剂盒还含有pcr扩增缓冲液、阳性对照以及阴性对照。

所述的阳性对照为含有苦瓜枯萎病菌特异性扩增片段的质粒dna。

所述的阴性对照为无菌水。

所述pcr扩增所采用的检测体系为25μl，反应体系包括：2×greentaqmastermix12.5μl，10μm的上下游引物各1μl，模板溶液1μl，最后用灭菌的去离子水补足至25μl。

所述步骤一中所述的pcr扩增所采用的扩增程序为：95℃预变性3min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为：94℃变性15s，57℃退火30s，72℃延伸20s，循环共30个；循环结束后72℃延伸5min，降温至16℃结束。

所述引物fomm-spf和引物fomm-spr的摩尔比为1:1。

所述引物fomm-spf和引物fomm-spr的浓度均为10μm。

引物设计

根据urp-32f(universalriceprimer-32f)引物扩增尖孢镰孢菌古巴专化型、西瓜专化型、甜瓜专化型代表菌株和苦瓜枯萎病分离物的多态条带，得到苦瓜专化型1014bp差异条带，经切胶回收该片段，ddh2o洗脱dna,送上海生工测序，得到特异片段的序列，其全长序列见seq.id.no.2，根据该特异性测序结果，设计获得特异性引物fomm-spf和引物fomm-spr，见表1，扩增294bp的条带见序列seq.id.no.5。

表1引物序列

pcr反应体系与反应程序的建立

1、dna模板制备

液体yepg摇培苦瓜枯萎病菌培养物5天，过滤收集分生孢子，血球计数板定量孢子浓度，ctab法快速震荡破碎分生孢子，酚氯仿抽提dna，产物直接用于pcr反应或置于4℃保存。

2、pcr扩增反应

按pcr反应体系，见表2；配制反应混合物放入pcr仪，pcr反应程序：预变性：95℃3min；扩增30个循环(包括：94℃15s；退火：57℃30s；延伸：72℃20s)；最后延伸：72℃5min。反应结束后，取pcr产物5μl点样于1％琼脂糖凝胶加样孔电泳，在溴化乙锭(0.5μg/ml)溶液中染色，漂洗后进行鉴定，如电泳结果在294bp处出现扩增条带，同时阴、阳性成立，即表明待检样品中有苦瓜枯萎病菌。

表2pcr反应组份

pcr检测方法退火温度确定

用提取好的样品dna做模板，设置不同的退火温度，然后其它条件均设置相同进行pcr，pcr完成后取产物6μl点样于1％琼脂糖凝胶；电泳后在含有0.5μg/ml溴化乙锭溶液染色，并在紫外分析仪下观察照相，以确定其最佳退火温度。结果显示，退火温度从53℃,55℃,57℃,60℃,62℃至65℃，pcr产物结果均很特异，见图1，最终确定检测方法的退火温度设定为57℃。

特异性实验

用前述已建立的pcr方法，分别以尖孢镰孢菌苦瓜分离物dna、土壤中几种常见镰孢菌dna、ddh2o为模板进行pcr检验，按表2的体系配制反应液，按照实例2的方法进行特异性检测；结果显示只有苦瓜枯萎菌能进行特异性扩增，其它尖孢镰孢菌专化性和其它属的镰孢菌不能扩增出目的条带，见图2；结果显示，本发明检测方法具有很高的特异性；为了测定模板dna质量，利用都能扩增出条带的通用引物its1(seqidno.6)和引物its4(seq.id.no.7)测定dna模板，结果显示pcr反应的各模板dna质量良好，见图3：m-2000bpdna标准分子质量,1-尖孢镰孢菌古巴专化型，2-尖孢镰孢菌西瓜专化型，3-尖孢镰孢菌甜瓜专化型，4～9-苦瓜枯萎病菌分离物，10-假禾谷镰孢菌，11-燕麦镰孢菌,12-黄色镰孢菌,13-稻恶苗病菌,14-亚洲镰孢菌,15-禾谷镰孢菌。

灵敏度实验

用核酸测定仪测定了模板dna浓度并稀释后进行pcr测定，30个循环后检测该方法的灵敏性，最终测定该方法的最低检测量为1-5ng，见图4。

试剂盒组装

根据以上实施例子的研究结果，组装检测试剂盒以方便使用。

1、引物fomm-spf和fomm-spr，浓度均为10μm。

3、pcr扩增试剂：普通2×greentaqmix。

4、苦瓜枯萎病菌阳性对照和阴性对照。

阳性对照：将fomm-spf/fomm-spr特异性扩增片段克隆到pmd-18t载体，并测序验证为100％同源，最后制备目的片段重组质粒pmd-fomm，在含有氨苄青霉素的lb细菌培养液中培养，收集菌液，提取质粒dna作为阳性对照；阴性对照：无菌水作为阴性对照。

土壤中苦瓜枯萎病菌检测实验

液体摇培苦瓜枯萎病菌株，过滤收集分生孢子，血球计数板定量孢子浓度，调整到5×10⁶孢子/ml，在2ml灭菌的离心管中再系列稀释，获得5×10⁵/ml、5×10⁴/ml、5×10³/ml、5×10²/ml和5×10¹/ml孢子悬浮液，无菌水为对照；取1ml转入新的螺口带橡皮垫圈且耐低温的2ml灭菌的离心管，12000×g离心1min，弃上清液，加入500mg过筛的灭菌土和300μl研磨沙；按照mag-bindsoildnakitm5635-01土壤提取dna试剂盒说明书介绍的方法提取土壤中苦瓜枯萎病菌分生孢子dna；具体步骤：在上述离心管中加入0.8mlslxmlus缓冲液，在scientz-48高通量组织研磨器中，以70hz震荡研磨，60s间歇一次，共5次；然后加80μlds缓冲液，涡旋震荡混匀，70℃水浴10min，13000×g离心5min；取600μl上清液，转入新的2ml离心管，加入200μlsp2缓冲液，涡旋震荡混匀，加100μl试剂htr，涡旋震荡10s，冰上放置5min，然后13000×g离心5min；转移450μlbinding缓冲液和40μlmagsi微磁珠，离心管置于磁力架上，移去液体；取回离心管，加500μlbinding缓冲液，涡旋悬浮微磁珠，在磁力架上移去液体；加1000μlphb缓冲液悬浮微磁珠，同样方法移去液体；加1000μlspm清洗缓冲液，涡旋悬浮微磁珠，同样方法移去液体，重复该步骤一次；把离心管倒扣在吸水纸上，干燥15min，加100μl的dna洗脱缓冲液，涡旋震荡，65℃水浴10min，在磁力架上，小心转移dna洗脱液至新的1.5ml离心管中，作为模板用于pcr扩增检测；取2μl上述dna洗脱液做模板，同样pcr反应体系，扩增dna,上样检测5μlpcr产物，结果500mg土壤中50个苦瓜枯萎病菌分生孢子能够被检测出来；图中1.5×10¹个分生孢子；2.5×10²个分生孢子；3.5×10³个分生孢子；4.5×10⁴个分生孢子；5.5×10⁵个分生孢子；6.阴性对照：为未加分生孢子的灭菌土壤；7.阳性对照：为苦瓜枯萎病菌基因组dna；8.无菌水；m.2000bpdna标准分子量，见图5。

苦瓜植株带菌诊断

在育苗钵中育苦瓜苗，用上述5×10⁵/ml孢子悬浮液50ml灌根，在苦瓜生长的不同时期，取子叶和叶片叶柄，切成小段，放入有灭菌钢珠的耐低温2ml旋口离心管中，液氮速冻，-80℃保存。装有样品的离心管在液氮中预处理，然后在上述震荡仪上，70hz震荡30s，取出离心管液氮处理后，再震荡30s，如此重复5次，用来破碎苦瓜组织和真菌的细胞壁。加700μl65℃预热的ctab提取液和700μl酚氯仿抽提缓冲液，颠倒混匀，65℃水浴1h，期间间歇颠倒混样；12000×g离心5min，取600μl上清液至新的1.5ml离心管，加等量的氯仿异戊醇抽提液，颠倒混匀5min，12000×g离心5min，取500μl上清液至新的1.5ml离心管，加1ml无水乙醇，-20℃放置15min，12000×g离心5min，弃上清，加500μl75％冷乙醇，涡旋，7500×g离心5min，弃乙醇，干燥dna，加10μl灭菌ddh2o溶解dna，该dna将用于pcr检测。使用前述试剂盒，按照本发明的pcr检测方法进行pcr扩增，以苦瓜枯萎病菌基因组dna为阳性对照，取5μlpcr产物用于1.5％琼脂糖凝胶电泳，eb染色照相。结果显示，图6中：1，2：接种株的苦瓜子叶；3，4，6，7：接种株的苦瓜根；5，8，9：接种株的苦瓜叶柄，10.未接种的苦瓜叶柄为对照；11.未接种苦瓜根为对照；12.阳性对照。在2、3、8和9，苦瓜子叶、叶柄和根组织中可以扩增到近300bp的特异性条带，检测为尖孢镰孢菌苦瓜专化型。

苦瓜保护地土壤中苦瓜枯萎病菌的检测

按照5点取样法，从山东泰安的两个苦瓜保护地分别采集土壤样品各一份，分别编号为t1和t2；按照实例7中提取土壤总dna的方法提取样品的总dna，作为模板用于pcr扩增检测；按照本发明试剂盒组装中规定的pcr反应体系和反应条件，扩增dna，上样检测6μlpcr产物。结果表明，编号为t1的土壤检测为阳性，表明该土壤中含有苦瓜枯萎病菌；编号为t2的土壤样品检测结果为阴性，表明该土壤中不含有苦瓜枯萎病菌；图中m为2000bpdna标准分子量，ck-为阴性对照，ck+为阳性对照，t1为土壤样品1，t2为土壤样品2，见图7。

苦瓜保护地罹病苦瓜植株枯萎病菌的检测，以健康苦瓜植株为对照。

分别从山东泰安和福建漳州采集健康苦瓜和罹病苦瓜植株各三份。其中，山东泰安的一份健康植株样品的编号为j1，两份罹病植株样品的编号分别为b1和b2；福建漳州的一份健康植株样品编号为j2，两份罹病植株样品编号分别为b3和b4，按照实例8中的方法提取植株样品茎基部的总dna，作为模板用于pcr扩增检测。按照本发明试剂盒说明书中规定的pcr反应体系和反应条件，扩增dna，上样检测6μlpcr产物。结果显示，从山东泰安和福建漳州采集的健康植株样品，其检测结果均为阴性，而从其它两个地区采集的罹病植株样品的检测结果均为阳性，表明本发明的试剂盒检测结果具有很强的特异性和可靠性。图中m为2000bpdna标准分子量，ck-为阴性对照，ck+为阳性对照，j1为山东泰安的健康植株样品，b1和b2分别为山东泰安的罹病植株样品；j2为福建漳州的健康植株样品，b3和b4分别为福建漳州的罹病植株样品，见图8。

序列表

seq.id.no.1

urp-32f：5′tacacgtctcgatctacagg3′(20bp)

seq.id.no.2

seq.id.no.3

fomm-spf：5′aaggataacgaggctagct3′(19bp)

seq.id.no.4

fomm-spr：5′gtatagagcatctagacacgaatgc3′(25bp)

seq.id.no.5

seq.id.no.6

its1：5′tccgtaggtgaacctgcgg3′(19bp)

seq.id.no.7

its4：5′tcctccgcttattgatatgc3′(20bp)

上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。

申请人：河南农业大学

发明名称：一种检测苦瓜枯萎病菌的pcr引物及通过pcr试剂盒检测的方法

发明人:丁胜利文才艺李震郭康迪赵玉华赵莹

序列表

seq.id.no.1

urp-32f：5′tacacgtctcgatctacagg3′(20bp)

seq.id.no.2

1gagcaaagaataaaggtgagtcgagatatctactggctcgcgaatcgagg

51gagatagtgctcggtagagagcattttcttcggttgtacgtggccttgtc

101ttgcgatagtgctcttcgcggggggaggcaggaggggcaggacttccaat

151tactacgatgtgtccggtgaagggagaaggtgctcggcaaaaaacgcttt

201ctcgcctgatgatccgcagctagcatggggtggtgcagatcgaactggga

251agacttgggaagggggagctgatggctcgacaacctttggaggggaagga

301aaggtagtctgcttggagtttacctctttgcctttctagatggcctcccc

351tattacaatagatcccgcgcttttcagaaaaataatagacgtattcaatg

401gttcgaagagaatgcaaaatttatatatagttcttccgttcacctgcgca

451gtgtcttcttgctactcctggttcggtagcactaatgcaagaatgttgat

501gctcatgagcgtctctggatgctctctgccaaacatcttttcttaccttt

551ccatggctcttcgagccatctgtaccgcctcttcgtgttctccctgctgt

601tgcagcaccaacgcaaggataacgaggctagctagcgtgagaggatgctc

651tttgccaaccacccttctattcccctcaagagctcgtcgagccatcatct

701ctgcctcttcatgtttccactgtttttgtagcaccaccgcaagattgttg

751aggctcataagcgtgtctagatgttctctgccgagcaccctctccctcgc

801ctctagagctagtcaagccatctgctcggcttcctcaaaattcgcctggt

851tctgtatcactatcgcaaggattgttgacgcttgcattcgtgtctagatg

901ctctataccgagcactgttctccctcgcttccagagctcgtcgattcgcc

951gactctgccttctttcgtactttccctggccgtgtagatcgagacgtgat

1001aaaggtaaaaaggc1014

seq.id.no.3

fomm-spf：5′aaggataacgaggctagct3′(19bp)

seq.id.no.4

fomm-spr：5′gtatagagcatctagacacgaatgc3′(25bp)

seq.id.no.5

1aaggataacgaggctagctagcgtgagaggatgctctttgccaaccaccc

51ttctattcccctcaagagctcgtcgagccatcatctctgcctcttcatgt

101ttccactgtttttgtagcaccaccgcaagattgttgaggctcataagcgt

151gtctagatgttctctgccgagcaccctctccctcgcctctagagctagtc

201aagccatctgctcggcttcctcaaaattcgcctggttctgtatcactatc

251gcaaggattgttgacgcttgcattcgtgtctagatgctctatac294

seq.id.no.6

its1：5′tccgtaggtgaacctgcgg3′(19bp)

seq.id.no.7

its4：5′tcctccgcttattgatatgc3′(20bp)