一种检测EB病毒的RCA方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种检测eb病毒的rca方法。

背景技术：

eb病毒(epstein-barrvirus,ebv)是从非洲burkitt’s淋巴瘤培养细胞中发现的一种病毒颗粒，是疱疹病毒γ亚科嗜淋巴细胞病毒属的dna病毒，能够在b淋巴细胞中建立起隐性感染，刺激细胞的增生和转化，它与特定的淋巴源性和上皮源性疾病包括burkitt’s淋巴瘤、霍奇金氏病(hd)、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、鼻咽癌(npc)的发生有密切关系。ebv感染人类口咽部的上皮细胞和b淋巴细胞。在中国南方鼻咽癌患病人群中大多都检测到有eb病毒基因组存在。ebv分布广泛，多呈散发性，亦可引起流行。病毒携带者和病人是传染源。经口密切接触为主要传播途径，发病以15～30岁的年龄组为多，一次得病后可获较持久的免疫力。

检测ebv的方法有eb病毒分离法、elisa法和pcr法。eb病毒分离法虽比较准确，但病毒分离培养困难、耗时长、需要特殊的培养条件；elisa方法灵敏度高、简单快速，但非特异性较高，常常造成假阳性结果；pcr方法灵敏度高、特异性强，但反应条件要求高，并且也存在一定的假阳性反应。滚环扩增(rollingcircleamplification,rca)是一种恒温线性扩增技术，以其快速简易、灵敏度高和特异性强等优点受到广泛关注。锁式探针由5’端模板结合区、中间连接序列区和3’端模板结合区组成。当5’端和3’端与靶序列完全互补时，探针两段在dna连接酶的作用下形成磷酸二酯键被连接成环，为rca扩增提供环形模板，环化后的探针就可通过引物进行滚环复制和支链扩增。反之，若靶序列上存在变异或没有所要检测的目的基因，探针无法被连接成环状，复制也就无法进行。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测eb病毒的rca方法，该检测方法操作简单、检测时间周期短、高特异性和灵敏性，通过滚环复制法，能够检测出eb病毒。

本发明的技术方案如下：一种检测eb病毒的rca方法，按照如下步骤完成：

(1)将待测标本按qiagen公司的病毒dna提取试剂盒步骤处理，获得样本的dna；

(2)捕获探针的杂交：在32μl杂交缓冲液中依次加入6μldna样品、1μmol/l的锁式探针1μl、捕获探针1μl，充分混匀，55℃水浴杂交1h，缓慢冷却至室温，加入40μ链霉亲和素包被的磁珠(溶于2×结合缓冲液中)，混匀，室温放置20min，磁性分离。用1×结合缓冲液清洗磁珠2次，弃去洗液；

(3)锁式探针的环化连接与酶切：去离子水16μl、步骤(2)制得的杂交产物和10×e.colibuffer2μl，混匀，95℃5min，45℃孵育40min后，加入10×bsa缓冲液2μl和0.2μle.colidna连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；再加入10×exonucleaseⅰbuffer2μl和exonucleaseⅰ核酸外切酶2μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活exonucleaseⅰ核酸外切酶；

(4)rca扩增：取步骤(3)中值得的探针环化连接产物42μl、加入100μmol/l引物1μl和10×phi29buffer5μl，95℃5min，冰浴1min；加入phi29dna聚合酶1μl、dntp液1μl，混匀后37℃进行rca反应2h；

(5)取步骤(4)制得的扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果；

所述步骤(2)(4)中所设计用于rca反应的引物是：

引物5’-cttgtgctaatcgcagtaacctaat-3’seqno1；

探针是：

锁式探针

5’-tcaccacccgggacttgtacccggactgtctgtatctgctaaccaagagcaactacacgaattctcgattaggttagcacaagcgggaagacaaccacagacaccgtcc-3’，探针的5’端进行磷酸化修饰seqno2；

捕获探针

biotin-aagaggatcaaaacatgcggaccaccagctggtacttgaccgaagseqno3。

采用上述技术方案，本发明通过锁式探针特异识别靶基因序列，rca扩增放大检测信号，是一种检测eb病毒的新方法。该方法不需特殊设备、操作简单、特异性好、灵敏度高，在病毒检测方面具有独特优势。

rca扩增反应的最低检测浓度：

用本发明的方法检测终浓度分别为5pm、50pm、500pm和5nm的模板，rca扩增产物电泳结果如图1所示。结果显示，rca在模板终浓度5pmol/l以上均可见明亮条带，表明rca的最低检测浓度为5pmol/l。结果提示，循环rca能较好满足低病毒载量标本的检测。

有益效果：本发明锁式探针结合rca技术是一种检测eb病毒的新方法，通过锁式探针特异识别靶基因序列，rca扩增放大检测信号。该方法不需特殊设备、操作简单、特异性好、灵敏度高，在低病毒载量检测方面具有独特优势。

附图说明

图1rca检测不同浓度的模板电泳结果(第1，2,3,4,5泳道分别代表marker、终浓度为5nm，500pm，50pm，5pm模板组rca产物电泳结果)。

图2样本进行rca检测的电泳结果(1泳道为marker，2，3，4，5,6,7,8,9,10,11,12为第1至11号标本rca产物组电泳结果)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明：

实施例1

一种检测eb病毒的rca方法，按照如下步骤完成：

(1)将待测标本按qiagen公司的病毒dna提取试剂盒步骤处理，获得样本的dna；

(2)捕获探针的杂交：在32μl杂交缓冲液中依次加入6μldna样品、1μmol/l的锁式探针1μl、捕获探针1μl，充分混匀，55℃水浴杂交1h，缓慢冷却至室温，加入40μ链霉亲和素包被的磁珠(溶于2×结合缓冲液中)，混匀，室温放置20min，磁性分离。用1×结合缓冲液清洗磁珠2次，弃去洗液；

(3)锁式探针的环化连接与酶切：去离子水16μl、步骤(2)制得的杂交产物和10×e.colibuffer2μl，混匀，95℃5min，45℃孵育40min后，加入10×bsa缓冲液2μl和0.2μle.colidna连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；再加入10×exonucleaseⅰbuffer2μl和exonucleaseⅰ核酸外切酶2μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活exonucleaseⅰ核酸外切酶；

(4)rca扩增：取步骤(3)中值得的探针环化连接产物42μl、加入100μmol/l引物1μl和10×phi29buffer5μl，95℃5min，冰浴1min；加入phi29dna聚合酶1μl、dntp液1μl，混匀后37℃进行rca反应2h；

(5)取步骤(4)制得的扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果；

所述步骤(2)(4)中所设计用于rca反应的引物是：

引物5’-cttgtgctaatcgcagtaacctaat-3’seqno1；

探针是：

锁式探针

5’-tcaccacccgggacttgtacccggactgtctgtatctgctaaccaagagcaactacacgaattctcgattaggttagcacaagcgggaagacaaccacagacaccgtcc-3’，探针的5’端进行磷酸化修饰seqno2；

捕获探针

biotin-aagaggatcaaaacatgcggaccaccagctggtacttgaccgaagseqno3。

通过实施例1的检查方法对11例临床标本进行检测：

rca产物检测：

通过实施例1的检查方法对11例标本提取dna，然后将dna进行rca检测，结果显示10例为阳性，1例为阴性。

eb病毒的阳性检测结果与常规pcr方法完全一致，说明检测的结果是满意的。