一种金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽及其制备方法与流程

本发明属于活性肽制备技术领域，具体是一种金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽及其制备方法。

背景技术：

金枪鱼类属鲈形目鲭科又叫鲔鱼，华人世界又称为“吞拿（鱼）”，是大洋暖水性洄游鱼类，主要分布在印度洋、太平洋中部与大西洋中部，是一种很受欢迎的海产，经济价值高。鲔鱼的肉色为红色，这是因为鲔鱼的肌肉中含有了大量的肌红蛋白所致。鲔鱼的游程很远，过去曾经在日本近海发现过从美国加州游过去的鲔鱼。鲔鱼有8个品种，其中多数品种体积巨大，最大的体长达3.5米，重达600至700公斤，而最小的品种只有3公斤重。鲔鱼的繁殖能力很强，一条50公斤重雌鱼，每年可产卵500万粒之多。

抗冻肽是一类在加入到其他溶液中后，可降低溶液冰点，进而提高抗冻效果的物质。传统使用的商业抗冻剂为4%蔗糖和4%山梨糖醇的混合物，这种抗冻剂虽然具有一定的抗冻效果，但是由于其甜度与热量较高，不符合“低甜”和“低热”的消费趋势，抗冻肽是一类能够吸附在冰晶表面，抑制冰晶的生长和重结晶的活性肽。它可以降低溶液的冰点，而对熔点影响甚微，使得冰点与熔点之间产生差值，这称为热滞活性。通过热滞活性，抗冻肽可以保护生物在低温下免受冻害。相比商业抗冻剂，抗冻肽不仅更符合消费趋势，且其抗冻效果优于商业抗冻剂。但当下天然抗冻剂的生产工艺较为复杂且活性低，耗时耗资，不适合工业化生产。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状提供一种在结冰或亚结冰条件下，能阻止冰晶形成，调控胞外冰晶增长，抑制冰重晶华的金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽，其纯度高，生物活性强，可作为医学、生物、食品和化工等领域的安全添加剂。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种制备步骤简单，重现性好，提取率高，适合工业化生产的金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽的制备方法。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：

一种金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽的制备方法，其特征在于包括下述步骤：

金枪鱼鱼骨明胶的制备：金枪鱼鱼骨用0.1mol/lnaoh溶液脱除非胶原蛋白，用0.5mol/ledta溶液脱钙后，按料液比1g:10~15ml向脱钙鱼骨粉中加入1.0mol/lhcl溶液，处理15~18h后，将鱼骨粉水洗至中性，然后按照料液比1g:11~15ml将蒸馏水加入到鱼骨粉中，于60~70℃提取8~10h，过滤，滤液真空浓缩，于60~75℃真空干燥得鱼骨明胶；

金枪鱼鱼骨明胶的酶解：将上述鱼骨明胶按固液比1g:10~15ml加入双蒸水，用hcl调溶液ph到2~4，溶液升温至35~45℃，按照明胶质量的1.0~1.5%向明胶溶液中加入酸性蛋白酶（酶活力≥6.0×10⁴u/g），酶解2~4h后，用naoh调溶液ph到6.5~7.5，按照明胶质量的1.2~1.5%向溶液中加入中性蛋白酶（酶活力≥5.0×10⁴u/g），在45~50℃酶解2~4h；然后将酶解液升温至90~95℃后恒温保持10~15min，冷却至室温，于9000~10000rpm离心10~15min，除去沉淀物，得到酶解液；

金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽的制备：将上述酶解液采用5kda超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于5kda部分，得到超滤酶解液，将超滤酶解液按照体积比加入到装有6～8倍d101大孔树脂的层析柱中，用4～5倍柱体积双蒸水洗脱除去杂质，然后用5～8倍柱体积的70%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经阳离子交换树脂层析和凝胶柱层析，得到金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽。上述金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽经成分测定和抗冻试验表明，其纯度高且生物活性强，可作为医学、生物、食品和化工等领域的安全添加剂。

作为优选，所述的金枪鱼鱼骨明胶的制备步骤中的金枪鱼，其来源为鲣鱼（bulletmackerel）。

作为优选，所述的金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽的制备步骤中的阳离子交换树脂层析和凝胶柱层析的具体过程为：

离子交换树脂层析：将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为45~50mg/ml的溶液，经过阳离子交换树脂（sp-sephadexc-25）层析柱分离，用水、0.5mol/l和1.0mol/lnacl溶液进行洗脱，根据220nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，大肠杆菌低温保护实验效果最好组分为阳离子交换层析酶解液；

凝胶柱层析：将上述阳离子交换层析酶解液溶于双蒸水配成浓度为15~20mg/ml的溶液，经过葡聚糖凝胶sephadexg-25柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有大肠杆菌低温保护实验效果最好组分为金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽。

作为优选，金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽的特征为平均分子量为1250.0~1315.0da；所含4种主要多肽gpagqegpaglvg、gfrgpagtiglvg、gfigpagpag、gpsgplgfpgpsg的质量比为1：1.78~1.93：0.85~0.91：0.73~0.84；甘氨酸(gly)、脯氨酸(pro)、羟脯氨酸(hyp)、精氨酸(arg)、谷氨酸（glu）和丙氨酸（ala）的质量比25.28~27.41：13.98~14.37：10.06~11.83：7.46~8.27：8.93~9.74：6.38~7.09。与现有技术相比，本发明的优点在于：

1.本发明制备的金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽在结冰或亚结冰条件下，能阻止冰晶形成，调控胞外冰晶增长，抑制冰重晶华。其纯度高，生物活性强，可作为医学、生物、食品和化工等领域的安全添加剂；

2.本发明制备方法操作简单，每一步均有准确数据支持，重现性好，适合工业化生产。提取率高，相应地降低了生产成本，具有良好的市场前景。

附图说明

图1是本发明的阳离子交换树脂（sp-sephadexc-25）层析图；

图2是本发明的葡聚糖凝胶sephadexg-25层析图；

图3葡聚糖凝胶sephadexg-25制备抗冻肽的rp-hplc分析。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

一种金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽的制备方法，制备工艺流程如下：金枪鱼鱼骨"脱非胶原蛋白和脱钙"双酶酶解"酶解物"超滤"大孔树脂纯化"阳离子交换层析"凝胶过滤层析"抗冻肽。

具体步骤为：

(1)金枪鱼鱼骨明胶的制备：鲣鱼（bulletmackerel）鱼骨用0.1mol/lnaoh溶液脱除非胶原蛋白，用0.5mol/ledta溶液脱钙后，按料液比1g:13ml向脱钙鱼骨粉中加入1.0mol/lhcl溶液，处理17h后，将鱼骨粉水洗至中性，然后按照料液比1g:14ml将蒸馏水加入到鱼骨粉中，于65℃提取9h，过滤，滤液真空浓缩，于65℃真空干燥得鱼骨明胶；

(2)金枪鱼鱼骨明胶的酶解：将鱼骨明胶按固液比1g:13ml加入双蒸水，用hcl调溶液ph到3.2，溶液升温至40℃，按照明胶质量的1.2%向明胶溶液中加入酸性蛋白酶（酶活力≥6.0×10⁴u/g），酶解3.5h后，用naoh调溶液ph到7.0，按照明胶质量的1.3%向溶液中加入中性蛋白酶（酶活力≥5.0×10⁴u/g），在48℃酶解3.5h；然后将酶解液升温至90℃后恒温保持15min，冷却至室温，于10000rpm离心10min，除去沉淀物，得到酶解液；

(3)金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽的制备：将上述酶解液采用5kda超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于5kda部分，得到超滤酶解液，将超滤酶解液按照体积比加入到装有6倍d101大孔树脂的层析柱中，用5倍柱体积双蒸水洗脱除去杂质，然后用6倍柱体积的70%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经阳离子交换树脂层析和凝胶柱层析，得到金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽。

①阳离子交换层析：将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为45~50mg/ml的溶液，经过阳离子交换树脂（sp-sephadexc-25）层析柱分离，用水、0.5mol/l和1.0mol/lnacl溶液进行洗脱，根据220nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，大肠杆菌低温保护实验效果最好组分为阳离子交换层析酶解液tph-iii（图1）；

②凝胶色谱层析：将上述阳离子交换层析酶解液tph-iii溶于双蒸水配成浓度为15~20mg/ml的溶液，经过葡聚糖凝胶sephadexg-25柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有大肠杆菌低温保护实验效果最好组分为金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽tph-iii-2（图2）；

③样品分析检测：抗冻肽的特征为平均分子量为1278.0da；所含4种主要多肽gpagqegpaglvg、gfrgpagtiglvg、gfigpagpag、gpsgplgfpgpsg的质量比为1：1.85：0.87：0.81（图3）；甘氨酸(gly)、脯氨酸(pro)、羟脯氨酸(hyp)、精氨酸(arg)、谷氨酸（glu）和丙氨酸（ala）的质量比26.28：14.05：10.94：7.86：9.35：6.79。

将制得的金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽tph-iii-2进行大肠杆菌保护活性实验（赵珺，等。福州大学学报(自然科学版)，2013，41（1）：121-126），结果表明：空白对照组大肠杆菌经过-20℃、24h低温处理后全部死亡，而添加了抗冻肽tph-iii-2（500μg·ml^-1）的实验组大肠杆菌的存活率为73.5%，表明tph-iii-2在低温下对大肠杆菌具有较好的保护作用。

实施例2：

一种金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽的制备方法，优化步骤为：

(1)金枪鱼鱼骨明胶的制备：鲣鱼（bulletmackerel）鱼骨用0.1mol/lnaoh溶液脱除非胶原蛋白，用0.5mol/ledta溶液脱钙后，按料液比1g:15ml向脱钙鱼骨粉中加入1.0mol/lhcl溶液，处理16h后，将鱼骨粉水洗至中性，然后按照料液比1g:15ml将蒸馏水加入到鱼骨粉中，于65℃提取9h，过滤，滤液真空浓缩，于65℃真空干燥得鱼骨明胶；

(2)金枪鱼鱼骨明胶的酶解：将鱼骨明胶按固液比1g:14ml加入双蒸水，用hcl调溶液ph到3.0，溶液升温至40℃，按照明胶质量的1.5%向明胶溶液中加入胃蛋白酶（酶活力≥6.0×10⁴u/g）、月桂酸和酒石酸，酶解1.0h后，用naoh调溶液ph到7.0，按照明胶质量的1.3%向溶液中加入中性蛋白酶（酶活力≥5.0×10⁴u/g），在48℃酶解3.5h；然后将酶解液升温至90℃后恒温保持15min，冷却至室温，于10000rpm离心10min，除去沉淀物，得到酶解液。月桂酸和酒石酸的加入量分别为胃蛋白酶质量的1%和3%，其中，酒石酸为质量比1：0.1的l-酒石酸和d-酒石酸的混合物。上述试剂的添加不仅可提高胃蛋白酶的活性，缩短酶解时间，还可以出乎意料地提高金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽产量；

(3)金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽的制备：将上述酶解液采用5kda超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于5kda部分，得到超滤酶解液，将超滤酶解液按照体积比加入到装有6倍d101大孔树脂的层析柱中，用5倍柱体积双蒸水洗脱除去杂质，然后用6倍柱体积的70%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经阳离子交换树脂层析和凝胶柱层析，得到金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽。

①阳离子交换层析：将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为45~50mg/ml的溶液，经过阳离子交换树脂（sp-sephadexc-25）层析柱分离，用水、0.5mol/l和1.0mol/lnacl溶液进行洗脱，根据220nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，大肠杆菌低温保护实验效果最好组分为阳离子交换层析酶解液；

②凝胶色谱层析：将上述阳离子交换层析酶解液溶于双蒸水配成浓度为15~20mg/ml的溶液，经过葡聚糖凝胶sephadexg-25柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有大肠杆菌低温保护实验效果最好组分为金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽；

③样品分析检测：抗冻肽的特征为平均分子量为1278.0da；所含4种主要多肽gpagqegpaglvg、gfrgpagtiglvg、gfigpagpag、gpsgplgfpgpsg的质量比为1：1.81：0.90：0.79；甘氨酸(gly)、脯氨酸(pro)、羟脯氨酸(hyp)、精氨酸(arg)、谷氨酸（glu）和丙氨酸（ala）的质量比26.35：14.12：10.17：7.84：9.22：6.82。

将制得的金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽进行大肠杆菌保护活性实验（赵珺，等。福州大学学报(自然科学版)，2013，41（1）：121-126），结果表明：空白对照组大肠杆菌经过-20℃、24h低温处理后全部死亡，而添加了金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽（500μg·ml^-1）的实验组大肠杆菌的存活率为74.1%，表明金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽在低温下对大肠杆菌具有较好的保护作用。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。