本发明涉及天然活性成分提取领域，特别涉及米糠多糖的制备工艺。
背景技术：
米糠是禾本科植物水稻（oryzasativa）所结谷粒轧制加工成精大米过程产生的，米糠是稻谷加工成大米的副产品之一，它是在糙米轧制成精大米过程中产生的，是由米胚芽、籽粒表皮种皮、糊粉层和部分胚乳等成分混合而成，占糙米质量的7%～11%。米糠中富含脂肪、蛋白质及米糠多糖等营养物质和生育酚、生育三烯酚等生理活性物质。近年来，欧美及日本等发达国家的科研人员利用高新技术对稻谷中有效成分进行了广泛、深入的研究和开发，使稻谷资源增值非常显著，产生了巨大的社会和经济效益。我国虽然是稻米生产大国，米糠产量也居世界首位，但是对于米糠的综合应用研究仍处于较低水平，大部分米糠被作为饲料应用于畜牧领域，利用率低且浪费严重。我国对多糖研究起步较晚，并且多集中于对从人参、灵芝、刺五加、黄芪等名贵中草药中提取得到的多糖进行研究，对米糠多糖的研究相对较少。米糠多糖是从米糠中提取出来的具有多种生物活性且结构复杂的多糖复合物，米糠多糖拥有很好的生理功能，较强的抗肿瘤及降低胆固醇功能，对提高免疫力和降低血糖水平等也有一定功效，它的生理活性与其三维立体结构、分子量大小、分支度以及主链连接方式有关。
现有技术如授权公告号为cn103290081b的中国发明专利，公开了一种米糠活性多糖的提取方法，以脱脂米糠为原料，经过煮沸、降温、复合酶酶解等工艺处理，再经过离心、sevage法除蛋白、醇析、真空干燥得到米糠多糖；具有条件温和、杂质易除和提高得率等优点，多种复合酶处理可以降解多种蛋白质、纤维素、淀粉与米糠多糖呈结合态的物质，提高得到的米糠多糖的纯度；再和微波辅助提取联用，后续加上一系列除蛋白工艺，可以得到含量高、纯度高的米糠多糖，适合在产业上广泛应用。但是该提取方法提取的米糠多糖粘度较大，溶解性差，不利用实际应用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种提取方法简单可行，资源利用率高，提取速率快，提取率高，多糖的提取效率提高、残留率降低，适宜大规模工业化生产，没有污染的米糠多糖的制备工艺。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：
米糠多糖的制备工艺，其具体步骤为：
松生拟层孔菌和硫磺菌购自上海研生实业有限公司。
步骤1：取经粉碎后的脱脂米糠，过80-100目筛，按料料液比为1:20-25向米糠粉中加去离子水，混合均匀后封闭，在115-122℃高压灭菌20-40min，备用，米糠粕中米糠多糖往往与木质素、果胶和纤维素等结合，菌种发酵过程中能分泌大量纤维素酶、果胶酶、半乳糖苷酶。这些生物酶不但可以促进米糠多糖的释放而增加其提取效率，而且还能对提取得到的米糠多糖进行结构上的改造，利用实际应用；
步骤2：按接种量为2.7-3.2%和1.1-1.3%依次向米糠水溶液中加入松生拟层孔菌和硫磺菌，在温度为25-35℃下发酵4-6d，发酵完成后在90-100℃下灭菌20-30min，然后在5000-7000rpm下离心20-26rnin，得米糠发酵液和米糠渣，该发酵过程中米糠中的阿拉伯木聚糖和纤维素发生降解，使米糠多糖中的活性片段释放出来，从而获得具有刺激巨噬细胞活性的米糠多糖片段，主要利用微生物胞外酶系酶解断开糖苷键，专一性强，副产物少，多糖得率高、得到的产物容易分离，适宜大规模工业化生产，没有污染，有利于构建环境友好型社会；
步骤3：将米糠渣浸泡于20-30倍重量的蒸馏水中，再加入多功能活性蛋白，然后在70-80℃下用超声微波萃取仪处理30-40min，冷却至室温，然后在5000-7000rpm下离心20-26rnin，上清液即为米糠提取液，上述多功能活性蛋白和脱脂米糠粉的重量比为0.31-0.36:10000，其氨基酸序列为tdhklcvvncfcgaakcylcrvlhpgkcvcvncskqnayasaiprchggktcegicatatmdrysdtggplstarcvnafhgfykgcslyenvsykpfvvswkygvagfyhcgpnfccis，该多功能活性蛋白易溶于水，能通过电荷作用与米糠渣相结合，提高米糠渣在水中的分散性，避免团聚现象的发生，使得超声微波能更好地作用于米糠渣，提高多糖的提取率，同时能让提取出来的多糖快速溶于水中，缩短了提取时间，减少能源消耗，超声微波提取使米糠渣与水作相对运动，始终保持较高的浓度差，米糠渣中有效成分很容易溶入水中，可降低溶剂用量，提高有效成分提取率，使细胞疏松甚至破碎，其中的有效成分快速溶入水中，缩短了提取时间，减少能源消耗，更适合工业化生产的发展方向；
步骤4：将米糠酶解液和米糠提取液合并，然后采用100-200目的滤布进行过滤，去除米糠小颗粒及其他不溶性杂质，按酶添加量为400-600u/g加入胃蛋白酶，在温度为33-43℃、ph为1.3-2.0的条件下酶解1-2h，酶解完成后在90-100℃下灭酶20-30min，冷却至室温，然后在4000-6000rpm下离心8-12min，再将上清液中以体积比1:3-5加入sevage试剂，混合后剧烈振摇20-30min，静置分层，分去下层变性蛋白质及交界处有机溶剂，反复2-3次，得到脱蛋白多糖液，酶解法能够将糖液中游离的蛋白质和部分糖蛋白水解，从而大大的降低多糖中的蛋白质含量，但是加酶量不适宜易引入外来的蛋白质，因此在酶解之后，再用sevage法处理，能够有效的脱除多糖液中游离及酶解的蛋白质，并保证多糖的存在，有效的降低了多糖的损失率；
步骤5：将脱蛋白多糖液浓缩至原体积的20-30%，再加入3-5倍浓缩液体积的无水乙醇，采用边加入边搅拌的方式，直到沉淀完全析出为止，进行沉淀多糖，静置过夜，在6000-8000rpm下离心15-20min，沉淀冷冻干燥得米糠多糖，该米糠多糖分子量活性范围在1000～9999之间，具有很高的活性，能够清除dpph自由基、刺激巨噬细胞释放no，表现出较好的抗氧化性、免疫活性。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明制备工艺简单可行，机械化操作成度高，资源利用率高，提取速率快，能耗低，提取率高，生产成本低，易于工业化规模生产；2）该制备工艺利用微生物胞外酶系酶解断开糖苷键，专一性强，副产物少，多糖得率高、得到的产物容易分离，适宜大规模工业化生产，没有污染，有利于构建环境友好型社会；3）采用超声微波提取，使米糠渣中有效成分很容易溶入水中，可降低溶剂用量，提高有效成分提取率，使细胞疏松甚至破碎，其中的有效成分快速溶入水中，缩短了提取时间，减少能源消耗，更适合工业化生产的发展方向；4）利用酶法结合sevage法处理杂蛋白，能够彻底除去多糖中的蛋白质，有效的降低了多糖的损失率；5）本发明制得的米糠多糖分子量活性范围在1000～9999之间，具有很高的活性，能够清除dpph自由基、刺激巨噬细胞释放no，表现出较好的抗氧化性、免疫活性。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
米糠多糖的制备工艺，其具体步骤为：
步骤1：取经粉碎后的脱脂米糠，过80-100目筛，按料料液比为1:20-25向米糠粉中加去离子水，混合均匀后封闭，在115-122℃高压灭菌20-40min，备用；
步骤2：按接种量为2.7-3.2%和1.1-1.3%依次向米糠水溶液中加入松生拟层孔菌和硫磺菌，在温度为25-35℃下发酵4-6d，发酵完成后在90-100℃下灭菌20-30min，然后在5000-7000rpm下离心20-26rnin，得米糠发酵液和米糠渣；
步骤3：将米糠渣浸泡于20-30倍重量的蒸馏水中，再加入多功能活性蛋白，然后在70-80℃下用超声微波萃取仪处理30-40min，冷却至室温，然后在5000-7000rpm下离心20-26rnin，上清液即为米糠提取液，上述多功能活性蛋白和脱脂米糠粉的重量比为0.31-0.36:10000，其氨基酸序列为tdhklcvvncfcgaakcylcrvlhpgkcvcvncskqnayasaiprchggktcegicatatmdrysdtggplstarcvnafhgfykgcslyenvsykpfvvswkygvagfyhcgpnfccis；
步骤4：将米糠酶解液和米糠提取液合并，然后采用100-200目的滤布进行过滤，去除米糠小颗粒及其他不溶性杂质，按酶添加量为400-600u/g加入胃蛋白酶，在温度为33-43℃、ph为1.3-2.0的条件下酶解1-2h，酶解完成后在90-100℃下灭酶20-30min，冷却至室温，然后在4000-6000rpm下离心8-12min，再将上清液中以体积比1:3-5加入sevage试剂，混合后剧烈振摇20-30min，静置分层，分去下层变性蛋白质及交界处有机溶剂，反复2-3次，得到脱蛋白多糖液；
步骤5：将脱蛋白多糖液浓缩至原体积的20-30%，再加入3-5倍浓缩液体积的无水乙醇，采用边加入边搅拌的方式，直到沉淀完全析出为止，进行沉淀多糖，静置过夜，在6000-8000rpm下离心15-20min，沉淀冷冻干燥得米糠多糖。
实施例2：
米糠多糖的制备工艺，其具体步骤为：
步骤1：取经粉碎后的脱脂米糠，过100目筛，按料料液比为1:20向米糠粉中加去离子水，混合均匀后封闭，在122℃高压灭菌22min，备用；
步骤2：按接种量为3.2%和1.1%依次向米糠水溶液中加入松生拟层孔菌和硫磺菌，在温度为35℃下发酵4d，发酵完成后在100℃下灭菌20min，然后在7000rpm下离心20rnin，得米糠发酵液和米糠渣；
步骤3：将米糠渣浸泡于30倍重量的蒸馏水中，再加入多功能活性蛋白，然后在70℃下用超声微波萃取仪处理40min，冷却至室温，然后在5000rpm下离心26rnin，上清液即为米糠提取液，上述多功能活性蛋白和脱脂米糠粉的重量比为0.31:10000，其氨基酸序列为tdhklcvvncfcgaakcylcrvlhpgkcvcvncskqnayasaiprchggktcegicatatmdrysdtggplstarcvnafhgfykgcslyenvsykpfvvswkygvagfyhcgpnfccis；
步骤4：将米糠酶解液和米糠提取液合并，然后采用200目的滤布进行过滤，去除米糠小颗粒及其他不溶性杂质，按酶添加量为400u/g加入胃蛋白酶，在温度为43℃、ph为1.3的条件下酶解2h，酶解完成后在90℃下灭酶30min，冷却至室温，然后在6000rpm下离心8min，再将上清液中以体积比1:5加入sevage试剂，混合后剧烈振摇22min，静置分层，分去下层变性蛋白质及交界处有机溶剂，反复2次，得到脱蛋白多糖液；
步骤5：将脱蛋白多糖液浓缩至原体积的20%，再加入5倍浓缩液体积的无水乙醇，采用边加入边搅拌的方式，直到沉淀完全析出为止，进行沉淀多糖，静置过夜，在8000rpm下离心15min，沉淀冷冻干燥得米糠多糖。
实施例3：
米糠多糖的制备工艺，其具体步骤为：
步骤1：取经粉碎后的脱脂米糠，过90目筛，按料料液比为1:24向米糠粉中加去离子水，混合均匀后封闭，在121℃高压灭菌30min，备用；
步骤2：按接种量为3.0%和1.2%依次向米糠水溶液中加入松生拟层孔菌和硫磺菌，在温度为30℃下发酵5d，发酵完成后在98℃下灭菌25min，然后在6000rpm下离心22rnin，得米糠发酵液和米糠渣；
步骤3：将米糠渣浸泡于25倍重量的蒸馏水中，再加入多功能活性蛋白，然后在75℃下用超声微波萃取仪处理35min，冷却至室温，然后在6000rpm下离心22rnin，上清液即为米糠提取液，上述多功能活性蛋白和脱脂米糠粉的重量比为0.33:10000，其氨基酸序列为tdhklcvvncfcgaakcylcrvlhpgkcvcvncskqnayasaiprchggktcegicatatmdrysdtggplstarcvnafhgfykgcslyenvsykpfvvswkygvagfyhcgpnfccis；
步骤4：将米糠酶解液和米糠提取液合并，然后采用150目的滤布进行过滤，去除米糠小颗粒及其他不溶性杂质，按酶添加量为500u/g加入胃蛋白酶，在温度为37℃、ph为1.7的条件下酶解1.5h，酶解完成后在98℃下灭酶25min，冷却至室温，然后在5000rpm下离心10min，再将上清液中以体积比1:4加入sevage试剂，混合后剧烈振摇25min，静置分层，分去下层变性蛋白质及交界处有机溶剂，反复3次，得到脱蛋白多糖液；
步骤5：将脱蛋白多糖液浓缩至原体积的25%，再加入4倍浓缩液体积的无水乙醇，采用边加入边搅拌的方式，直到沉淀完全析出为止，进行沉淀多糖，静置过夜，在7000rpm下离心18min，沉淀冷冻干燥得米糠多糖。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>海盐县凌特生物科技有限公司
<120>米糠多糖的制备工艺
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>120
<212>prt
<213>人工合成(mytiluscoruscus)
<400>1
thrasphislysleucysvalvalasncysphecysglyalaalalys
151015
cystyrleucysargvalleuhisproglylyscysvalcysvalasn
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