一种鲟鱼TALEN基因编辑方法与流程

本发明涉及水产动物遗传育种和功能基因验证研究的技术领域，更具体涉及一种鲟鱼基因编辑的方法。

背景技术：

鲟鱼在生物系统演化方面处于软骨鱼和硬骨鱼之间的过渡时期，具有多倍化的基因组，在研究鱼类基因功能及演化方面具有重要的研究价值。但是，在鲟鱼中开展基因功能研究，现有的报道仅局限于基因克隆和表达模式分析(abdolahnejad等，2015.dong等，2015.fajkowska等，2016.song等，2016.yarmohammadi等，2017)。鲟形目鱼类属大型经济鱼类。鲟鱼不仅肉质鲜美，营养全面，富含多种人体必需氨基酸和不饱和脂肪酸，而且是重要的鱼子酱生产材料(simeanu等，2012)。但是，由于人类过度捕捞及水生态环境的破坏，野生鲟鱼资源急剧下降，很多鲟鱼甚至处于濒危状态(billard等，2000)。

开展鲟鱼的遗传育种，培育鲟鱼养殖品种，是满足人类对鲟鱼产品日益增长的需求，保护野生鲟鱼资源的关键。但是，鲟鱼的基因功能研究和遗传改良育种一直受制于缺乏有效的技术手段。

基因编辑技术是利用靶向性的序列特异核酸酶对基因组进行定点突变或精准修饰的技术，包括锌指核酸酶zfn、tale核酸酶和crispr/cas9系统。基因编辑技术在基因功能研究与经济物种的遗传改良中得到了广泛应用。迄今已在斑马鱼、青鱂等模式鱼类和罗非鱼、虹鳟、鲤鱼、沟鲶、野鲮、半滑舌鳎和黄鳝等经济鱼类中建立了高效的基因编辑技术(doyonetal,2008；ansaietal,2013；qiuetal,2014；lietal,2014；yanoetal,2014；zhongetal,2016；qinetal,2016；chakrapanietal,2016；cuietal,2017；fengetal,2017)。但是，迄今没有在鲟鱼中建立基因编辑技术。

因此，建立鲟鱼基因编辑技术，一方面可以用于鲟鱼功能基因研究；另一方面可以用于探索研制鲟鱼养殖新品系，为养殖鲟鱼提供遗传改良的优良品种，保护鲟鱼野生资源。

技术实现要素：

本发明提供了一种鲟鱼talen基因编辑的方法，通过显微注射的方法，将靶基因质粒和针对靶位点的talenmrna利用显微注射方式导入受精时间不超过20分钟的鲟鱼1细胞期受精卵动物极受精孔中，孵化后可获得靶基因突变的鲟鱼。

为了达到上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种鲟鱼talen基因编辑的方法，包括在将靶基因质粒和针对靶位点的talenmrna，利用显微操作的方式注射到受精时间不超过20分钟的鲟鱼1细胞期受精卵动物极受精孔中。以上所述的方法中，优选的，靶基因质粒浓度为100ng/μl，针对靶位点的talenmrna的浓度为100ng～500ng/μl；

以上所述的方法中，优选的，每枚受精卵注射体积为2nl；

以上所述的方法中，优选的，talenmrna的浓度为300ng/μl，talenmrna的左臂和右臂靶点的mrna按照1:1(质量比)混合。

以上所述的方法中，优选的，所述的鲟鱼包括但不限于小体鲟、施氏鲟(a.schrenckii)、俄罗斯鲟(a.gueldenstaedtii)、西伯利亚鲟(a.baerii)。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

目前没有任何进行鲟鱼胚胎的显微操作技术，更没有进行鲟鱼外源基因精准编辑的技术。本发明首次发现在小体鲟卵刚受精的二十分钟内，受精卵动物极明显，卵壳比较柔软，具有一定硬度的毛细玻璃针可以顺畅地刺入动物极，可以成功实施基因转移的胚胎显微操作。本发明第一次建立鲟鱼外源基因精准编辑技术，为开展鲟鱼基因的功能研究和鲟鱼养殖品种的遗传改良提供了强有力的技术手段。

现有的用于基因编辑的转录激活因子样效应物(transcriptionactivator-likeeffectornucleases,talen)系统能识别任意目标基因序列，不受上下游序列影响等问题成功率几乎可达100％，具有脱靶率低、毒性低的优点。将靶基因质粒和针对靶位点的talenmrna按1:3浓度比例混合后，采用显微注射方法按100ng/μl浓度(质粒浓度)导入小体鲟1细胞期的受精胚中，可以获得存活率74％，外源靶基因突变率高达93％的小体鲟胚胎，从而建立小体鲟靶基因精准编辑技术。外源靶基因发生突变的小体鲟胚胎可通过page方法筛选获得。该技术既可以用于研究鲟鱼基因的功能，又可以用于精准修饰外源靶基因，培育遗传改良的鲟鱼养殖新品系。

附图说明

图1为构建的表达红色和绿色荧光蛋白的pgfp-rfp质粒。

图2为talen敲除的egfp靶位点。

图3为小体鲟受精卵，白色箭头指示动物极受精孔。

图4为egfp基因突变的检测；

图4中a：7个注射胚胎的靶位点突变率检测。hm对应条带代表未发生突变的靶位点dna片段，ht对应条带代表碱基发生减少、增加或改变的靶位点dna片段；

图4中b：注射胚胎的存活率；

图4中c：根据ht条带和hm条带亮度计算得出的靶位点突变频率；

图4中d：注射胚胎的荧光观察。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明以在小体鲟胚胎中编辑外源基因egfp为例，对本发明的方法进行说明；利用本发明提供的方法，也能对其他鲟鱼进行外源基因的编辑，该技术可以用于研究鲟鱼基因的功能和鲟鱼品种的遗传改良。

实施例1：

一种鲟鱼talen基因编辑的方法，包括下述步骤：

1)挑选性成熟的小体鲟亲鱼，在室内养殖系统中暂养。距人工繁殖25小时前，注射lhrha和dom混合物进行人工催产，注射剂量为10μglhrha+1mgdom/kg体重，每隔12个小时注射1次，雌性鲟鱼连续注射2次，雄性鲟鱼注射1次。待亲鱼有排精/排卵迹象，挤出精液到干燥的烧杯，挤出卵到玻璃平皿。用0.3×danieaubuffer[17mmnacl，2mmkcl，0.12mmmgso4，1.8mmca(no3)2，1.5mmhepes，ph7.6]将精液稀释100倍，进行人工授精。受精时间1-2分钟，随后洗去多余的精液，即获得可用于显微注射的小体鲟受精卵。将受精卵放置在略有覆盖的0.3×danieaubuffer玻璃培养皿中。

2)构建表达红色和绿色荧光蛋白的pgfp-rfp质粒

按照文献[liu,y.,luo,d.,lei,y.,hu,w.,zhao,h.,cheng,c.h.(2014)ahighlyeffectivetalen-mediatedapproachfortargetedgenedisruptioninxenopustropicalisandzebrafish.methods69,58-66.]所述方法，将具有cmv启动子，编码红色荧光蛋白(rfp)和sv40序列的pdsred质粒，用clai(neb,r0197)进行酶切后，与用clai线性化后的pegfp-c1(clontech)质粒连接，构建出表达红色和绿色荧光蛋白的pgfp-rfp质粒(图1)。

3)构建靶基因pgfp-rfp的talen表达载体

以egfp基因核心编码区(acctacggc)作为敲除靶点，设计tal靶点识别序列，左侧为tggcccaccctcgtgacca，右侧为agcggctgaagcactgca，中间间隔序列为长15bp的ccctgacctacggcg(图2)。按照文献[liu,y.,luo,d.,lei,y.,hu,w.,zhao,h.,cheng,c.h.(2014)ahighlyeffectivetalen-mediatedapproachfortargetedgenedisruptioninxenopustropicalisandzebrafish.methods69,58-66]所述方法构建talens表达载体。

具体步骤如下：

第一步用goldengate载体构建含有tale重复序列的质粒。goldengate载体购自addgene(cat#1000000024)。在bsai酶消化识别a(ni)，t(ng)，c(hd)，g(nn)单模块化质粒并用t4连接酶连接后，得到含左侧识别序列的重组质粒pfus-a和右侧识别序列的重组质粒pfus-bn。

第二步将含核酸内切酶foki骨架质粒pcs2-foki-eld和质粒pfus-a，pcs2-foki-kkr和pfus-bn分别进行消化连接，构建靶基因pgfp-rfp的talen表达载体pcs2-gfp-talen-eld和pcs2-gfp-talenkkr。

4)talen表达载体线性化和获得注射用mrna

talen表达载体pcs2-gfp-talen-eld和pcs2-gfp-talenkkr分别经noti(neb,r0189)酶切线性化后，用mmessagemmachinesp6kit(ambion,am1340)体外转录成mrna，并纯化。将左臂和右臂靶点mrna按照1:1浓度混合，并加入少量无rna酶的酚红，以备显微注射。

5)显微注射小体鲟1细胞期胚胎

将刚受精的(受精时间不超过20分钟)小体鲟1细胞期受精卵(受精后20min内的受精卵)放置在略有覆盖的0.3×danieaubuffer玻璃培养皿中。在体式显微镜(olympus,日本)下调整小体鲟1细胞期受精卵动物极朝上(图3)。利用氮气加压的定量显微注射系统(warnerpli-100a，美国)，将pgfp-rfp质粒和talentmrna的混合溶液逐枚注射到小体鲟1细胞期受精卵动物极的受精孔中。注射质粒终浓度为100ng/μl，talenmrna终浓度分别为100，200，300，400，500ng/μl。

每枚受精卵注射体积为2nl。将显微注射后的胚胎置于16℃培养。

6)筛选靶基因突变的小体鲟

待受精后8天，显微注射的胚胎发育至出膜期，按个体收集胚胎并以常规方法提取基因组dna。用检测引物f1-ggtcgagctggacggcgacgtaaac和r1-cctcggcgcgggtcttgtagttgcc扩增包含egfp靶位点的基因部分片段。pcr反应条件为：95℃1分钟，95℃15秒，52℃15秒，72℃30秒(30个循环)，72℃5分钟。最后将pcr产物置于95℃1分钟，然后缓慢降温至37℃。将最终的pcr产物以8％聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)，以80v电压电泳1.5小时，凝胶用eb染色。根据电泳条带数及亮度，按照文献[chenj,zhangx,wangt,liz,guang,hongy(2012)efficientdetection,quantificationandenrichmentofsubtleallelicalterations.dnares19:423-433]的方法计算靶位点发生突变的频率。根据检测结果，在5组枚显微注射的胚胎中，均检测到靶位点的突变，最高突变率达98％。在talenmrna浓度为300ng/μl时，具有存活率74％，突变率93％的最优结果(图4，a、b、c、d代表显著性差异)。

实施例2：

选择同样的靶基因，按照实施例1中的方法，在施氏鲟(a.schrenckii)、俄罗斯鲟(a.gueldenstaedtii)、西伯利亚鲟(a.baerii)中均成功进行了胚胎显微操作。