本发明涉及分子生物学
技术领域：
：，具体涉及一种检测小麦全蚀病菌根部侵染的内参基因及其引物和应用。
背景技术：
：：小麦全蚀病是由禾顶囊壳菌小麦变种gaeumannomycesgraminisvar.tritici引起，是一种毁灭性病害，遍及世界各小麦主产区。自1870年被命名为全烛病（take-all）以来，中国最早于1931年在浙江省发现，60年代末开始蔓延，是我国的检疫性病害。近年来，由于作物耕作制度的变化、农机跨区作业、良种调运等原因，小麦全蚀病迅速蔓延，为害程度日趋加重。目前小麦全蚀病已扩展到西北、华北、华东等地成为小麦生产的重要病害。以河南省为例，1992年仅在原阳、浚县等地零星发生，到2012年已上升到800余万亩，遍及600多个乡镇，田块病株率高达70%，发病田块一般减产30～65%，部分麦田甚至绝收。小麦全蚀病菌正严重威胁着小麦安全生产。开展全蚀病菌的致病机理研究，分析小麦全蚀病菌侵染与基因表达过程，可对其引起的病害控制提供理论指导和实践意义。实时荧光定量pcr（qrt-pcr）具有简单，成本较低，灵敏度高的优势，经常用来研究基因的表达分析。而荧光定量实验需要表达稳定的内参基因作为参照。内参基因是典型的组成性基因，在稳定或是侵染阶段的细胞中，内参基因能够相对稳定表达，但是在不同的实验条件下，内参基因的表达量还是有差异的。因此确定稳定表达的内参基因对获得准确的qrt-pcr实验结果是非常重要。因此，选择合适的内参基因是利用qrt-pcr准确分析基因相对表达量的先决条件，然而在小麦全蚀病上还未见相关内参基因的报道，难以实现基因表达的校正和标准化，大大限制了qrt-pcr在小麦全蚀病检疫检测中的应用，成为业内公认亟待解决的科研难题。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种检测小麦全蚀病菌根部侵染的内参基因及其引物，即基于qrt-pcr的相对定量法在小麦全蚀病菌侵染小麦根部实验中对小麦全蚀病菌的功能基因进行定量分析所用的荧光定量内参基因及其引物。以及该内参基因及其引物在全蚀病菌的致病机理研究中的应用。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：筛选检测小麦全蚀病菌根部侵染的内参基因，内参基因包括tubβ、ef2-2和tub2；其中内参基因tubβ如序列表seqidno：1中碱基序列所示，内参基因ef2-2如序列表seqidno：2中碱基序列所示，内参基因tub2如序列表seqidno：3中碱基序列所示。设计检测小麦全蚀病菌根部侵染的荧光定量pcr引物，所述引物序列如序列表seqidno：4～9所示，内参基因对应引物序列如下：tubβ的特异性引物为：tubβ-f:tcccaacaacatccagaccgtubβ-r:tccataccctcgccagtgtaef2-2的特异性引物为：ef2-2-f:tgtcgaccgcaacaagatgaef2-2-r:ttgccctccttgtccttgtctub2的特异性引物为：tub2-f:gccgtttctcgggtcacagtub2-r:caaccgtctcattgctcag设计一种检测小麦全蚀病菌根部侵染的方法，包括以下步骤：（1）以上述内参基因中的至少一种做对照，引物为相应的序列；（2）选取小麦全蚀病菌根部侵染相关的预测功能基因，设计克隆引物；（3）qrt-pcr检测在感染的早期过程和增加感染后第7天后的内参基因和功能基因表达量。（4）比较内参基因和功能基因表达量的变化，判断该功能基因是否与小麦全蚀病菌根部侵染相关。与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：1.本发明根据长期的试验研究及经验积累，并结合理论分析和实验验证，首次从众多候选内参基因中筛选出全蚀病菌侵染小麦根部实验中表达最稳定的内参基因。2.本发明筛选出的内参基因是在长期技术积累的基础上，经过严格的内参筛选程序选出的，是全蚀病菌侵染小麦根部条件下表达最稳定的内参基因。3.本发明筛选出的内参基因适用于小麦全蚀病菌侵染小麦根部实验中小麦全蚀病菌功能基因的表达分析，能显著提高所得分析数据的准确性、可靠性，其应用广泛，操作相对简单，成本较低，灵敏度高，精确度高。附图说明图1为本发明所筛选10个候选内参基因引物的熔解曲线图；图2为genorm对表达稳定性和最佳参考基因数目的分析图；图3为本发明所筛选10个候选内参基因的ct值表达数据图；图4为以tubβ和gapdh作为内参基因时pg的定量表达图。具体实施方式下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1：基因序列信息（1）序列表中seqidno：1的信息序列特征长度：1834bp类型：核酸链型：双链拓扑结构：线形分子类型：dna特性名称：tubβ来源：小麦全蚀病菌序列描述：小麦全蚀病菌tubβ基因全长，基因编号xm_009231745；（2）序列表中seqidno：2的信息序列特征长度：3261bp类型：核酸链型：双链拓扑结构：线形分子类型：dna特性名称：ef2-2来源：小麦全蚀病菌序列描述：小麦全蚀病菌ef2-2基因全长，基因编号xm_009220540（3）序列表中seqidno：3的信息序列特征长度：1962bp类型：核酸链型：双链拓扑结构：线形分子类型：dna特性名称：tub2来源：小麦全蚀病菌序列描述：小麦全蚀病菌tub2基因全长，基因编号xm_009228181。实施例2：定量实验所用植物材料小麦全蚀病菌ggt-007是河南省农业科学院植物保护研究所实验室分离自发病的小麦根部，通过菌落特征、菌丝特征以及子囊、子囊孢子的形态特征、its序列鉴定为小麦全蚀病菌，致病性最强的1株全蚀菌分离物（全鑫、薛保国、杨丽荣等.河南省小麦全蚀病菌的分离及变种类型鉴定，2014）。在pda液体培养基中25℃、180rpm培养5天，收集菌丝用于小麦根部侵染和提取rna。侵染用小麦为郑麦366，籽粒经75%乙醇消毒处理，用无菌水冲洗三次，表面用0.1%升汞消毒，9min，然后再用无菌水冲洗5次。种子在铺有无菌滤纸的无菌培养皿（直径12cm）中发芽培养，每皿加入5毫升无菌水。两天后，根长为2cm至3cm时，幼苗移入无菌组织培培养瓶中，5mlggt菌丝体（为每100mlpda液体培养基中0.1g菌丝体）浓度。所有的植物都生长在16h光照/8h黑暗交替的22℃培养箱中。取0、1、2、3、4、5、6和7天的小麦根部样，将所有的样悬于trizol中用于rna提取。通过此方法获得了发病稳定、且一致的侵染ggt-007的小麦根部样。实施例3：模板制备（1）总rna提取：以rnaiso™plus（takara，大连，中国）说明书方法提取ggt-007及其侵染根部的总rna。取液体pda上培养的ggt-007菌丝或ggt-007侵染的根部，液氮冷冻研磨，100mg的研磨样用于提取rna；加入适量的rnaisoplus(大约1ml)；将匀浆室温放置5min，12000rpm，4℃离心5min；将上清液小心转移到新的depc处理过的1.5ml离心管中，加入1/5rnaisoplus体积量的氯仿，震荡混匀，室温下放置5min；12000rpm，4℃离心15min；将上清移至新的离心管中，加入与上清等体积的异丙醇，室温静置10min；12000rpm，4℃离心10min；向沉淀中加入1ml75%乙醇（depc处理的水配制）洗涤1次，将rna沉淀弹起，漂洗；12000rpm，4℃离心5min；弃上清保留沉淀；干燥3～5min，使乙醇完全挥发掉；沉淀用30μldepc-h2o溶解。（2）rna的检测：以1%的琼脂糖凝胶电泳初步检测rna完整性，在nanodrop-2000微量分光光度计上检测od260/280比值和浓度，检测提取rna的浓度和质量，od260/280在1.9～2.1之间为合格样品，-80度保存备用。去除基因组dna反应：按如下成分于冰上配制反应混合液，试剂使用量5×gdnaeraserbuffer2.0μl，gdnaeraser1.0μl，totalrna≤1μg，用不含rna酶的ddh2o补到10μl，42℃反应，2min，然后放置于4℃。（3）rna的反转录：反转录按primescript™rt-pcr试剂盒（takara，大连，中国）说明书方法，将上述1g总rna用于20μlggt-007全长cdna合成。通过以上实验获得了小麦全蚀病菌ggt-007及其侵染根部cdna，-20℃保存备用。实施例4：候选内参基因的筛选和引物设计本发明在长期实践研究的基础之上，并结合前人的部分研究结果，从众多相关基因中精心筛选出内参基因tub2、g6pd、gk、ef-3、ef2-2、tubβ、act和ef2-1，以及侵染小麦根部的转录组数据（yangl,xiel,xueb,etal.comparativetranscriptomeprofilingoftheearlyinfectionofwheatrootsbygaeumannomycesgraminisvar.tritici.plosone.2015）中表达差异较小的gapdh和gk基因，共10个基因作为候选的内参基因。引物设计如表1所示。tm值为60℃，产物长度为150～250bp之间，引物长度为18～22bp，gc含量为45%～55%。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。所有引物特异性由实时荧光定量pcr，2%的琼脂糖凝胶电泳检测，选择无二聚体且无非特异性扩增的引物对作为qrt-pcr的引物。表1内参基因名称，缩写，基因id和引物序列实施例5：qrt-pcr反应通过二步法普通荧光定量pcr，在steponeplus实时荧光定量pcr仪96孔板上进行，反应总体系包括：sybrpremixextaqtmⅱ（tlirnasehplus）（takara,cat.no.rr820a）12.5μl；上下游引物（10µmol/l）各1μl；cdna模板（20ng/µl）1μl；用ddh2o补齐至25μl。扩增条件：95℃30s；95℃5s，56～60℃退火30s，并收集荧光，40个循环，60℃～95℃每隔0.5℃停留0.05s生成熔解曲线。每个样品3次重复。利用qrt-pcr检测定量分析引物，熔解曲线为单峰时可用于后续分析。为了验证10个候选内参基因的引物特异性，用以上二步法pcr反应的产物经2%琼脂糖凝胶电泳进行检测显示，每种引物均扩增出预期大小的片段，没有出现引物二聚体，说明引物的特异性较好。如图1所示，通过qrt-pcr，10个候选内参基因引物的熔解曲线，都只出现单一的信号峰，说明没有引物二聚体和非特异性条带产生。实施例6：候选内参基因引物扩增效率及特异性分析对于每一对引物，ggt-007cdna5倍系列稀释建立标准曲线计算基因特异性pcr效率。从标准曲线中获得相关系数（r2）和斜率值。参考文献radonića,thulkes,mackayim,etal.guidelinetoreferencegeneselectionforquantitativereal-timepcr.biochembiophysrescommun.2004，用于计算荧光定量pcr效率的公式如下：通过梯度稀释cdna样本作为模板进行pcr扩增后绘制每个内参基因的标准曲线，得到引物进行qrt-pcr的相关参数，如表2所示。从表2中可以看到10个内参基因的线性相关系数（r2）变化范围为0.996。pcr反应的扩增效率（e）从gapdh的103.7到ef-3的119.82。相关系数（r2）从tub2的0.9853到ef-3的0.9999不等。表2小麦全蚀病菌10个候选内参基因的扩增效率与线性相关系数实施例7：候选内参基因表达稳定性分析利用三个基于excel的软件genorm（vandesompelej,preterdk,pattynf,poppeb,etal.accuratenormalizationofreal-timequantitativert-pcrdatabygeometricaveragingofmultipleinternalcontrolgenes.2002）、normfinder（pfafflmw,tichopada,prgometc,neuvianstp.determinationofstablehousekeepinggenes,differentiallyregulatedtargetgenesandsampleintegrity:bestkeeper–excel-basedtoolusingpair-wisecorrelations.2004）和bestkeeper（andersencl,jensenjl,ørntofttf.normalizationofreal-timequantitativereversetranscription-pcrdata:amodel-basedvarianceestimationapproachtoidentifygenessuitedfornormalization,appliedtobladderandcoloncancerdatasets.2004）对所有候选基因的表达稳定性进行分析。genorm是基于所有的测试基因成对变异平均值来计算表达稳定值。normfinder是根据基因内部和基因之间的表达变化对基因表达的稳定性进行排序。bestkeeper是用标准差（sd）和方差比例（cv）来作为指标来评价表达稳定性。候选参考基因的表达稳定性由三个不同的软件方案分析结果如下：（1）genorm分析：基因表达稳定性测量m值与m值呈负相关，由genorm软件的allthe检验内参基因之间的成对变异系数来计算。最稳定的内参基因具有最低的m值。所有的内参基因都可以被认为是稳定的，因为它的m值小于genorm阈值1.5。在ggt-007侵染小麦根部过程中，tubβ、ef2-2和tub2的m值最低的，表明是最高稳定表达的（0.028和0.03）。而gapdh的稳定性最低（m值=0.051），其余6个基因处于中间位置。该软件还可计算引入1个新的内参基因后标准化因子的配对变异v值，并根据vn/vn+1值来确定所需最适内参基因的数目。默认的v值为0.15（该值可以人为稍作调整），如果vn/vn+1值<0.15，则最适内参基因的数量是n个；而如果vn/vn+1值>0.15，则最适内参基因的数量是n+1个。由genorm计算两个序列归一化因子nfn和nfn+1之间的变异（vn/vn+1）。如图2中b所示，分析结果表明，所有的变异均小于推荐阈值（0.15）。因此，参考基因足以使整个侵染期的基因表达正常化。（2）normfinder分析：该程序计算原理与genorm程序相似，也是先获得内参基因表达稳定值，再根据稳定值大小来筛选出最合适的内参基因，判定标准为表达稳定值最小的内参基因为最合适的内参基因。normfinder程序不但可以比较候选内参基因的表达差异，还可以计算样品组间的变异。那些表现较低的平均稳定性值被认为是更稳定的表达基因。稳定性值如表3所示。tubβ、ef2-2和tub2被认为是最稳定的内参基因。表3normfinder的候选参考基因表达稳定性分析（3）bestkeeper分析：bestkeeper用于根据相关系数（r）对候选基因进行排序，通过计算ct设置标准偏差（sd）和方差系数（cv）来对其进行排序。如表4所示，分析结果表明，排在前3位的相关性系数获得为tubβ、ef2-2和tub2。而ef3（0.891）的最低相关系数为0.003。表4bestkeeper分析结果如图3所示，通过候选内参基因的表达水平分析稳定性，根据平均周期阈值（ct）值，在ggt-007感染小麦根部过程中，内参基因的转录水平存在明显差异。并从ct值中得到各基因的ct范围和方差系数。如预期，平均ct值从gapdh的20.56变化到gk基因的25.77，而且大多数都高度表达（从20到25）。其中gapdh是最高表达的内参基因，而gk基因是最小的。根据变异系数（cv），显示出参考基因的表达稳定性，ef-3的变异最小，cv值为4.17%，gapdh的变化最大，cv值为7.43%。根据长期实践经验并综合以上3种软件分析结果，本发明最终确定tubβ、ef2-2和tub2为最稳定的内参基因，可用于小麦全蚀病菌侵染小麦根部的功能基因的定量表达检测。实施例8：内参基因表达稳定性验证参考文献kangzs,huangll,buchenauerh.cytochemistryofcellwallcomponentalterationonwheatrootsinfectedbygaumonomycesgraminisvartritici–inifiziertenweizenwurzeln.2000和valette-colleto,cimermana,reignaultp,etal.disruptionofbotrytiscinereapectinmethylesterasegenebcpme1reducesvirulenceonseveralhostplants.2003.。选取ggtg_09200codeexopolygalacturonase（pg），植物细胞壁降解酶(pcwdes)。pcwdes可导致植物组织、细胞壁和细胞质渗漏的损伤，在植物病原真菌感染过程中，其发挥着重要作用，该酶可将果胶和半纤维素降解为营养物质，或通过削弱壁以使根内的菌丝生长。以最合适的内参基因tubβ和最不适的gapdh内参基因作为qrt-pcr时pg基因的内参基因。结果如图4所示，以tubβ做内参基因，qrt-pcr检测在感染的早期过程和增加感染后第7天pg低表达，这与转录组测序的结果是一致的。而用内参基因gapdh用于归一化时，在感染初期pg基因表达高水平，与转录组数据不相符。该结果进一步验证了tubβ作为内参基因是最适合小麦全蚀病菌侵染小麦根部阶段功能基因的定量表达分析。上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属
技术领域：
：的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。sequencelisting<110>河南省农业科学院植物保护研究所<120>检测小麦全蚀病菌根部侵染的内参基因及其引物和应用<130>2017<160>23<170>patentinversion3.2<210>1<211>1834<212>dna<213>gaeumannomycesgraminisvar.triticiggt-007<400>1gcaaccgcaaacaaccacaaccacaaccacaaccacaaccacatctctgctcgctctccc60atccaacgtccttttccgcctcgctccatcattgcaatcacaaacacccaccagctcaca120cccagacagtagccaaaatgcgcgagattgtccacctccagaccggccagtgcggtaacc180aaatcggtgctgccttctggcagaccatttctagcgagcacggtctcgacagcaatggcg240tgtacaacggcacctcggagctccagctcgagcgcatgagtgtctacttcaacgaggcct300ccggcaacaagcatgtcccccgtgccgtcctcgtcgatctcgagcccggcaccatggacg360ccgtacgcgccggtcccttcggccagctgttccgccccgacaacttcgttttcggccagt420ctggtgctggcaacaactgggccaagggtcactacaccgagggtgctgagctggtcgacc480aggttcttgatgtcgtccgccgcgaggctgagggctgcgactgcctgcagggtttccaga540tcacccactctctaggtggtggtaccggtgccggtatgggtaccctcctgatttccaaga600tccgcgaggagttccccgaccgcatgatggccaccttctcggtcgtgccctcgcccaagg660tctcggacactgtcgtcgagccctacaatgccaccctctcggtccaccagctggtcgaga720actcggacgagaccttctgcatcgacaacgaggctctgtacgacatctgcatgcgcaccc780tgaagctgtcgaacccctcgtacggcgacctgaactacctcgtctcggccgtcatgtcgg840gcgtcaccacctgcctgcgtttccccggtcagctgaactctgacctgcgtaagcttgccg900tcaacatggttcccttcccccgtctgcacttcttcatggtcggcttcgctcccctgacta960gccgcggcgcccactcattccgcgccgtcacggtgcccgagttgacccagcagatgttcg1020accccaagaacatgatggctgcctcggacttccgcaacggtcgctacctgacctgctctg1080ctattttccgtggtaaggtctccatgaaggaggtcgaggaccagatgcgcaacatccaga1140acaagaactcgtcgtacttcgtcgagtggattcccaacaacatccagaccgccctctgct1200caatccctccccggggcctgaagatgtcgtcgaccttcatcggaaactcgactgccatac1260aagagctcttcaagcgtgttggtgagcagttcactgccatgttcaggcgcaaggctttcc1320ttcattggtacactggcgagggtatggacgagatggagttcactgaggccgagtccaaca1380tgaacgatctggtctcggagtaccagcagtaccaggatgctggcgtcgacgaggaggagg1440agtacgaggaggacgaggctcctcttgaggccgaggagtaaacggccgcctgattgcttc1500tttgcagctcctcgcgtctccggtcatgggatagcacttacggagtagatttacctggca1560tatgtcgctctttgggaagtcattaaggcttggtgtgtcgaaactacttgttggtcacag1620gatctgggggggttggtgcccaactggcctagactctaatacgggccagttggtggttac1680tgaagccatggctggttgagggaagagaagggcaacgtgccttggacacggttgttcctg1740ttttgattgcagttggcccttttacattagccacttttattgtgcagaaaatcagagata1800ttctcttctgtggtcaatacatgtattgtccctg1834<210>2<211>3261<212>dna<213>gaeumannomycesgraminisvar.triticiggt-007<400>2tgagtgttgtgcacctttccaatccccgtttttcttttcatcatccaacccgtgtggtgt60atatattggcctccccacgccggcttgcctgctgtgtacgtcggctccatttgcgtgctt120gttatcggctagctctaagaggcaaaaggcagcttggtgttgaagacaggaacgagactg180cgacctgccctccctcaacgtcgagacgagtcgccactttattttccatttttgtcagca240gaggagaaaaaagcaaagcgggacggtcctgctgcaaccccgccgcggcgcaactctgct300ctggataataaaaatttctcccacttgggtgccccgctccgcaacctgttccctctctcc360tctttacactcgccaaaccaccgagaaaccattttaggagctggtcgtcgagcgactaca420aacccgccaaaatggtgaatcacgattgacgagatccgggcgcttatggacaagcctagc480aatgtccgtaacatgtccgtcatcgcccacgtcgaccacggcaagtcgaccctcaccgat540tccctgctggccaaggcgggtatcatctccaccgcgaaggcaggagaccagcgtgcgacc600gacacgcgtgcagacgagcaggagcgcggtatcaccatcaagtctaccgccatctctctg660tacggtaacctgccctccgaggacgacctgaaggacattgttggccagaaggttgacggc720aacaacttcctgatcaaccttatcgactcgcccggtcacgttgatttctcctccgaggtt780accgccgctctccgtgtcactgatggtgccctggtggttgtcgacactgtcgagggtgtc840tgcgtgcagaccgagaccgtgctgcgccaggcccttggtgaacgcatcaagcccgtcatc900atcatcaacaaggtcgaccgtgccctgctcgagctgcaggtcgagaaggaggacctgtac960cagtccttctcgcgtaccatcgagtcggtcaacgtcatcatctccacctacctggacaag1020tcgctgggtgacctccaggtttaccccgacaagggtaccgttgccttcggttccggtctg1080cacggctgggccttcaccatccgccagttcgctgtccgctacgccaagaagtttggtgtc1140gaccgcaacaagatgatggagcgtctttggggcgacaactacttcaacccccacaccaag1200aagtggaccaacaagtctactcacgagggcaagcagcttgagcgtgcctttaaccagttc1260atcctggaccccattttccgcatcttcgcggccgttatgaacttcaagaaggacgaggtc1320gccgcccttctcgagaagctcaacctcaagctcgccgtcgaggacaaggacaaggagggc1380aagcagctgctcaaggctgtcatgcgcactttcctgcccgctgccgactctctgctggag1440atgatgattctccacctcccctcgcccatcacggcccagaggtaccgtgtcgagtccctg1500tacgagggtcccccggatgacgaggctgccattgccatccgtgactgcgaccccaagggc1560cccctcatgctttacgtctccaagatggtgccgacctcagacaagggccgcttctacgcc1620ttcggtcgtgttttctcgggtaccgtccgctcgggcctgaaggtccgcatccagggcccc1680aactaccagcccggcaagaaggaggaccttttcatcaaggccgtccagcgtaccgtgctc1740atgatgggcggcaaggtcgagcccatcgacgacatgcccgccggcaacattgtcggcctg1800gtcggtatcgaccagttcctgctcaagtcgggtaccctgaccaccagcgagactgcccac1860aacctcaaggtcatgaagttctccgtctcgcccgtcgtgcagcagggtgttcaggtcaag1920aatgcccaggatctgcccaagctggtcgagggtctgaagcgcctgtccaagtcggacccc1980tgcgtcctgaccttcacctcgccctcgggtgagcacatcgttgccggtgccggtgagctg2040catctggagatttgcctgaaggatctcgaggaggaccacgccggtgtgcccctcatcatc2100tcggaccctgtcgtccagtaccgtgagaccgtccaggccaagtcgagcatgactgccctg2160tccaagtcgcccaacaagcacaaccgtctttacatggttgctgagcccctgggcgaggag2220ctggccggcctgatcgacgacggcaagatcaccccccgtgacgacttcaaggctcgtgcc2280cgtatcctggccgacgagcacggctgggatgtcaccgatgctcgcaagatctggactttc2340ggccccgacaccaacggccccaacctgctggtcgaccagaccaaggccgtgcagtacctc2400aacgaaatcaaggactccgtcgtctccggtttccagtgggcctcgcgcgagggtgtcatc2460gccgaggagcccatgcgcggtatccgcttcaacattctcgatgttaccctgcacgccgat2520gccatccaccgtggcgccggtcagctgatgcccaccacccgccgtgtcctgtacgcctct2580gccctgctggccgagcccgccatcctggagcccgtcttcctggtcgagatccaggtcccc2640gagcaggccatgggtggctgctacggtgtcctcacccgccgtcgtggtcacgtcttcgcc2700gaggagcagcgccccggcactcctctcttcaccatcaaggcttacctccccgtcctcgag2760tctttcggcttcaacgccgatttgcgtgccggtacctctggccaggccttccctcagtcc2820gttttcgaccactggcaggtcctgcccggtggctcgcctctggactccaccaccaagacc2880ggacaggttgtccagggcacccgcaagcggaagggtctcaagcccgaggttcccggtgtc2940gagaactactacgacaagctataaacggctcttggtggcgatggttgacgacactctcga3000tgctctctacagcctcgctcgtcggatagctctattattgaccatatatggtcaaggccc3060tgcttctctattgtgacgagcggatgcgaaaaaaagcacattcgactttatgtctcagtg3120cgggccgccaacccgattggaggatggcgggtggaatatgagctatgaagcgcgggcacg3180tcggcactgacgttcactagatacggtctgcttgccatgtagaaatcttttattgcgttt3240tgatcactttgcctgtttccg3261<210>3<211>1962<212>dna<213>gaeumannomycesgraminisvar.triticiggt-007<400>3acgtgctcccatccggacaacttcatcccattccaacaaacacccgaaccgctcgcaagg60tccaggtgaagaacgccccgacccaatcccgcttctcgtggagaacggatatttttgcgg120ctcctctttgctcgtgcagtgcctagcaagtgttaccatttctagcttctaactttctca180atcgacttgagacaacttcctgcagcttccaacaccatgaaaggcgaagtccttcatctt240catctcggccaggctggtacccagctgggaaacagtgcttgggaactttaccttcttgag300cacgggcttggtcacgacggcaagccggacccgaatgcgaaggacatcgcggagggcggt360tcattcgagaccttcttcaccgagaccagcggtggcaaatacgttccccgctctctcttc420gtcgacctggacccgtcacccatcgacgagattcggaccggtggctatcgccagcttttc480caccccgagcttctgatcagcggcaaggaggatgcagccaacaactatgctcgtggtcac540tacacgatcggcaaggagatggtcgacaatgtcatcgagcgcattcgacgtgttgccgac600aactgcaactctctccagggcttcttgatattccattccttcggtggcggtaccggttcc660ggcttcggtgccctactgcttgagcgtctgtctaccgagtacgggaaaaagtcgaagcta720gaattcgcagtttatccggccccacgcgtttcgacggctgtcgttgagccctacaacgct780gtgctctccacccacagcaccatcgagaactcggattgtaccttcctggtcgataacgag840gctgtctatgacatttgccgccggaacctcgacatcccgcgtcccagctacgagcatctc900aaccgtctcattgctcaggtcgtcagctccatcacctcctccctgcgcttcgacggagcg960ctcaacgtcgatctgaacgaattccagaccaacctggttccttacccacgtatccactac1020ccgctgatcagctacgctccggtcatatctgccaccaagagtgcccatgagagcttcaag1080gtccatgatctgacattccaatgtttcgagcctaacaaccagatggttgtctgtgacccg1140agaaacggcaagtacatggctgtggctctgctgtaccgtggcgacgtggtcccgcgtgac1200tgcaacgcggcggttgctgcgctgaaggccaaggcttccttcaacctcgtcgagtggtgc1260cctacaggtttcaagattggcatcaactaccagaagccggtggctgttccgtcggccacc1320cccgctgacggcgcccttgcaagcgttgaccggtccgtgtccatgctgtccaacaccaca1380gctattgctgaggcttggtcccgtctggaccacaaattcgatctgatgtacagcaagcgc1440gccttcgtccactggtacgttggcgagggcatggaggagggcgagtttagcgaggcccgg1500gaggatcttgcagctctggagaaggactacgaagaggtcgctgcggactcgtcgttcgag1560cctgaggagggtgaggccgagtactaggcttgacatgcggtcccgtccggctggacccca1620ggatgcgcgcatcatggttccgtggtgtatgtggacaactatgagaagcaggtctgactt1680ctgttgcacgctgagagaagtgctttttgtttgattggtttgttccataaccgaggtttg1740gacttggacttggttttgcgctgggtgtggtaacttgtggacaatcaacccactaagctg1800aatgagcaggtgccccggttgagattctggcgaacctacagctagagctagtgtatgtca1860tatgtaactacctctattccctcgcctccccatctagaattcttcagtacctggccgtgt1920ctattccgtccacctcgatacttcgttctagggtttgaccac1962<210>4<211>20<212>dna<213>人工合成<400>4tcccaacaacatccagaccg20<210>5<211>20<212>dna<213>人工合成<400>5tccataccctcgccagtgta20<210>6<211>20<212>dna<213>人工合成<400>6tgtcgaccgcaacaagatga20<210>7<211>20<212>dna<213>人工合成<400>7ttgccctccttgtccttgtc20<210>8<211>19<212>dna<213>人工合成<400>8gccgtttctcgggtcacag19<210>9<211>19<212>dna<213>人工合成<400>9caaccgtctcattgctcag19<210>10<211>20<212>dna<213>人工合成<400>10cgtgatgggtgtcaacgaga20<210>11<211>20<212>dna<213>人工合成<400>11gctgctggggatgatgttct20<210>12<211>20<212>dna<213>人工合成<400>12gtcgggcatcttcaaggaca20<210>13<211>20<212>dna<213>人工合成<400>13tcgtctcgcacaaagttgga20<210>14<211>20<212>dna<213>人工合成<400>14cttgaacacgggcgtcaaag20<210>15<211>20<212>dna<213>人工合成<400>15acaccctgaagttagtgccg20<210>16<211>20<212>dna<213>人工合成<400>16ggaggccaaggttgatgtca20<210>17<211>20<212>dna<213>人工合成<400>17agcagcagaatatcgggagc20<210>18<211>20<212>dna<213>人工合成<400>18gtgacgaactgggacgacat20<210>19<211>20<212>dna<213>人工合成<400>19ggcgttgaaggtctcgaaga20<210>20<211>20<212>dna<213>人工合成<400>20catcaagcgcatgtcttccg20<210>21<211>20<212>dna<213>人工合成<400>21ggtcgaccgtgttcttccat20<210>22<211>20<212>dna<213>人工合成<400>22tcgacgactttcagctgcac20<210>23<211>20<212>dna<213>人工合成<400>23ccggcaaactcattccacca20当前第1页12当前第1页12