本发明属于基因测序领域，更具体地涉及新生儿50种遗传病基因检测探针组及筛查方法。
背景技术：
东莞市每年约有16万名新生儿出生，据统计出生缺陷发生率一直在2.6％左右，预计每年出生的缺陷儿在4000人左右。出生缺陷发生原因比较复杂，其中遗传病是主要原因之一，对于遗传导致出生缺陷，能通过新生儿筛查遗传性相关基因，实现早发现、早诊断、早治疗的目的，从而大幅度提高患者的生存质量、大大降低家庭和社会负担。
实现筛查的关键一方面需要满足大样本通量的要求，另一方面需要满足多检测位点或基因的要求，因此，高通量测序技术非常适用于遗传病筛查，可以有效扩大筛查覆盖率和检出率，准确分析遗传方式，预测再发风险，并且为用药提供指导。新生儿常见的遗传病很多，如苯丙酮尿症、酪氨酸血症、枫糖尿病、克拉伯病、结节性硬化症等等，这些遗传病往往与一个或多个基因突变相关，通过检测新生儿遗传病相关基因信息，分析其突变信息可实现筛查目的。探针杂交是基因捕获常用的技术之一，杂交探针是一小段dna片段(十几到几百个碱基),用于捕获与其互补的目标序列。目前基于探针捕获的高通量测序已有应用于临床，通量大，费用更低，结果更可靠。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供新生儿50种遗传病基因检测探针组及筛查方法。
本发明的技术方案是：
一种新生儿遗传病基因检测探针组，所述探针组依据1347个捕获区域设计获得，所述捕获区域如表2所示。
一种新生儿遗传病基因筛查试剂盒，所述试剂盒含有上述新生儿遗传病基因检测探针组。
一种检测新生儿遗传病基因的测序文库构建方法，包括如下步骤：
(1)样品采集与提取：收集待测样品，提取基因组dna；
(2)dna片段化：将基因组dna超声打断至100～500bp的dna片段；
(3)末端修复与接头连接：对dna片段进行末端修复及测序接头连接；产物进行纯化；
(4)杂交前扩增：将上一步纯化产物进行pcr扩增富集、纯化，获得用于杂交捕获的dna文库；
(5)第一次探针捕获：将dna文库进行杂交前封闭，采用上述检测探针组进行杂交捕获；
(6)目标区域富集：将第一次探针捕获产物洗脱，获得捕获的靶序列，将捕获的靶序列进行pcr扩增，获得富集的靶序列；
(7)第二次探针捕获与目标区域富集：将富集的靶序列作为第一次探针捕获步骤中的dna文库，再进行一次探针捕获及目标区域富集，对第二次富集的靶序列进行纯化，获得待测序产物；
(8)将待测序产物进行二代测序，采用生物信息学分析测序结果。
作为上述测序文库构建方法的优选，所述步骤(1)中，待测样品品选自血斑、血液、肌肉组织。
作为上述测序文库构建方法的优选，所述步骤(3)和所述步骤(4)中，纯化为磁珠纯化，如实施例所用的agencourtampurexpkit。
作为上述测序文库构建方法的优选，所述步骤(4)中，pcr扩增富集的体系为：纯化产物40μl、接头引物10μl、nebnexthigh-fidelity2xpcrmastermix50μl；反应条件为：98℃预变性30s；循环5次(98℃变性10s；58℃退火30s；72℃延伸30s)；72℃延伸5min。
作为上述测序文库构建方法的优选，所述步骤(6)中，pcr扩增的体系为：捕获的靶序列33.5μl、5×herculaseⅱreactionbuffer10μl、dntpmix(25mmeach)0.5μl、接头引物5μl、herculaseⅱfusiondnapolymerasel1μl；反应条件为：98℃预变性2min；循环5次(98℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸1min)；72℃延伸5min。
其中，接头引物为适应测序平台接头的选择，如实施例中的接头引物是针对iontorrent测序平台的a和p接头的接头引物。
作为上述测序文库构建方法的优选，所述步骤(6)中，洗脱采用invitrogen公司的dynabeadsmyonestreptavidint1。
作为上述测序文库构建方法的优选，所述步骤(3)中，末端修复与接头连接采用nebnextfastdnalibraryprepsetforiontorrent试剂盒。
作为上述测序文库构建方法的优选，所述步骤(8)中，二代测序采用半导体测序。
本发明的有益效果：
本发明针对新生儿50种遗传病104种基因，并结合靶序列液相杂交捕获技术和半导体测序技术，设计了1347个探针捕获区域(如表2所示)，基于所提供的探针捕获区域可根据常规方法设计获得相应的探针，实现新生儿50种遗传病有效筛查，其具有准确率高，特异性好，通量大的优势，拥有广阔的应用前景。
具体实施方式
发明人结合靶序列液相杂交捕获技术和半导体测序技术，设计了一组新生儿50种遗传病基因检测探针，并提供了新生儿遗传病筛查方法。
实施例1、新生儿50种遗传病基因检测探针组
发明人经过查阅大量新生儿遗传病致病基因相关文献及数据库，获得了新生儿50种遗传病及其相关基因(详见表1)，通过高通量的实验筛选及相关实验验证，最终优选出1347个探针捕获区域(捕获区域见表2所示)，针对探针捕获区域的探针联合使用可用于检测新生儿50种遗传病致病基因；针对所设计的探针捕获区域的探针特异性强、灵敏度高，对新生儿遗传病致病基因缺失、重复、点突变的情况均能进行有效的检测。
表1、新生儿50种遗传病及其相关致病基因
表2、50种新生儿遗传病对应104个致病基因的捕获区域
实施例2、新生儿50种遗传病致病基因捕获和测序方法
(1)样品采集与提取：以东莞市第八人民医院提供的6例经临床确诊为新生儿遗传病的患者外周血为例，分别采用qiaampdnabloodminikit进行基因组dna提取；
(2)dna片段化：将基因组dna超声打断至100～500bp的dna片段；
(3)末端修复与接头连接：使用nebnextfastdnalibraryprepsetforiontorrent试剂盒对dna片段进行末端修复及测序接头连接；产物用agencourtampurexpkit纯化；
(4)杂交前扩增：将上一步纯化产物进行pcr扩增富集，pcr体系为：纯化产物40μl、接头引物10μl、nebnexthigh-fidelity2xpcrmastermix50μl；反应条件为：98℃预变性30s；循环5次(98℃变性10s；58℃退火30s；72℃延伸30s)；72℃延伸5min；pcr扩增产物用agencourtampurexpkit进行纯化，获得用于杂交捕获的dna文库；
(5)第一次探针捕获：使用sureselecttereagentkit,ptn,16(agilent)试剂盒，按说明书操作，将dna文库进行杂交前封闭，获得已封闭的dna文库；再将实施例1针对探针捕获区域的探针配制成探针混合液；与已封闭的dna文库进行17小时的杂交捕获；
(6)目标区域富集：将第一次探针捕获产物使用dynabeadsmyonestreptavidint1(invitrogen)进行洗脱，获得捕获的靶序列，将捕获的靶序列进行pcr扩增，获得富集的靶序列，pcr扩增体系为：捕获的靶序列33.5μl、5×herculaseⅱreactionbuffer10μl、dntpmix(25mmeach)0.5μl、引物5μl、herculaseⅱfusiondnapolymerasel1μl；反应条件为：98℃预变性2min；循环5次(98℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸1min)；72℃延伸5min；
(7)第二次探针捕获与目标区域富集：将富集的靶序列作为第一次探针捕获步骤中的dna文库，再进行一次探针捕获及目标区域富集，第二次富集的靶序列用agencourtampurexpkit进行纯化，获得待测序产物；
(8)将待测序产物用iontorrent平台测序，采用生物信息学分析测序结果。
本实施例中，基因组dna提取浓度及dna文库浓度用qubit定量，结果如表3所示。
表3、基因组dna提取浓度及dna文库浓度
本实施例中，待测序产物的qubit定量和qpcr定量结果如表4所示。
表4、测序产物的qubit定量和qpcr定量浓度
本实施例中，6份样本的新生儿50种遗传病的筛查结果，如表5所示。
表5、6份样本的新生儿50种遗传病的筛查结果
综上，根据本发明的探针捕获区域(如表2所示)设计相应的探针，即可实现新生儿50种遗传病的筛查。
以上所述仅为本发明的实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内。