本发明属于生物化工技术领域，具体提供了一种发酵制备提取医药级缬氨酸的方法。
背景技术：
缬氨酸化学名称为2-氨基3-甲基丁酸，分子式为c5h11no2，相对分子质量为117.15。缬氨酸是人体八种必需氨基酸之一，具有多种生理功能，在人类生命体内代谢调控和信息传递等许多方面扮演着重要角色。在医药领域，缬氨酸主要用于配置氨基酸输液，可以治疗血脑屏障、慢性肝硬化、肝昏迷、肾功能衰竭、先天性代谢缺陷和糖尿病等。缬氨酸可与异亮氨酸和亮氨酸一起工作促进身体正常生长，修复组织，调节血糖。
缬氨酸的生产方法有提取法、化学合成法和生物发酵法三种。提取法主要是将大豆蛋白等进行水解，然后加入盐酸以生成并沉淀出缬氨酸-盐酸盐晶体。该法分离效果好，提取操作简单，生产周期短，但是缬氨酸的收率较低，导致生产成本居高不下。化学合成法具有多种合成方式，但是反应步骤多，反应过程复杂，副产物较多，导致生产成本较高，难以嫁接于工业化规模生产。生物发酵法则是利用缬氨酸生产菌发酵生产产品，具有原料成本低、反应条件温和等优点，易于实现大规模生产，是一种非常经济的生产方法。
缬氨酸发酵液中成分复杂，不仅含有目标产品缬氨酸，而且含有色素、蛋白质、多糖、还原糖和亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸等杂酸。目前，缬氨酸的提取方法主要有沉淀法、全膜法和离子交换法。发明专利201210260549.5提及一种利用膜分离与电渗析组合技术提取缬氨酸的方法，该方法将除去菌体的发酵液通过电渗析装置去除无机盐，在经除蛋白、色素、反渗透预浓缩、浓缩结晶等步骤获得缬氨酸成品。发明专利200710190536.4则涉及利用模拟移动床技术，以水作为洗脱剂从缬氨酸发酵液中提取制备高纯度缬氨酸。上述方法有些难以制备出医药级纯度的缬氨酸，有些则难以实现工业化规模。因此，探索一种制各医药级纯度缬氨酸的提取方法，对解决氨基酸提取领域的关键问题具有重大意义。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种发酵制备提取医药级缬氨酸的方法。本发明通过生物发酵法制备得到缬氨酸发酵液，然后通过全膜法获得缬氨酸粗品，再经酸溶、水溶、离子交换、脱色、精滤等工艺处理，可以有效去除杂酸，获得医药级缬氨酸。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种发酵制备提取医药级缬氨酸的方法，其包括如下步骤：步骤1)发酵工序，步骤2)超滤和浓缩制备缬氨酸粗品，步骤3)酸溶、结晶以及离心，步骤4)水溶、离子交换、脱色、精滤以及结晶。
具体地，所述方法包括如下步骤：
步骤1)发酵工序：
(1)将乳酸发酵短杆菌按照6-8％的接种量接入发酵培养基中，连续发酵50-55小时，得到缬氨酸发酵液；发酵过程中的温度控制在30℃，ph控制在6.5，控制葡萄糖浓度不低于10g/l；
(2)利用陶瓷膜过滤缬氨酸发酵液得到滤液a和湿菌体；往湿菌体中添加1-3wt％电气石粉，100rpm搅拌30min，然后停止搅拌，加热至50-55℃，保温60-90s，自然冷却至室温，然后添加到三倍重量的透析培养基中，培养温度为30℃，100rpm搅拌培养4-6h，陶瓷膜过滤收集菌体和滤液b；
步骤2)超滤和浓缩制备缬氨酸粗品：合并步骤1)所得滤液a和滤液b，通过超滤膜进行超滤，收集超滤液，将超滤液通过真空浓缩至缬氨酸含量为30wt％，降温结晶，离心得到缬氨酸粗品；
步骤3)酸溶、结晶以及离心：采用1.0-1.5倍体积的7mol/l盐酸对缬氨酸粗品进行一次酸溶，再经降温结晶、离心，获得缬氨酸固体a和母液；采用0.5-0.8倍体积的1mol/l盐酸对缬氨酸固体a进行二次酸溶，再经降温结晶、离心，再次获得缬氨酸固体b和母液；
步骤4)水溶、离子交换、脱色、精滤以及结晶：采用8-10倍体积的蒸馏水对缬氨酸固体b进行水溶后，经离子交换、脱色、精滤、结晶获得医药级缬氨酸。
优选地，
所述发酵培养基的组分为：葡萄糖50g/l、玉米浆30g/l、豆粕10g/l、乳糖10g/l、硫酸铵6g/l、磷酸二氢钾0.1g/l、硫酸镁0.1g/l、硫酸锰6mg/l、硫酸亚铁6mg/l、氯化钾6mg/l。
优选地，
所述透析培养基的组分为：磷酸二氢钾0.8％，磷酸氢二钾0.8％，硫酸铵0.5％，聚乙二醇0.08％，硫酸亚铁0.01％，硫酸镁0.01％，硫酸锌0.01％，调整ph为6.5，以上为质量比。
优选地，
所述陶瓷膜的膜孔径40-50nm。
优选地，
所述超滤参数为：温度为40℃，进压为7-8bar，出压为6-7bar。
优选地，
所述步骤4)具体包括如下步骤：
(1)采用8-10倍体积的蒸馏水对缬氨酸固体b进行水溶后，调节水溶后的液体ph值为4.5，通入强酸性离子交换树脂中，采用2％氨水进行解析，得到洗脱液；
(2)采用单效蒸发器对洗脱液进行浓缩脱氨，添加1.8-3‰的活性炭脱色45min，调节脱色后料液ph值为6.0，除去活性炭；
(3)调节除活性炭后料液ph值为6.0，采用0.2μm滤芯进行精滤处理，精滤液经浓缩、结晶、离心、干燥、粉碎制得成品。
本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
本发明针对发酵工序的进行改进，避免缬氨酸浓度积累到引起反馈抑制，针对发酵后的废弃菌体进行二次产酸处理，增加了细胞膜的通透性，提高了菌株的产酸能力；
适当时间和温度的热处理可以提高菌株的产酸能力以及细胞膜通透性，配合透析培养基，使得缬氨酸的产率大大提高；
电气石能够自动释放负离子，负离子具有较强的氧化性，还持续发生直流静电，释放矿物质和微量元素，对菌株繁殖起促进作用；本发明采用透析培养基对菌株进行培养，能改变细胞的生物膜结构，促进物质的利用和转运，同时使得缬氨酸积累引起的反馈抑制调节大大降低，产酸效率提高，而且后续的残糖少，不会造成菌株黏着絮凝成团，有利用后续的膜过滤分离；
发酵完成后首先采用分离技术，去除产生抑制作用的物质，由于抑制作用解除，细胞酶活得到恢复，从而进行二次透析发酵，相比普通发酵而言，整个发酵过程产酸周期大大延长；
本发明通过生物发酵法制备得到缬氨酸发酵液，然后通过全膜法获得缬氨酸粗品，再经酸溶、水溶、离子交换、脱色、精滤等工艺处理，可以有效去除杂酸，获得医药级缬氨酸，纯度可达到99.9％以上，应用前景广阔。
说明书附图
图1：热处理温度对滤液b中缬氨酸的含量的影响。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种发酵制备提取医药级缬氨酸的方法，其包括如下步骤：
将乳酸发酵短杆菌atcc1470种子液(1×108cfu/ml)按照7％的接种量接入发酵培养基中，连续发酵55小时，得到缬氨酸发酵液；发酵过程中的温度控制在30℃，ph控制在6.5，控制葡萄糖浓度不低于20g/l；
所述发酵培养基的组分为：葡萄糖50g/l、玉米浆30g/l、豆粕10g/l、乳糖10g/l、硫酸铵6g/l、磷酸二氢钾0.1g/l、硫酸镁0.1g/l、硫酸锰6mg/l、硫酸亚铁6mg/l、氯化钾6mg/l；
利用陶瓷膜过滤缬氨酸发酵液得到滤液a(缬氨酸含量为4.9％)和湿菌体；往湿菌体中添加3wt％电气石粉，100rpm搅拌30min，然后停止搅拌，加热至51℃，保温60s，自然冷却至室温，然后添加到三倍重量的透析培养基中，培养温度30℃，100rpm搅拌培养5h，陶瓷膜过滤收集菌体和滤液b；所述透析培养基为(质量百分比)：磷酸二氢钾0.8％，磷酸氢二钾0.8％，硫酸铵0.5％，聚乙二醇0.08％，硫酸亚铁0.01％，硫酸镁0.01％，硫酸锌0.01％，调整ph为6.5；所述陶瓷膜的膜孔径40nm；
2)合并滤液a和滤液b，通过超滤过滤，收集超滤液，超滤操作温度为40℃，进压为7-8bar，出压为6-7bar；将超滤液通过真空浓缩至缬氨酸含量为30wt％，然后降至室温，离心得到缬氨酸粗品；
3)采用1.2倍体积的7mol/l盐酸对缬氨酸粗品进行一次酸溶，再经降温结晶、离心，获得缬氨酸固体a和母液；采用0.8倍体积的1mol/l盐酸对上述缬氨酸固体a进行二次酸溶，再经降温结晶、离心，再次获得缬氨酸固体b和母液；
4)采用10倍体积的蒸馏水对缬氨酸固体b进行水溶后，经离子交换、脱色、精滤、结晶获得医药级缬氨酸；
(1)调节水溶后的液体ph值为4.5，通入强酸性离子交换树脂中，采用2％氨水进行解析；
(2)采用单效蒸发器对洗脱液进行浓缩脱氨，添加3‰的活性炭脱色45min，调节脱色后料液ph值为6.0，除去活性炭；
(3)调节除炭后料液ph值为6.0，采用0.2μm滤芯进行精滤处理，精滤液经浓缩、结晶、离心、干燥、粉碎制得成品，经检测，缬氨酸纯度为99.98％。
实施例2
一种发酵制备提取医药级缬氨酸的方法，其包括如下步骤：
将乳酸发酵短杆菌atcc1470种子液(1×108cfu/ml)按照8％的接种量接入发酵培养基中，连续发酵50小时，得到缬氨酸发酵液；发酵过程中的温度控制在30℃，ph控制在6.5，控制葡萄糖浓度不低于15g/l；
所述发酵培养基的组分为：葡萄糖50g/l、玉米浆30g/l、豆粕10g/l、乳糖10g/l、硫酸铵6g/l、磷酸二氢钾0.1g/l、硫酸镁0.1g/l、硫酸锰6mg/l、硫酸亚铁6mg/l、氯化钾6mg/l；
利用陶瓷膜过滤缬氨酸发酵液得到滤液a(缬氨酸含量为4.7％)和湿菌体；往湿菌体中添加3wt％电气石粉，100rpm搅拌30min，然后停止搅拌，加热至50℃，保温80s，自然冷却至室温，然后添加到三倍重量的透析培养基中，培养温度30℃，100rpm搅拌培养6h，陶瓷膜过滤收集菌体和滤液b；所述透析培养基为(质量百分比)：磷酸二氢钾0.8％，磷酸氢二钾0.8％，硫酸铵0.5％，聚乙二醇0.08％，硫酸亚铁0.01％，硫酸镁0.01％，硫酸锌0.01％，调整ph为6.5；所述陶瓷膜的膜孔径50nm；
2)合并滤液a和滤液b，通过超滤过滤，收集超滤液，超滤操作温度为40℃，进压为7-8bar，出压为6-7bar；将超滤液通过真空浓缩至缬氨酸含量为30wt％，然后降至室温，离心得到缬氨酸粗品；
3)采用1.0倍体积的7mol/l盐酸对缬氨酸粗品进行一次酸溶，再经降温结晶、离心，获得缬氨酸固体a和母液；采用0.5倍体积的1mol/l盐酸对上述缬氨酸固体a进行二次酸溶，再经降温结晶、离心，再次获得缬氨酸固体b和母液；
4)采用8倍体积的蒸馏水对缬氨酸固体b进行水溶后，经离子交换、脱色、精滤、结晶获得医药级缬氨酸；
(1)调节水溶后的液体ph值为4.5，通入强酸性离子交换树脂中，采用2％氨水进行解析；
(2)采用单效蒸发器对洗脱液进行浓缩脱氨，添加1.8‰的活性炭脱色45min，调节脱色后料液ph值为6.0，除去活性炭；
(3)调节除炭后料液ph值为6.0，采用0.2μm滤芯进行精滤处理，精滤液经浓缩、结晶、离心、干燥、粉碎制得成品，经检测，缬氨酸纯度为99.97％。
实施例3
1、以实施例1为例，检测缬氨酸的含量，分别检测了滤液b中缬氨酸的含量；同时还设置对照组，其中，对照组1为：只进行透析培养处理，不采用电气石粉和热处理，其余同实施例1；对照组2：发酵完成之后，进行电气石粉以及透析培养处理，不采用热处理，其余同实施例1；对照组3：发酵完成之后，进行热处理以及透析培养处理，不采用电气石粉处理，其余同实施例1；检测各组别滤液b中缬氨酸的含量，具体结果见表1：
表1
结论：如表1所示，经过废弃菌株再培养处理，仍能产生较高浓度的缬氨酸，实施例1组、对照组1-3均能够产生缬氨酸，但是采用电气石粉处理、热处理以及透析培养处理的产酸效果最好，明显优于采用单一方式处理或者两种方式处理，分别是对照组1的2.51倍，是对照组2的1.22倍，是对照组3的1.32倍。
2、热处理温度对滤液b中缬氨酸的含量的影响：
在30-60℃之间设定多个浓度梯度，检测不同温度条件下对菌株产缬氨酸的影响，其余流程同实施例2。如图1所示，30-40℃之间的温度对产酸量影响不大，没有明显的提升，随着温度的升高40℃以上，缬氨酸产量逐渐提高，50℃可达到峰值，但是当温度继续升高，缬氨酸产量明显下降，可能是因为温度过高造成菌株的酶活力下降，而且对菌株造成了损伤较大，可见，选择适宜的温度比较关键，温度过高或者过低均起不到提高缬氨酸产量的效果。
以上所述，为本发明的较佳实施案例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。