白菜型油菜DGAT1基因及其应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及白菜型油菜dgat1基因、其编码蛋白及应用。
背景技术：
：三酰甘油(tag)是植物贮藏脂类的主要贮存形式，它广泛分布于植物的种子、花粉、果实和叶片等器官中，主要参与细胞膜脂构建、能量代谢、逆境反应、种子萌发和花粉发育等众多生命活动。随着对油脂合成途径研究的深入，发现植物主要有2条tag生物合成途径。其一为kennedy途径，是植物组织中油脂生物合成的主要途径。在该途径中二酰甘油酰基转移酶(diacylglycerolacyltransferase,dgat)是控制tag合成的最后一步反应的限速酶，它催化酰基链从脂酰基辅酶a转移到sn-1,2-二脂酰甘油(dag)的sn-3位上的反应，从而形成tag。另一合成途径是由磷脂二酰甘油酰基转移酶(pdat)控制的以磷脂作为酰基供体的tag的合成。dgat是一种微粒体酶，该酶的活性与脂肪代谢及脂类在组织中的沉积有密切关系，它能够催化二酰甘油与酰基辅酶a的共价结合，从而形成甘油三酯(tag)；而dgat是三酰甘油生物合成途径中关键限速酶。到目前为止，根据其序列相似度、基因定位和基因结构等方面的差异可分为：dgat1、dgat2和dgat3。dgat1属于mboat酰基转移酶超基因家族中的酰基辅酶a胆固醇酰基转移酶家族(acy1coa:cholesterolacyltransferase.acat)，是一种特殊类型的dgat酶；而dgat2和最初克隆到的dgat在氨基酸序列上存在差异，属于dgat2超基因家族，在大多数动植物体内跟dgat1是直系同源，dgat1和dgat2蛋白主要结合在内质网膜上，二者相似度很高，而dgat3只在发育中的花生子叶中发现的新类型，定位于细胞质内，由于其与dgat1和dgat2的相似度极低，因将其命名为dgat3。dgat广泛存在于叶片、花瓣、果实、花粉囊以及发育的种子等不同器官中,尤其在发育的种子和花瓣中其含量和活性较高。自1999年以来，研究人员在拟南芥、油菜、蓖麻、烟草、大豆等其他植物均得到了dgat基因。研究表明dgat1是属于酰基辅酶a转移酶活性家族的一类酶，除了二酰基甘油外，它还能利用不同的受体。例如，mmdgat1也拥有酰基辅酶a：视黄醇酰基转移酶(retinolacyltransferasearat)的活性，以及拟南芥中酰基辅酶a：脂肪族醇酰基转移酶(fattyalcoholacyltransferase)又叫蜡酯合成酶(waxestersynthasewsd1)，在体外也表现出dgat的活性。近年来，对植物油脂的广泛需求极大的促进了dgat相关基因的研究，尤其是在利用基因工程方法改良优质品质方面获得了较大的发展。2008年，zheng通过对高油玉米dgat1的研究发现，在dgat1-2蛋白的f469位点处的一个苯丙氨酸的插入是提高油含量和油酸含量的重要决定因素，阐明了油含量以及组成差异的分子基础。技术实现要素：本发明的目的是提供白菜型油菜dgat1及其应用。本发明首先提供白菜型油菜dgat1蛋白，其具有：1)如seqidno.2所示的氨基酸序列；或2)seqidno.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。本发明提供了编码白菜型油菜dgat1蛋白的基因，其具有：1)seqidno.1所示的核苷酸序列；或2)seqidno.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或3)在严格条件下与1)限定的dna序列杂交的核苷酸序列。本发明提供了含有上述编码白菜型油菜dgat1蛋白的基因的生物材料，所述生物材料为载体、宿主细胞或表达盒。本发明提供了上述白菜型油菜dgat1蛋白或编码其的基因或含有该基因的生物材料在提高细胞中总油脂含量中的应用。所述细胞为酵母细胞或植物细胞。所述酵母细胞为酿酒酵母细胞。所述酿酒酵母为酿酒酵母h1246。本发明提供了上述白菜型油菜dgat1蛋白或编码其的基因或含有该基因的生物材料在制备转基因植物中的应用。所述的转基因植物为含油量高的转基因植物。所述的植物为油类作物或小球藻。所述油类作物为油菜、拟南芥、向日葵、大豆、番茄、蓖麻、芝麻或花生。本发明提供了上述白菜型油菜dgat1蛋白或编码其的基因或含有该基因的生物材料在植物种质资源改良中的应用。本发明提供了上述白菜型油菜dgat1蛋白或编码其的基因或含有该基因的生物材料在生产食用油中的应用。本发明提供了上述白菜型油菜dgat1蛋白或编码其的基因或含有该基因的生物材料在生产生物柴油中的应用。本发明克隆了白菜型油菜(brassicarapa)(芥头2号)的dgat1基因brdgat1(在基因组数据中的编号为bra036722)，将其转入酿酒酵母突变体h1246后，可大幅度提高酵母总油脂的含量。本发明选择突变型酵母在对brdgat1基因进行功能验证的同时还发现了其对油脂合成的显著作用。在酵母中研究表明，brdgat1基因转酵母株与对照组(转pyest02-gfp空载)相比，总油脂含量大幅提高3倍以上。在拟南芥异源表达中，可以提高其种子中总脂肪含量为5.23-12.86％。附图说明图1为brdgat1酵母表达载体构建图谱，bra036722即为brdgat1。图2为尼罗红染色法测定酵母中tag含量分析图，在共聚焦显微镜观察，gfp为转空载的对照，brdgat1为转brdgat1基因的酵母，箭头所指为油体。图3为tlc法测定的酵母总脂肪酸含量分析图，gfp为对照；brdgat1为转brdgat1基因的酵母；tag，为油脂的阳性对照。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例中使用的酿酒酵母突变体h1246来自(购自scanbiltd公司)，本实施例的白菜型油菜(品种名：芥头2号)来自本实验室保存的种质。实施例1白菜型油菜(芥头2号)brdgat1基因cdna全长的获得取白菜型油菜(芥头2号)的成株新鲜叶片约0.1克，置于液氮中充分研磨。根据qiagenrneasyminikit(valencia,ca)的说明提取总rna，进行总rna提取和纯化。根据transscriptone-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix(beijing,china)说明书反转录获得cdna，并进行rt-pcr(具体操作见toyoborevertraace-α试剂盒)。cdna合成的反应组分如下：用rnasefreeh2o补至总体积为20μl。首先将rna、引物和rnasefreeh2o充分混匀后65℃孵育5分钟，再冰浴2分钟，然后再加入其它组分充分混匀后42℃孵育30分钟，85℃反应5秒灭活rt/rienzyme和gdnaremover。取适量上述逆转录产物以正向引物(agcaggctttgacttatggcggttttggattctggag)和反向引物(tgggtctagagacttggacatggatcctttgcggt)进行pcr扩增。pcr反应条件：预变性95℃2min；变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃2min，25个循环；总延伸72℃5min。将上述pcr产物采用in-fusion的方法将目的基因连接到已酶切的入门载体(pgwcm-t)，测序验证获得了brdgat1(036722)的全长cdna，序列见seqidno.1，命名为bra036722。in-fusion连接反应：体系为5μl：1)pcr扩增产物，1.5μl；2)酶切载体(pgwc-t)，2.5μl；3)5×ligation-freecioningmastermix，1μl。然后冰上放置1小时。实施例2含有brdgat1基因的酵母表达载体的构建通过in-fusion的方法将实施例1获得的目的基因brdgat1重组到gateway体系的入门载体(pgwcm-t)，之后通过lr重组反应，将靶标基因构建到酵母表达载体pyest02。pyest02是通过in-fusion的方法将pyd-est52(购自invitrogen公司)半乳糖诱导启动子换成组成型启动子ahd1的酵母表达载体，将构建好的重组载体命名为pyest02-brdgat1，其载体图谱见图1。并用pyest02-gfp作为阴性对照质粒。实施例3酵母表达载体pyes-dgat1转化酿酒酵母及brdgat1在酿酒酵母中的诱导表达接种酵母突变体h1246(购自invitrogen公司)于10mlypd培养基中，30℃震荡培养过夜。次日将菌液接种到50mlypd培养基中，稀释到od600＝0.4，继续培养2-4h至od600在0.5-0.6之间，5,000rpm冷冻离心1min,用40ml1×te(10mmtris，ph7.5，1mmedta)悬浮沉淀，5,000rpm冷冻离心，用2ml1×liac(10mm乙酸锂，ph7.5)/0.5×te悬浮沉淀，室温放置10min。将100μl酵母悬浮液与1μg酵母表达载体pyes-dgat1和100μg变性鲑鱼精dna混匀，然后加入700μl1×liac/40％peg-3350/1×te，混匀。30℃培养30min，加入88μldmso，混匀，42℃热激7min。10,000rpm离心10s，去上清，用1ml1×te悬浮沉淀，10,000rpm离心10s，去除上清。用50-100μl1×te悬浮沉淀，涂布于sc-u基本培养基上，30℃培养2天。2天后，从培养基平板上挑取菌落，参考博迈德酵母高纯度质粒小量快速提取试剂盒说明书，进行质粒提取，然后将提取的质粒作为模板进行pcr验证。最后对验证为阳性的酵母质粒和相应的菌落进行保存。将转化有pyest02-brdgat1的酿酒酵母h1246的单菌落接种于5mlsc-u培养基中，200rpm，30℃培养过夜。取过夜培养的菌液转接到50ml含1％棉子糖和2％酵母表达诱导物d-半乳糖的sc-u培养液中，使其od600约为0.1，加入np-40(终浓度为1％，有利于酵母细胞悬浮)，200rpm，20℃，培养72h诱导表达。将转化有pyest02-gfp空载的酵母转化子设为对照，对作为对照的酵母转化子进行同样操作。实施例4酵母总脂肪酸的分析1.尼罗红染色法分析收集500μl实施例3诱导培养的指数生长期酵母细胞，然后重悬于125μl1×pbs中，加入5μl尼罗红染液(1mg/ml)混匀，室温下避光染色10min，立即制片置于激光共聚焦显微镜(leicatcssp5)下观察，激发波长488nm，发射波长570nm。结果表明与对照相比，只有brdgat1具有dgat1的活性，能够很清晰地检测到油滴的产生，从光密度强度和油滴的大小及多少来看，brdgat1合成tag的能力最强，而转化有pyest02-gfp空载的酵母(对照)基本没有油滴的生成(分析结果见图2)。2.转基因酵母tag及脂肪酸分析将冻干酵母在研钵中充分研磨，称取0.05g于10ml离心管中，加入3ml提取溶剂(氯仿：甲醇＝1:2,v/v)，振荡混匀(防直射光)。静置10min，再加入1ml氯仿，振荡混匀。加入1.8mlkcl(1m)，使最终氯仿：甲醇：kcl比例为体积比1:1:0.9。充分振荡后离心(3,000rpm，5min)，体系分为三层(上层：水+甲醇；中层：杂质碎片；下层：氯仿)。将下层氯仿相转移到新的离心管中(不要吸入水)，用氮气浓缩至约100μl。用100μl玻璃注射器点在硅胶板上。将25ml(如放两块板，应适当增加)展液(正己烷：乙醚：乙酸(70:30:1,v/v))摇匀后加入到层析缸中，浸湿滤纸使其贴于缸壁上，盖上盖子静置20min，使气体充满层析缸达到饱和，防止边缘效应。把硅胶板放到层析缸中(点样点不要浸入到展液中)。层析分离结束后，取出板，吹干。硅胶板上均匀喷洒0.01％primulin丙酮水溶液(丙酮：水＝60:40,v/v)显色，吹干后在紫外灯(360nm)下观察确定是否有tag的形成。分析结果发现brdgat1基因具有很强的合成tag的能力。与阴性对照细胞相比，利用imagesj分析信号强度，转brdgat1酵母总油脂含量大幅提高3倍以上。说明brdgat1具有dgat的活性最高，而阴性对照不具有dgat1的活性，在tag的合成过程中没有作用，这与在尼罗红染料下观察到的结果相符合(分析结果见图3)。利用gc-ms方法对酵母的总脂肪酸进行测定。酵母诱导培养后，离心收集菌体，于55℃烘箱烘干，将烘干的酵母菌体充分研磨，称取0.05g，加入3ml7.5％koh-ch3oh(已加入c17:0标准品作为内参)，70℃水浴3-5h，中间颠倒混匀几次。加入2mlhcl-ch3oh(v/v，1:1)溶液，2ml14％bf3-ch3oh溶液，70℃水浴1.5h。加入1ml0.9％nacl和4ml正己烷，充分振荡混匀，4,000rpm离心8min，将上层有机相转移至一新管中。n2吹干，300μl乙酸乙酯溶解。每个样品重复三次。结果表明：与阴性对照相比，转bra036722酵母的软脂酸(c16:0)、棕榈酸(c16:1)、硬脂酸(c18:0)和油酸(c18:1)含量分别为：41.84μg/mg、117.87μg/mg、17.11μg/mg、73.94μg/mg；对照中各组份的含量分别为：15.04μg/mg、45.12μg/mg、6.55μg/mg、27.53μg/mg，分别对照提高了178.18％、162.15％、161.24％和168.58％。实施例5brdgat1植物表达载体的构建及拟南芥的遗传转化参照实施例2，将brdgat1过lr反应，重组到由camv35s驱动的植物过表达载体phzm27(本实验室构建，以pearleygate100(earleyetal.,2006,plantj,45:616-629)为载体骨架，分别在表达框的两侧加上绝缘子gyps元件(sheetal.,2010,genetics,185:1141-1150)，并在gateway后面加上gfp标签)上，命名为phzm27-brdgat1。转化农杆菌后，利用蘸花法转化拟南芥，通过筛选继代，获得brdgat1的t3转基因株系为12株。实施例6转brdgat1基因拟南芥的制备与其总脂肪检测利用gc-ms方法分析实施例5获得的转基因拟南芥t3代种子中脂肪酸的变化(参照实施例4中的脂肪酸提取的方法)。结果表明：转化brdgat1的种子中c16:0、c18:0、c18:1、c18:2、c18:3和c20:1总脂肪酸分别比对照提高5.23％-12.86％。具体见表1。表1转brdgat1基因拟南芥脂肪酸含量(μg/mg)株系c16:0c18:0c18:1c18:2c18:3c20:1总脂肪酸col-040.2914.2237.52108.8264.2449.45314.54brdgat1-145.4716.0442.35122.8172.555.81354.98brdgat1-844.2615.6141.21119.5270.5654.31345.47brdgat1-1342.414.9639.49114.5167.652.03330.98虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所<120>白菜型油菜dgat1基因及其应用<130>khp171110795.2tq<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1511<212>dna<213>brassicarapa<400>1atggcggttttggattctggaggcgtcgctgtaccgccgacggagaacggcgtcgcggat60ctcgacaggctccaccgtcgtaaatcgagatcggattcttccaacggactcctctccgat120acttccccgtcggacgatgttggagctgcggcggccgaaaggcatcgggttgattccgct180gccgaggaggaggctcagggaacagcgaatttagctggcggagatgccgaaactagggaa240tccgccggaggcgatgtaaggtttacgtatcgaccgtcggttccagctcatcggaggacg300agggagagtcctctcagctctgacgctatcttcaaacaaagccatgcaggattgttcaac360ctctgtgtagttgttcttgttgctgttaacagtagactcatcatcgaaaacctcatgaag420tatggttggttgatcagaactgatttttggtttagttctacatccttacgagactggccg480cttttcatgtgttgtctttcactttcggtctttcctttggctgccttcacggtcgagaaa540atggtacttcagaaattcatatctgagcctgttgccatcattcttcatgtcattataacc600ttgacagaggtcttgtatccagtctacgtcacactgaggtgtgattccgccttcttgtca660ggtgtcacgttgatgctgctcacttgcattgtgtggctgaagttggtttcttacgctcat720actagctacgacataagaactctagctaattcagctgataaggtcgatcctgaaatctcc780tactatgttagcttgaagagcttggcgtatttcatggttgctcctacattgtgttatcag840ccaagctatccacgttccccatgtatacggaagggctgggtggctcgtcaatttgcgaaa900ctggtcatattcactggactcatgggatttataatagagcagtatataaatcctattgtt960aggaactcaaagcatcctttgaaaggggaccttctatatgctattgaaagagtgttgaag1020ctttcagttccaaatctatatgtgtggctctgcatgttctactgcttcttccacctttgg1080ttaaacatattggcagagctcctctgcttcggggaccgtgaattctacaaagattggtgg1140aatgcaaaaagcgttggagattattggagaatgtggaatatgcctgttcacaaatggatg1200gttcgacatgtatactttccatgcctgcgcatcaagataccaaaagtacccgccattatc1260attgctttcttagtctctgcagtctttcatgagttatgcatcgcagttccttgccgtctc1320ttcaatctatgggctttcatgggaattatgtttcaggtccctttggtctttatcacaaac1380tttttacaagaaaggtttggctccatggtgggaaacatgatcttctggttcagcttctgc1440attttcggacaaccgatgtgtgtgcttctttattaccatgacctgatgaaccgcaaagga1500tccatgtccgg1511<210>2<211>504<212>prt<213>brassicarapa<400>2metalavalleuaspserglyglyvalalavalproprothrgluasn151015glyvalalaaspleuaspargleuhisargarglysserargserasp202530serserasnglyleuleuseraspthrserproseraspaspvalgly354045alaalaalaalagluarghisargvalaspseralaalaglugluglu505560alaglnglythralaasnleualaglyglyaspalagluthrargglu65707580seralaglyglyaspvalargphethrtyrargproservalproala859095hisargargthrarggluserproleuserseraspalailephelys100105110glnserhisalaglyleupheasnleucysvalvalvalleuvalala115120125valasnserargleuileilegluasnleumetlystyrglytrpleu130135140ileargthraspphetrppheserserthrserleuargasptrppro145150155160leuphemetcyscysleuserleuservalpheproleualaalaphe165170175thrvalglulysmetvalleuglnlyspheilesergluprovalala180185190ileileleuhisvalileilethrleuthrgluvalleutyrproval195200205tyrvalthrleuargcysaspseralapheleuserglyvalthrleu210215220metleuleuthrcysilevaltrpleulysleuvalsertyralahis225230235240thrsertyraspileargthrleualaasnseralaasplysvalasp245250255progluilesertyrtyrvalserleulysserleualatyrphemet260265270valalaprothrleucystyrglnprosertyrproargserprocys275280285ilearglysglytrpvalalaargglnphealalysleuvalilephe290295300thrglyleumetglypheileilegluglntyrileasnproileval305310315320argasnserlyshisproleulysglyaspleuleutyralaileglu325330335argvalleulysleuservalproasnleutyrvaltrpleucysmet340345350phetyrcysphephehisleutrpleuasnileleualagluleuleu355360365cyspheglyasparggluphetyrlysasptrptrpasnalalysser370375380valglyasptyrtrpargmettrpasnmetprovalhislystrpmet385390395400valarghisvaltyrpheprocysleuargilelysileprolysval405410415proalaileileilealapheleuvalseralavalphehisgluleu420425430cysilealavalprocysargleupheasnleutrpalaphemetgly435440445ilemetpheglnvalproleuvalpheilethrasnpheleuglnglu450455460argpheglysermetvalglyasnmetilephetrppheserphecys465470475480ilepheglyglnprometcysvalleuleutyrtyrhisaspleumet485490495asnarglysglysermetserxaa500<210>3<211>37<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400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