一种鱼类传染性造血器官坏死病病毒的培养方法与流程

本发明属于生物制品
技术领域：
，具体涉及一种鱼类传染性造血器官坏死病病毒的培养方法。
背景技术：
：鱼传染性造血器官坏死病是鱼类重要的疾病之一，在野生和人工培育的鳟鱼和鲑鱼石斑鱼中均可发生该疾病，是一种急性的、全身性的、致命性的传染病。传染性造血器官坏死病病毒(infectioushematopoieticnecrosisvirus,ihnv)是引起该病的病原，ihnv属于弹状病毒科(rhabdoviridae)，诺拉弹状病毒属(novirhabdovirus)。该病给全球范围内的冷水渔业造成了较为严重的经济损失。到目前为止仍未有有效的疫苗用于预防这类病毒的感染和传播。中国专利(cn104189899b)公布了一种制备虹鳟鱼传染性造血器官坏死症灭活疫苗的方法，研磨、过滤和浸毒处理发病但未死亡的稚鱼胰腺和肝脏，接种虹鳟鱼性腺细胞，在14℃条件下盲传，盲传至第十代时五天，收集细胞毒液；接种大鳞大马哈鱼胚胎细胞，从14℃开始传代，每传五代培养温度升高1℃，直至培养温度升高至20℃；用鲤鱼上皮瘤细胞在20℃条件下继续传代，传至第十二代，得到高滴度的病毒液，经灭活后制成虹鳟鱼传染性造血器官坏死症灭活疫苗。该制备方法利用rtg-2、chse-214和epc细胞在特定的环境温度下交替培养虹鳟鱼传染性造血器官坏死症病毒，获得高滴度ihnv抗原，生产灭活疫苗；解决了单一细胞无法获得高滴度ihnv抗原的技术难题。但是其在病毒生产的过程中需要经多种细胞的传代培养，且未能实现大规模生产。技术实现要素：为解决上述问题，本发明提供了一种采用生物反应器技术生产鱼传染性造血器官坏死病病毒的方法。本发明利用生物反应微载体悬浮式培养，实现了ihnv病毒的载体细胞鲑鱼胚胎chse细胞的大规模，高密度饲养，从而获得高产量，高滴度的ihnv病毒液，用于生产鱼传染性造血器官坏死病病毒灭活疫苗。本发明通过以下技术方案实现：一种鱼类传染性造血器官坏死病病毒悬浮培养的方法，包括以下步骤：s1.取长成单层的chse细胞，经胰酶消化后用细胞培养液中和，振摇分散细胞，调整细胞浓度；按4×108cells/ml的量转接种到含微载体的生物反应器中进行培养，培养条件为：培养温度16-20℃，5％co2，ph值在7.0-7.5之间，葡萄糖含量不低于330mg/dl，溶氧为40％-60％，搅拌速度为40-60rpm；s2.待步骤s1中细胞密度达到2×106cells/ml细胞时，按体积比1：1000的比例接种含ihnv病毒毒种，并加入细胞生长液，每隔5分钟进行搅拌，16-20℃孵育15-45分钟，然后设置反应器参数：培养温度为16-20℃，5％co2，维持ph值在7.0-7.5之间，葡萄糖含量不低于450mg/dl，溶氧为40％-60％和搅拌速度30-50rpm，进行持续培养。进一步地，所用生物反应器为自动化搅拌生物反应器。进一步地，所用微载体为球形微载体，使用密度为6g/l。进一步地，所用胰酶为0.125％胰酶。进一步地，所述细胞培养液由85-92％mem培养液、2-5％葡萄糖、6-10％胎牛血清、1-3mg/l氯化胆碱和0.2-0.6mg/l次黄嘌呤组成。进一步地，所用毒种中ihnv病毒含量为1×107tcid50。进一步地，细胞生长液由90-95％mem培养液、2-5％葡萄糖和3-5％新生小牛血清组成。本发明所用的生物反应器为齐志生物工程设备有限公司生产bc-7l搅拌式生物反应器。其自动化程度高，培养温度、酸碱度、溶氧、搅拌转速均有电脑程序控制，减少了人力的使用，并且各项生产工艺参数具体且确定，保证了每批产品品质的稳定性，从而有助于实现ihnv病毒及疫苗产品的大规模自动化生产。本发明细胞生长液以mem为基础培养液，补加了葡萄糖的用量，减少了胎牛血清的用量并添加了氯化胆碱和次黄嘌呤，加入到生物反应器中培养chse细胞并用于生产ihnv病毒，最终得到的病毒效价≥3.5×107tcid50。与现有技术相比，本发明培养方法保证了细胞在生物反应器内精确的自动生长环境控制，与细胞培养瓶及转瓶相比，使细胞能达到更高的生长密度，从而提高了产毒的滴度；在单个体系中大规模繁殖细胞，感染病毒，使样品的批次内及批次间稳定性极大地提高。本发明培养方法增加了生产的可靠性，减低了单体的生产成本。附图说明图1：利用生物反应器悬浮培养鱼类获得性造血器官坏死病病毒(ihnv)流程图；图2：chse细胞在生物反应器悬浮微载体培养图片；图3：ihnv在生物反应器悬浮微载体培养chse细胞中繁殖图片；图4：chse细胞在生物反应器悬浮微载体培养和感染繁ihnv后的代谢曲线。具体实施方式下面将结合实施例进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。实施例1一种鱼类传染性造血器官坏死病病毒的培养方法所述鱼类ihnv病毒的培养方法，分为以下步骤：s1.取长成单层的chse细胞，经0.125％胰酶消化后用细胞生长液中和，振摇分散细胞，调整细胞浓度；按4×108cells/l的量转接种到生物反应器中进行培养，反应器中球形微载体密度为6g/l，培养条件为：培养温度20℃，5％co2，ph值设为7.0，葡萄糖含量不低于330mg/dl，溶氧为40％，搅拌速度为40rpm；所述细胞培养液由92％mem培养液、2％葡萄糖、6％胎牛血清、3mg/l氯化胆碱和0.2mg/l次黄嘌呤组成；s2.待步骤s2中细胞密度达到2.1×106cells/ml细胞时，按体积比1：1000的比例接种含ihnv病毒1×107tcid50的毒种，每隔5分钟进行搅拌，16℃孵育45分钟，然后设置反应器培养温度为16℃，5％co2，维持ph值7.0左右，葡萄糖含量不低于450mg/dl，溶氧为50％和搅拌速度30rpm，进行持续培养；细胞生长液由90％mem培养液、5％葡萄糖和5％新生小牛血清组成。实施例2一种鱼类传染性造血器官坏死病病毒的培养方法所述鱼类ihnv病毒的培养方法，分为以下步骤：s1.取长成单层的chse细胞，经0.125％胰酶消化后用细胞生长液中和，振摇分散细胞，调整细胞浓度；按2×108cells/l的量转接种到生物反应器中进行培养，反应器中球形微载体密度为6g/l，培养条件为：培养温度20℃，5％co2，ph值在7.5左右，葡萄糖含量不低于330mg/dl，溶解氧为60％，搅拌速度为60rpm；所述细胞生长液由85％mem培养液、5％葡萄糖、10％胎牛血清、1mg/l氯化胆碱和0.6mg/l次黄嘌呤组成；s2.待步骤s2中细胞密度达到2.3×106cells/ml细胞时，按体积比1：1000的比例接种含ihnv病毒1×107tcid50的毒种，每隔5分钟进行搅拌，20℃孵育15分钟，然后设置反应器培养温度为20℃，5％co2，维持ph值在7.5左右，葡萄糖含量不低于450mg/dl，溶氧为60％和搅拌速度50rpm，进行持续培养；细胞生长液由95％mem培养液、2％葡萄糖和3％新生小牛血清组成。实施例3一种鱼类传染性造血器官坏死病病毒的培养方法所述鱼类ihnv病毒的培养方法，分为以下步骤：s1.取长成单层的chse细胞，经0.125％胰酶消化后用细胞生长液中和，振摇分散细胞，调整细胞浓度；按2×108cells/ml的量转接种到生物反应器中进行培养，反应器中球形微载体密度为6g/l，培养条件为：培养温度18℃，5％co2，ph值在7.2左右，葡萄糖含量不低于330mg/dl，溶解氧为40％，搅拌速度为50rpm；所述细胞生长液由89％mem培养液、3％葡萄糖、8％胎牛血清、2mg/l氯化胆碱和0.5mg/l次黄嘌呤组成；s2.待步骤s2中细胞密度达到2.8×106cells/ml细胞时，按体积比1：1000的比例接种含ihnv病毒1×107tcid50的毒种，每隔5分钟进行搅拌，18℃孵育30分钟，然后设置反应器培养温度为18℃，5％co2，维持ph值在7.3左右，葡萄糖含量不低于450mg/dl，溶氧为50％和搅拌速度40rpm，进行持续培养；细胞生长液由93％mem培养液、3％葡萄糖和4％新生小牛血清组成。对比例1一种鱼类鱼类传染性造血器官坏死病病毒的培养方法与实施例3的区别在于，所述细胞生长液中不添加氯化胆碱和次黄嘌呤组成，其它均与实施例3相似。对比例2一种鱼类鱼类传染性造血器官坏死病病毒的培养方法与实施例3的区别在于，所用细胞为鲤鱼上皮瘤细胞(epc)，其它均与实施例3相似。试验例1病毒含量测定1、试验材料：实施例1、实施例2、实施例3和对比例1、对比例2培养所得培养物。2、试验方法：实施例1、实施例2、实施例3培养和对比例1、对比例2所得鱼类传染性造血器官坏死病病毒毒液于-20℃反复冻融两次后，于4℃、5000rpm离心10min，取离心后经0.22um滤膜过滤除菌，取过滤后的病毒液用dmem细胞培养液做10倍系列稀释，取10-2、10-3、10-4、10-5、10-65个稀释度接种48孔铺满单层lmh细胞培养板，每个稀释度重复5孔，同时设立阴性对照细胞，每孔0.1ml，37℃吸附30min后，补加含1～2％新生牛血清、适量双抗和2mm谷氨酰胺的dmem培养液0.3ml于37℃、5％co2培养120小时，观察细胞病变(cpe)，计算tcid50；3、试验结果：如表1所示。表1各组犬瘟热病毒含量测定组别病毒含量(tcid50)实施例13.5×107实施例23.9×107实施例34.4×107对比例11.2×106对比例27.2×100由表1可知，本发明实施例1-3各组培养所得病毒含量均≥3.5×107tcid50，其中实施例3培养所得鱼类传染性造血器官坏死病病毒含量高达4.4×107tcid50，为最佳实施例。实施例3组与对比例1组相比，病毒含量明显增高，说明本发明实施例细胞生长液能够促进病毒的增殖；实施例3组与对比例2组相比，病毒含量明显增高，说明本发明以chse单一细胞培养鱼类传染性造血器官坏死病病毒，效果显著。当前第1页12