猪PLIN2基因超表达的PK‑15细胞株及扩增PCV2病毒的方法与流程

发明所属领域

本发明属于细胞工程与病毒培养技术领域，具体地说，本发明涉及一种能大幅度提高猪圆环病毒2型(pcv2)培养效价的重组细胞株，制备方法及培养高效价pcv2病毒方法。

技术背景

目前国内正在使用的猪圆环病毒疫苗主要有2种----亚单位苗和全病毒疫苗，亚单位苗虽安全性较好，但生产成本高昂，免疫期短。因此国内绝大部分猪场仍以全病毒疫苗为主。但全病毒疫苗生产亦有其技术瓶颈：病毒培养效价很难上升到理想状态，为解决该难题，疫苗生产者都在其培养工艺中增加一个用d-氨基葡萄糖处理，使细胞停留于分裂ⅱ期，保证病毒扩增的程序。但该程序不仅增加了原材料投入，而且增多了生产环节和人力投入，增加了废弃物排放量，使生产成本至少增加1倍以上。即便如此，国内许多厂家生产的圆环病毒疫苗，其病毒效价在10⁴以下，免疫效果较差。欧美国家采取筛选对圆环病毒高度敏感细胞系，培养圆环病毒以及进行病毒浓缩，其病毒含量均在10⁶以上，免疫效果较好，但其生产成本高昂，销售价格往往是国产疫苗的3-5倍。因此如何提高圆环病毒的培养效价而又降低生产成本是国内厂家目前提高圆环病毒疫苗竞争能力的主攻方向。

plin即脂滴包被蛋白是分布于脂滴表面的含量最多的围脂滴蛋白。最早在附睾脂肪细胞中发现，是脂肪分解调控中的分子开关。plin2基因是plin家族中的一员，猪plin2基因在体内参与动物或细胞的脂类代谢。但关于该基因对圆环病毒增殖的影响至今尚未见文献报道。

本发明的技术内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种对pcv2病毒易感，且能大幅提高pcv2培养效价的转基因pk-15细胞株。

本发明的再一个目的是提供一种制备pcv2病毒的方法。

本发明的另一个目的是提供扩增的pcv2病毒在制备pcv2疫苗中的应用。

本发明公开了一种超表达猪plin2基因的pk-15细胞株，其特征是：pk-15细胞含有人工转染的外源猪plin2基因，且plin2基因具有seqidno：35所示的核苷酸序列，该细胞对pcv2病毒易感，且能产生效价达到10^-7以上的病毒，该细胞是猪肾pk‐15/plin2细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:c2017251。

本发明还公开了制备pk‐15/plin2细胞株的方法，该方法包括如下步骤:

1)plin2基因的克隆：根据plin2基因序列设计重叠pcr引物，共计34条，相邻引物之间有17bp反向互补重叠，中间有25bp未互补序列，34条引物拼接成plin2基因的全长,将34条引物混合后经过退火处理，相邻引物的17bp序列互补配对。中间未配对的25bp序列，在高保真酶的作用下序列被补齐，构成完整的双链plin2基因的全长序列,经过25个循环后，plin2基因得到扩增，然后将扩增获得的片段经电泳检测；

2)利用胶回收试剂盒将扩增获得的pln2基因片段回收，然后用将该片段与pcdna3.1-egfp载体分别经nhei和aflii限制性内切酶酶切，电泳检测回收目的片段后经t4连接酶连接至pcdna3.1-egfp载体中，构建成pcdna3.1-egfp-plin2质粒，并经测序验证；

3)转染与筛选：转染质粒plin2-pcdna3.1-egfp至pk-15细胞系，单个细胞克隆化培养法筛选出稳定复制外源plin2的pk‐15/plin2细胞株。

本发明进一步公开了制备pcv2的方法，该方法包括如下步骤:

1)细胞制备：将pk-15/plin2细胞株解冻，培养于克氏瓶中，传代至所需数量；

2)病毒接种：同步接种法将pcv2病毒接种于pk-15/plin2细胞株上，继续培养24小时；

3)病毒培养：24小时后，将培养基更换为含2％胎牛血清的维持液继续培养72小时；

4)收获病毒：收获步骤(3)中的培养上清液，并进行pcv2毒价测定，病毒效价能达到10^-7以上。

具体的本发明的目的通过下述技术方案实现：

1、含有猪plin2基因的pk-15细胞株的制备

1.1引物设计与合成

根据靶基因plin2序列及重叠pcr原理设计引物，序列如下(见表1)，引物序列特征为：编号为单号的引物与plin2基因序列(5'->3')方向一致，编号为双号的引物与plin2基因序列(5'->3')反向互补，另外相邻编号的序列之间存在17bp重叠。第一条序列的前20bp为载体的同源序列与载体序列一致。最后一条序列的后20bp为载体的同源序列与载体序列一致。

表1引物列表

待引物合成后用去离子水稀释至50pmol/μl，适当离心混合均匀。

1.2基因扩增

在冰上按表2配制反应体系，混匀后放入pcr仪，34条引物的相邻引物之间有17bp反向互补，每条引物中间有25bp未互补序列(18-42bp位置)，34条引物涵盖了plin2基因的全长。将34条引物混合后经过退火处理(55℃，1min)，相邻引物的17bp序列互补配对。中间未配对的25bp序列，在高保真酶的作用下序列被补齐，从而构成完整的双链plin2基因的全长序列。在pcr仪上经过25个循环扩增，plin2基因得到扩增，pcr扩增程序见表3。

表2pcr扩增反应体系

表3pcr扩增反应条件

1.3扩增片段的电泳检测以及回收

pcr扩增后利用1.5％琼脂糖电泳30min，然后比照dnamarker大小，在紫外灯下回收目的条带，然后利用胶回收试剂盒回收目的基因plin2条带。

1.4载体与目的基因的酶切

表4酶切体系

将回收的plin2基因片段和pcdna3.1-egfp载体分别按上述表4准备反应体系，然后在37℃酶切1-2h；将酶切产物利用1.5％的琼脂糖电泳检测并利用胶回收试剂盒回收酶切后的基因片段和载体片段。

1.5载体与目的基因的连接：将酶切后的载体片段与plin2基因片段按如下体系配制反应体系表5，并放于16℃连接1h。

表5连接体系

1.6转化

将要经t4连接酶连接后的产品加入到装有top10感受态细胞的管中(50μl感受态细胞需要25ngdna)，体积应不超过感受态细胞的5％，轻轻旋转几次混匀内容物，冰浴30min。

将离心管混合物放入加温至42℃的循环水中，热激90s，不要摇动管。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。

每管加入200μlsoc液体培养基，用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到设置为37℃的摇床上，220rpm培养45min，使细胞复苏并表达质粒编码的抗性标记基因。

将适当体积(每个90mm平板达200μl)已转化的感受态细胞转移到含有相应抗生素的lb培养基上。倒置平板，于37℃培养箱中培养12～16小时。

1.7菌落pcr验证

待平板上长出菌落，随机挑取若干个，进行菌落pcr验证，检测转化子，初步筛选含有目的基因的菌落(阳性克隆)。

1.8测序验证,将阳性克隆送测序公司测序验证。

1.9转染用质粒扩增与提取：利用无内毒素质粒提取试剂盒，提取质粒，含有plin2基因片段的质粒为plin2-pcdna3.1-egfp。

1.10转染与筛选培育：采用脂质体转染技术将上述步骤1.9中获得的质粒载体plin2-pcdna3.1-egfp转染pk-15细胞系，并利用g418筛选。荧光显微镜下观察，当阳性细胞生长成克隆细胞团时，用微细玻璃针管将阳性细胞挑出单独培养，并最终获得pk-15/plin2细胞株，于2017年11月22日pk-15/plin2细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:c2017251。中国典型培养物保藏中心简称cctcc，是中国专利局指定的保藏机构，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，网址：www.cctcc.org,电话：027-68752319，email:cctcc@whu.edu.cn。在本发明公开后，不以赢利为目的的研究者可依法向保藏中心索取本微生物菌种再现本发明。

本发明公开的细胞株在制备pcv2病毒中的应用。

本发明所产生的pcv2病毒在制备pcv2病毒疫苗中的应用。

本发明中的质粒载体pcdna3.1-egfp可通过市售商业生物公司获得，如thremofisherscientificinc.等公司，pk-15细胞，pcv2病毒可通过市售商业生物公司或菌种保藏机构获得，如中国典型培养物保藏中心保藏有该细胞和病毒，研究者可向该中心索取。

本发明的优点

与现有技术相比较，本发明具有如下优点；

(1)培养的病毒效价大幅度提高，用本专利发明的基因重组细胞株培养的pcv2上清液病毒免疫荧光tcid50方法测定效价达到10^-7以上，较常规pk-15细胞培养的病毒液效价提高100倍以上。

(2)生产工艺的大幅度简化。现行技术用d-氨基葡萄糖处理感染pcv2后的pk-15细胞，使培养体系产毒能力快速提高。由于d-氨基葡萄糖对培养体系后续产毒有一定的影响，故其流程中必须加入弃去d-氨基葡萄糖，再用pbs溶液洗涤细胞几次等程序，在生产实际中，每增加一个程序，将意味着原材料、人力等成本按比例增加，每增加一个程序还意味着增加一次开启培养体系出入口，这将极大地增加污染的可能性，这也是导致目前pcv2疫苗生产成本高昂，市场价格较高的主要原因，尽管目前生产中也有直接将d-氨基葡萄糖加入维持液中培养产毒细胞，省去洗涤过程，但其对pcv2增值效果较经典程序大幅度降低，生产的产品质量也大幅度降低。本发明所制备的能大幅度提高pcv2培养效价的链球菌培养物制剂，则可直接配入培养病毒的维持液，无须经历更换培养基、洗涤等程序，因此将大幅降低生产成本。

(3)培养的纯度更高：普通细胞培养圆环病毒后收毒时需将细胞与病毒一起冻融，冻融收获的病毒液中所含的细胞碎片较多，影响病毒纯度与后续疫苗质量。而用本专利培养pcv2时只需收取上清液即可获得所需独家的病毒，上清液中细胞碎片较细胞冻融液少得多，因此病毒液较为纯净。

附图说明：

图1是plin2-pcdna3.1-egpf载体构建示意图

图2是pk-15/plin2细胞株的荧光显微照片

图3是载体酶切后目的基因电泳图

具体实施方式

下面结合具体的实施实例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

实施实例1猪plin2基因超表达的pk-15基因重组细胞株的制备

1、材料和方法

1.1种子培养物及主要试剂：

pk-15细胞,pcv2病毒：购自cctcc

pbs粉剂：市场购买、国产产品

胎牛血清：国产。

dmem培养基：购买hyclone公司产品。

胰蛋白酶：购自sigma公司产品。

载体：pcdna3.1-egfp购自biofeng公司

连接酶、内切酶：t4连接酶购自takara公司、nhei和aflii限制性内切酶购自neb公司。

1.2主要操作步骤及方法：

1.2.1引物设计与合成

根据客户提供的靶基因序列及克隆方式设计引物序列如表1：

用去离子水稀释合成好的引物至浓度为50pmol/μl，适当离心混合均匀。

1.2.2基因扩增

在冰上按表6配制反应体系，混匀后放入pcr仪，按表7所设程序进行pcr扩增。

表6pcr扩增反应体系

表7pcr扩增反应条件

1.2.3扩增片段的电泳检测以及回收

pcr扩增后利用1.5％琼脂糖电泳30min，然后比照dnamarker大小，在紫外灯下回收目的条带，然后利用胶回收试剂盒回收目的基因plin2条带。

1.2.4载体与目的基因的酶切

表8酶切体系

将回收的plin2基因片段和pcdna3.1-egfp载体分别按上述表8，准备反应体系，然后在37℃酶切1-2h；将酶切产物利用1.5％的琼脂糖电泳检测并利用胶回收试剂盒回收酶切后的基因片段和载体片段。

1.2.5载体与目的基因的连接：将酶切后的载体片段与plin2基因片段按如下体系表9配制反应体系，并放于16℃连接1h。

表9连接体系

1.2.6转化

将要经t4连接酶连接后的产品加入到装有top10感受态细胞的管中(50μl感受态细胞需要25ngdna)，体积应不超过感受态细胞的5％，轻轻旋转几次混匀内容物，冰浴30min。

将离心管混合物放入加温至42℃的循环水中，热激90s，不要摇动管。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。

每管加入200μlsoc液体培养基，用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到设置为37℃的摇床上，220rpm培养45min，使细胞复苏并表达质粒编码的抗性标记基因。

将适当体积(每个90mm平板达200μl)已转化的感受态细胞转移到含有相应抗生素的lb培养基上。倒置平板，于37℃培养箱中培养12～16小时。

1.2.7菌落pcr验证

待平板上长出菌落，随机挑取若干个菌落，进行菌落pcr验证，检测转化子。

1.2.8测序验证

阳性克隆送至测序公司测序验证，同时平行样品进行酶切电泳验证。

1.2.9转染用质粒扩增与提取：利用无内毒素质粒提取试剂盒，提取质粒，此时含有plin2基因片段的质粒命名为plin2-pcdna3.1-egfp。

1.2.10转染与筛选培育：采用脂质体转染技术将上述步骤1.9中获得的质粒载体plin2-pcdna3.1-egfp转染pk-15细胞系，并利用g418筛选。荧光显微镜下观察，当阳性细胞生长成克隆细胞团时，用微细玻璃针管将阳性细胞挑出单独培养，并最终获得pk‐15/plin2细胞株。

1.2.11阳性细胞超表达产物测定：wb测定纯阳性细胞培养上清液及细胞内sfn含量，并与未转染的pk-15细胞进行比较。

2、结果：

2.1基因合成与转化质粒酶切目标产物的测序结果seqidno：35。

2.2转染阳性细胞纯化:将获得的转染阳性细胞通过克隆板进行单克隆，由一个细胞逐步扩大，并作种子保存。

实施例2：用pk‐15/plin2细胞株培养高效价pcv2及制备pcv2疫苗

2、材料和方法

2.1种子培养物及主要试剂

pk‐15/plin2细胞株：cctcc专利寄存。

pk-15细胞、pcv2种毒：购自cctcc

胎牛血清、pbs粉剂、d-氨基葡萄糖、pcv2专用pcr检测试剂盒：市场购买、国产产品

dmem培养基：购买hyclone公司产品。

胰蛋白酶：购自sigma公司产品

2.2主要操作步骤及方法

2.2.1宿主细胞制备：按照常规方法同时将普通pk-15细胞和pk‐15/plin2细胞株解冻，分别培养于克氏瓶中，传代至所需数量。

2.2.2病毒种毒制备：

用pbs稀释pcv2冻干粉剂，按同步接种法将稀释的病毒接种于pk-15细胞中，连续继代培养3代以上，免疫荧光tcid50监测其效价达到10^-5以上，收获病毒作为本专利技术毒种。

2.2.3病毒接种液配制与接种：用含10％胎牛血清的dmem培养基10倍稀释毒种后，按照常规同步接种方法将pcv2病毒接种于上述培养的2种细胞悬液中，继续培养24小时。

2.2.4病毒培养：病毒接种24小时后，将培养液更换为含2％胎牛血清的dmem维持液，继续培养72小时。

2.2.5收获病毒：将上述步骤④中2种细胞的培养上清液分别收获，做好标记，并分别进行pcv2毒价测定，记录备案，以供疫苗配制或其它后续使用。

2.2.6pcv2效价检测：将健康pk-15细胞消化吹散后分装于1.5mlep管中，每管分装0.9ml细胞悬液，按顺序编号排成2列，每列10个ep管，分别取上述步骤⑤收获的2种细胞培养的病毒液0.1ml加入不同列的第一管细胞悬液中，然后按照10^-1～10^-9进行梯度稀释，然后每个稀释梯度的细胞悬液分别接种96孔培养板的6个孔中，每孔100ul，24小时后用3mmol/l浓度的d-氨基葡萄糖维持液更换培养基，继续培养72小时，取出培养板，按照pcv2免疫荧光tcid50方法测定每个稀释度的病毒阳性孔数，推算病毒效价。

2.2.7病毒灭活与疫苗配制：取所需数量的上述步骤⑤收获的2中细胞培养的病毒液分别按常规方法进行灭活并配制成疫苗。

2.2.8疫苗免疫效果检测：选取体重约30kg的pcv2阴性猪9头，分为3组，第1组每头注射上述步骤⑦用plin2超表达细胞培养的病毒配制的疫苗5ml，第2组每头注射上述步骤⑦用普通pk-15细胞培养的病毒配制的疫苗5ml，第3组设为对照组，21天后测定各组血清中pcv2抗体水平。

2.3、结果：

2.3.1plin2基因超表达细胞与对照细胞培养pcv2效价对比，见表11

表11效价对比表

2.3.2pk-15/plin2细胞株与对照细胞培养pcv2制备的疫苗免疫后抗体检测结果，见表12

表12抗体检测表

序列表

<110>武汉市农业科学院

武汉市工程科学技术研究院

<120>猪plin2基因超表达的pk-15细胞株及扩增pcv2病毒的方法

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