一种制备同时敲除CD163基因和CD13基因的猪成纤维细胞的方法与流程

本发明涉及基因编辑领域，具体而言，涉及一种制备同时敲除cd163基因和cd13基因的猪成纤维细胞的方法。

背景技术：

猪生殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，prrs)是由猪生殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，prrsv)引起的以猪厌食、发热，妊娠母猪早产、晚期流产、死胎、弱胎和木乃伊胎等繁殖障碍及仔猪和生长猪的呼吸系统疾病和高度死亡性为主要特征的一种高度接触性传染病。因该病在临床上表现为耳部皮肤紫绀，所以又被称为“蓝耳病”。该病于1987年首次在美国被发现，紧接着于1989年在欧洲爆发，1995年底在中国大陆首次爆发，猪群的感染率高达90％，给养猪业带来了极大的经济损失，已成为世界范围内一种严重危害养猪业的传染病。

prrsv在体内主要感染分化良好的猪肺泡巨噬细胞(porcinealveolarmacrophages，pam)。prrsv侵染靶细胞的先决条件是与宿主细胞吸附，而宿主细胞表面的受体是完成这种吸附过程必不可少的。研究发现，硫酸乙酰肝素(heparinsulphate,hs)、唾液酸粘附素(sialoadhesin,sn)和cd163(clusterofdifferentiation163)分子是pam上存在的能与prrsv结合的三个重要受体分子。其中，cd163是一种富含半胱氨酸的清道夫受体，是典型的ⅰ型糖基化蛋白，也是一种巨噬细胞分化的抗原，分子大小是130kd，固又被称为m130蛋白。cd163起初是作为巨噬细胞和单核细胞的特异性鉴别蛋白质被认识的，在肺、脾脏、肝脏、淋巴集结和胸腺组织的巨噬细胞中都有表达。有研究表明，在prrsv非易感细胞系(bhk-21和pk-15)中转染表达cd163分子可以使这些细胞系感染prrsv并在细胞内产生子代病毒粒子，抗人cd163的抗体可以阻断prrsv的感染，表明cd163是该病毒的必需受体。cd163蛋白结构域srcr5是病毒感染细胞所必需的，而氨基端的4个srcr和胞质尾部是非必需的，其中srcr5结构域正是由cd163第7外显子所编码。因此，研究cd163基因修饰猪可以为cd163受体是否是prrsv感染过程中的重要角色提供必要证据。

猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea，ped)是一种由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)引起的高度传染性肠道疾病。任何年龄的猪均可感染，对仔猪影响尤其严重，病死率非常高，特别对于7日龄内的新生仔猪，在缺乏有效母源抗体下，死亡率可高达100％；对成年的怀孕母猪来说，感染后繁殖性能受到影响，如怀孕早期的母猪感染后会出现流产，受孕率降低；育肥猪感染后体重下降。

最近的研究表明pedv主要通过与猪小肠黏膜上皮细胞中的cd13(apn)结合感染仔猪。cd13作为pedv侵入细胞的必要结合受体意义重大，这为抗流行性腹泻病毒猪的新品种培育提供新思路，即通过敲除猪的apn基因来阻止pedv对猪的感染。

因此，建立一种可以快速、准确、有效地同时敲除猪cd163基因和cd13基因的方法，获取敲除猪cd163基因和cd13基因的猪成纤维细胞或猪在研究猪蓝耳病和猪流行腹泻腹泻以及抗病猪育种方面具有重要的意义。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种双基因敲除载体系统，所述基因敲除载体系统包括cd163基因敲除载体和cd13基因敲除载体，通过上述载体系统可以简单、快速、高效地定点敲除cd163基因和cd13基因。

本发明的第二目的在于提供一种制备同时敲除cd163基因和cd13基因的猪成纤维细胞的方法，通过所述方法可以简单、快速、高效地获得cd163基因和cd13基因纯合敲除且不携带任何外源标记的猪成纤维细胞，对研究猪蓝耳病、猪流行性腹泻以及猪的抗病育种具有重要意义。

本发明的第三目的在于提供根据上述方法制备而成的同时敲除cd163基因和cd13基因的猪成纤维细胞，所述猪成纤维细胞纯合敲除cd163和cd13基因且不携带外源标记，对研究猪蓝耳病、猪流行性腹泻以及猪的抗病育种具有重要意义。

本发明的第四目的在于提供一种制备同时敲除cd163基因和cd13基因的基因编辑猪的方法，通过该方法可以简单、高效地获得cd163基因和cd13基因纯合敲除基因编辑猪，对研究猪蓝耳病、猪流行性腹泻以及猪的抗病育种具有重要意义。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种双基因敲除载体系统，所述载体系统包括cd163基因敲除载体和cd13基因敲除载体，其中：

所述cd163基因敲除载体包括基因编辑载体骨架以及连接到该载体骨架上的一段dna片段，所述dna片段的核苷酸序列如seqidno：1-3任一项所示，优选地，如seqidno：1所示；

所述cd13基因敲除载体包括基因编辑载体骨架以及连接到该载体骨架上的一段dna片段，所述dna片段的核苷酸序列如seqidno：4-6任一项所示，优选地，如seqidno：4所示；

所述cd163基因敲除载体与所述cd13基因敲除载体的载体骨架选自crispr/cas9、crispr/cas9n、crispr/cpf1或crispr/c2c2。

传统的基因敲除系统主要以zfn和talen技术为基础，需要通过复杂的操作以及花费大量精力才能将靶基因敲除。而本发明上述基因敲除载体属于crispr基因编辑系统，利用crispr技术对靶基因进行定点敲除，从整体上极大地降低了基因敲除的操作难度，提高了敲除的效率；同时，本发明通过一次操作实现双基因编辑并且没有引入外源标记基因，具有效率高、精确性高、操作简单及安全性高的优势。另外一方面，本发明对针对cd163基因和cd13基因敲除的靶序列grna进行了优化，从多条靶序列中筛选获得敲除效率最高的靶序列，克服了crispr基因编辑系统在敲除过程中脱靶率高的缺陷，进一步提高打靶的效率，从而可以在短时间内快速获得敲除靶基因cd163基因和cd13基因的纯合子。

在一些实施方式中，所述cd163基因敲除载体与所述cd13基因敲除载体的载体骨架为crispr/cas9，优选地，所述crispr/cas9选自px330、px260、px334、px335、px458、px459、px461、px462、px551和px552，更优选地，所述crispr/cas9为px330。

本发明还涉及一种制备同时敲除cd163基因和cd13基因的猪成纤维细胞的方法，所述方法包括：

(1)构建上述双基因敲除载体系统；

(2)将所述基因敲除载体系统转入猪成纤维细胞中，鉴定获得纯合敲除cd163和cd13基因的单克隆细胞。

本发明上述方法以前述基因敲除载体为基础建立而成，通过所述方法可以简单、快速、高效地获得cd163基因和cd13基因纯合敲除且不携带任何外源标记的猪成纤维细胞，对研究猪蓝耳病、猪流行性腹泻以及猪的抗病育种具有重要意义。

在一些实施方式中，所述猪成纤维细胞为猪胎儿成纤维细胞。

在一些实施方式中，所述步骤(1)具体包括：将互补的寡核苷酸单链退火形成双链，与经过酶切的载体骨架连接，筛选获得阳性克隆即得cd163基因敲除载体，所述互补的寡核苷酸单链的序列如seqidno：7-8所示，或者seqidno：9-10所示，或者seqidno：11-12所示；将互补的寡核苷酸单链退火形成双链，与经过酶切的载体骨架连接，筛选获得阳性克隆即得cd13基因敲除载体，所述互补的寡核苷酸单链的序列如seqidno：13-14所示，或者如seqidno：15-16所示，或者如seqidno：17-18所示。

在一些实施方式中，所述步骤(2)具体包括：将所述cd13基因敲除载体和所述cd163基因敲除载体通过电转染的方式转入猪成纤维细胞，通过有限稀释法筛选单克隆细胞，并鉴定所述单克隆细胞系是否为cd163基因和cd13基因纯合敲除的阳性单克隆细胞。

在一些实施方式中，步骤(2)中所述鉴定具体包括：提取单克隆细胞的基因组dna，分别使用如seqidno：19-20和seqidno：21-22所示引物进行pcr扩增，并对扩增产物进行测序，根据测序结果判定所述单克隆细胞是否为cd163基因和cd13基因纯合敲除的阳性单克隆细胞；优选地，以seqidno：19-20为引物的所述pcr扩增的退火温度为60～62℃，循环数为32～38，更优选地，61℃，36个循环；以seqidno：21-22为引物的所述pcr扩增的退火温度为57～59℃，循环数为32～36，更优选地，58℃，34个循环。

本发明还涉及根据上述方法制备而成的cd163基因和cd13基因敲除的猪成纤维细胞。本发明上述猪成纤维细胞纯合地敲除cd163和cd13基因，且不携带外源标记基因，对研究猪蓝耳病、猪流行性腹泻以及猪的抗病育种具有重要意义。

本发明还涉及一种制备同时敲除cd163基因和cd13基因的基因编辑猪的方法，所述方法以上述猪成纤维细胞作为核移植供体细胞，将其细胞核移植入去核的卵母细胞，制备重组克隆胚胎并移植入母体内经妊娠获得同时敲除cd163基因和cd13基因的基因编辑猪。

本发明上述方法以前述cd163基因敲除和cd13基因敲除的猪成纤维细胞为基础建立而成，通过所述方法可以快速、简单、高效地获得cd163基因敲除和cd13纯合敲除的基因编辑猪，对研究猪蓝耳病、猪流行性腹泻以及猪的抗病育种具有重要意义。

在一些实施方式中，所述方法还包括对所述基因编辑猪进行鉴定的步骤，所述鉴定的步骤包括：提取猪的基因组dna，使用核苷酸序列如seqidno：19-20和seqidno：21-22所示的上下游引物对提取的dna基因组进行扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳或测序，根据电泳或测序结果确定所述猪是否已经将cd163基因和cd13基因敲除，优选地，以seqidno：19-20为引物的所述pcr扩增的退火温度为60～62℃，循环数为32～38，更优选地，61℃，36个循环；以seqidno：21-22为引物的所述pcr扩增的退火温度为57～59℃，循环数为32～36，更优选地，58℃，34个循环。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明采用crispr基因编辑系统，以及如seqidno：1-6所示dna序列作为靶位点，构建cd163基因和cd13基因的载体系统，以该基因敲除载体系统为依托建立一种制备同时敲除cd163基因和cd13基因的猪成纤维细胞、基因编辑猪的方法。上述载体系统和方法具有降低基因操作难度、提高敲除效率，在短时间内快速将cd163基因和cd13基因敲除的优点。而通过上述载体和方法制备而成的cd163基因和cd13基因敲除的猪成纤维细胞或基因编辑猪，其cd163基因和cd13基因为纯合敲除，且所述猪成纤维细胞或基因编辑猪中不带有外源标记，可以为猪蓝耳病和猪流行性腹泻提供研究平台，同时具有极高的育种价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为px330载体骨架图；

图2为部分双基因同时敲除细胞系的基因型。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下述实施例中的猪胎儿成纤维细胞(porcineembryonicfibroblast，pef)按照如下方法制备：将大白猪35日龄胚胎，去除胎儿的头、尾、四肢、内脏和骨头，并将血液清理干净。用弯头眼科剪持续剪切胎儿30min保证充分剪碎，将剪碎的胎儿组织用剪头的蓝枪头吸取到15ml离心管中，加入5ml完全培养基，自然沉降数分钟后除去上面溶液，并在下层组织块中加入几滴胎牛血清，用尖端1cm处弯曲的15cm玻璃巴氏管吸出，平铺于两个t75培养瓶中，瓶底朝上放置，并在对侧加入15ml全培养液，于6-8h后小心翻转培养瓶，将组织块浸入培养液中，每两天换一次液，待细胞长满t75培养瓶后冻存备用。其中，大白猪为中国农业科学院北京畜牧兽医研究所基地猪场饲养的猪。

实施例1靶向cd163基因和cd13基因的crispr/cas9打靶载体的构建

1、首先锁定编码猪cd163基因的外显子和cd13基因的外显子为打靶区域，利用软件分别设计多个针对cd163和cd13的grna，即打靶位点。其中，针对cd163的打靶位点分别为cd163-grna1：ggaaacccaggctggttgga(seqidno：1)；cd163-grna2：ggaggggacattccctgctc(seqidno：2)和cd163-grna3：ggtcgtgttgaagtacaaca(seqidno：3)。针对cd13的打靶位点分别为：cd13-grna1：gcatcctcctcggcgtgg(seqidno：4)；cd13-grna2：caagggattctacatttcca(seqidno：5)和cd13-grna3：ttctacatttccaaggccct(seqidno：6)。

2、根据上述grna序列合成互补配对的寡聚核苷酸，如下表所示，小写字母为酶切位点。

表1与grna序列互补配对的寡核苷酸

3、构建靶向cd163基因和cd13基因的crispr/cas9打靶载体，

px330载体骨架如图1所示。具体构建方法如下：

(1)将表1合成的6对寡聚核苷酸分别在98℃条件下处理10min，自然冷却至室温后进行退火；

(2)用限制性内切酶bbsi对含有cas9序列的px330骨架载体在37℃条件下酶切2h，切胶回收线性化片段；

(3)之后，将线性化片段与退火后的寡聚核苷酸在16℃连接1h，随后转化top10或dh5α感受态细胞，涂布于含氨苄的lb平板生长；

(4)挑取单菌落扩大培养并测序，测序引物为u6-fwd。序列正确，进行扩大培养；

(5)用质粒去内毒素大提试剂盒(endofreeplasmidmaxikit)提供的方法，提取质粒，所提的质粒用于细胞的转染。

实施例2同时敲除cd163基因和cd13基因的大白猪胎儿成纤维细胞系的建立

1、细胞转染

转染前一天将原代大白猪胎儿成纤维细胞复苏至6cm平皿中，当细胞达到70-80％汇合度时即可进行细胞转染。转染步骤严格按照basicprimaryfibroblastsnucleofectorkit(lonza)试剂盒说明书进行操作。

2、打靶效率的检测

电转染后的细胞培养48h后，一部分用于铺板，另外收集部分细胞，提取细胞基因组，进行pcr扩增，以检测打靶效率。结果表明：cd163基因3个grna的打靶效率分别为9％、5％和4％；cd13基因3个grna的打靶效率分别为17％、12％和7％。选取效率最高的两个grna进行后续实验，并将这两个载体分别命名为px330-cd163和px330-cd13。

以提取的细胞基因组为模板，用premixtaqdna聚合酶进行pcr，所述pcr扩增引物如下所示：

其中cd163基因的引物为cd163-f：5’-aagcccactgtaggcagaa-3’(seqidbo：19)和cd163-r：5’-gtggtttccctcctgggg-3’(seqidbo：20)。扩增条件为95℃，5min；95℃，30s；61℃，30s；72℃，30s；72℃，10min；36个循环，2％琼脂糖凝胶电泳观察条带。

其中cd13基因的扩增引物为cd13-f:5’tacccagttcagtgaccttcgtc3’(seqidbo：21)和cd13-r:5’agaagaacaagaatgccgagca3’(seqidno：22)。扩增条件为95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，30s；72℃，10min；34个循环，2％琼脂糖凝胶电泳观察条带。

3、阳性单克隆细胞系的筛选

电转48h后细胞汇合度大约为90％左右时以适宜的密度铺板，每3天更换一次培养液。铺板后的细胞大约培养10天左右，可以观察到合适大小的克隆点形成。将单克隆细胞进行扩大培养，同时取部分细胞用于提取基因组鉴定基因型。

4、阳性单克隆细胞系的鉴定

对所挑取的细胞单克隆进行鉴定：以提取的细胞基因组为模板，用premixtaqdna聚合酶进行pcr。

其中cd163基因的扩增片段为300bp，引物为cd163-f：5’aagcccactgtaggcagaa3’(seqidno：19)和cd163-r：5’gtggtttccctcctgggg3’(seqidno：20)。扩增条件为95℃，5min；95℃，30s；61℃，30s；72℃，30s；72℃，10min；36个循环。

cd13基因扩增出的目的片段为286bp，引物为forwardprimer:5’tacccagttcagtgaccttcgtc3’(seqidno：21)和reverseprimer:5’agaagaacaagaatgccgagca3’(seqidno：22)。扩增条件为95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，30s；72℃，10min；34个循环。

2％琼脂糖凝胶电泳观察条带，pcr产物送北京天一辉远公司测序，根据测序结果，筛选双基因同时发生移码突变的细胞系用作核移植时的供体细胞。

5、实验结果

测序结果显示，我们成功的获得了多株cd163基因和cd13基因都敲除的猪胎儿成纤维细胞系，其中部分双等位基因敲除细胞系基因型如图2所示。

实施例3体细胞核移植技术制备同时敲除cd163和cd13基因的基因编辑猪的方法

以实施例2获得的阳性细胞作为核移植供体细胞，以体外成熟40h的青年猪卵母细胞为核移植受体细胞，将核移植供体细胞移入去核的卵母细胞，经电融合与激活，构建成重组克隆胚胎，挑选发育状态良好的克隆重组胚胎用手术法移入自然发情的经产大白母猪子宫内进行妊娠,手术法胚胎移植步骤为呼吸机麻醉，并伴有2％的水合氯醛维持麻醉，在手术架上仰卧保定,腹中线做一个长约10cm的手术切口,曝露卵巢、输卵管及子宫,用胚胎移植玻璃管沿输卵管伞部进入约5cm，将发育状态良好克隆重组胚胎移植到输卵管壶腹部－峡部结合处。胚胎移植后，技术人员注意观察其返情情况，定期用b型超声波检查受体母猪妊娠情况。

实验结果：成功获得同时敲除cd163基因和cd13基因的基因编辑猪。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110>山东蓝思种业股份有限公司

<120>一种制备同时敲除cd163基因和cd13基因的猪成纤维细胞的方法

<160>22

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

ggaaacccaggctggttgga20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>2

ggaggggacattccctgctc20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>3

ggtcgtgttgaagtacaaca20

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列()

<400>4

gcatcctcctcggcgtgg18

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>5

caagggattctacatttcca20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>6

ttctacatttccaaggccct20

<210>7

<211>24

<212>dna

<213>人工序列()

<400>7

caccggaaacccaggctggttgga24

<210>8

<211>24

<212>dna

<213>人工序列()

<400>8

aaactccaaccagcctgggtttcc24

<210>9

<211>24

<212>dna

<213>人工序列()

<400>9

caccggaggggacattccctgctc24

<210>10

<211>24

<212>dna

<213>人工序列()

<400>10

aaacgagcagggaatgtcccctcc24

<210>11

<211>24

<212>dna

<213>人工序列()

<400>11

caccggtcgtgttgaagtacaaca24

<210>12

<211>24

<212>dna

<213>人工序列()

<400>12

aaactgttgtacttcaacacgacc24

<210>13

<211>22

<212>dna

<213>人工序列()

<400>13

caccgcatcctcctcggcgtgg22

<210>14

<211>22

<212>dna

<213>人工序列()

<400>14

aaacccacgccgaggaggatgc22

<210>15

<211>24

<212>dna

<213>人工序列()

<400>15

cacccaagggattctacatttcca24

<210>16

<211>24

<212>dna

<213>人工序列()

<400>16

aaactggaaatgtagaatcccttg24

<210>17

<211>24

<212>dna

<213>人工序列()

<400>17

caccttctacatttccaaggccct24

<210>18

<211>24

<212>dna

<213>人工序列()

<400>18

aaacagggccttggaaatgtagaa24

<210>19

<211>19

<212>dna

<213>人工序列()

<400>19

aagcccactgtaggcagaa19

<210>20

<211>18

<212>dna

<213>人工序列()

<400>20

gtggtttccctcctgggg18

<210>21

<211>23

<212>dna

<213>人工序列()

<400>21

tacccagttcagtgaccttcgtc23

<210>22

<211>22

<212>dna

<213>人工序列()

<400>22

agaagaacaagaatgccgagca22