一种改良的肝癌转移细胞胞体和突出的分离方法与流程

本发明具体涉及分子生物
技术领域：
，具体涉及一种改良的肝癌转移细胞胞体和突出的分离方法。
背景技术：
：肝癌是男性第五大常见癌症、女性第九大常见癌症，也是世界上癌症相关死亡的第二大原因。而肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，hcc）占到了肝癌中的75%。由于hcc起病隐匿，早期临床症状不明显，导致早期发现及诊断的难度较大，患者确诊时多属中晚期；而放化疗、肝移植等现行治疗手段对中晚期患者达不到应有疗效；且由于hcc的高侵袭转移能力，术后复发情况较普遍，患者的5年总体生存率仍然很低，从24%到41%不等。如何阐明hcc转移复发的机制从而进行针对性的治疗成为了目前临床上亟待解决的问题。hcc的发生和发展是一个典型的多阶段过程：首先是肝脏组织在外界刺激下（b型肝炎病毒（hbv）或丙型肝炎病毒（hcv）感染、黄曲霉毒素b1的摄入量或酒精滥用等）发生慢性肝炎或肝硬化，然后在经历一系列增生和不典型增生阶段后，最终获得肝内转移和远端转移的恶性表型。肿瘤的浸润转移是指肿瘤细胞脱离其原发部位，向其它部位传播，进而浸润正常组织，并经过淋巴道、血管或体腔及其它方式，转运到继发的靶组织或器官，从而继续增殖生长，形成与原发肿瘤相同性质的继发肿瘤的过程。细胞开始形成局部浸润和远处转移能力是恶性肝肿瘤早期特有的性质，因此研究肝肿瘤细胞浸润和转移初期机制对临床诊疗有十分重要的意义。而肝癌的进展涉及到很多调控细胞周期、细胞生长、细胞凋亡、细胞迁移的关键基因。boyden小室，最初由boyden用于对白细胞和巨噬细胞趋化性的分析，后经过改良用于肿瘤细胞运动性、侵袭性等的测定，用于不同的迁徙反应细胞。boyden小室由上、下两个室组成，两室中间由带孔的滤膜分隔，亦可用鸡胚尿囊膜、人胚胎羊膜等分隔。待测细胞放在上室，其运动性通过测量滤膜上层到运动到最远的细胞之间的距离而确定；亦可计数在滤膜不同平面上细胞数、滤膜底部的细胞数或是另一张在下室的滤膜上细胞数。当上、下室中均为生理盐水时，细胞运动为随机运动。若上、下室中均加以同浓度的化学趋化剂或生长因子等，可以观察加强的细胞无定向运动。当两室中的化学驱化剂存在梯度时，该方法可以观察细胞定向运动。在一般情况下，细胞被放置在上部小室，允许迁移通过膜孔进入下室，其中趋化剂的存在。经过适当的培养时间，迁移到膜另一侧的细胞数量可计算。因此，boyden小室通过细胞迁移实验也被称为过滤膜迁移实验、trans-well迁移实验，或趋化试验。技术实现要素：为了解决现有技术的不足，本发明的提供了一种改良的肝癌转移细胞胞体和突出的分离方法，利用boyden小室分离肝癌转移细胞的突出与胞体，将进一步阐明肝癌细胞浸润转移的机制，可以为恶性肝细胞肿瘤预警、诊断、治疗和药物筛选提供新途径和新靶标。本发明采用的技术解决方案是：一种改良的肝癌转移细胞胞体和突出的分离方法，所述的肝癌转移细胞胞体和突出的分离方法采用boyden皿法分离突出和细胞体，具体步骤如下：（1）将六孔型1.0μm孔径的悬挂式细胞培养皿放入到浓度为10μg/mli型胶原蛋白中37℃恒温静置2小时；（2）接着把孵有i型胶原蛋白的悬挂式细胞培养皿转移到不含i型胶原蛋白溶液的六孔板孔中，并置于4℃条件下过夜处理；（3）然后把肝癌细胞接种到孵有i型胶原蛋白的1.0μm孔径悬挂式细胞培养皿上，37℃静置24~30小时；（4）分离细胞突出：先用1×pbs洗涤，倒立悬挂式细胞培养皿，用移液枪吸去悬挂式细胞培养皿上侧的残留培养基，接着用浸有总rna抽提试剂trizol的细胞刮铲来搜刮悬挂式细胞培养皿上侧的细胞突出；（5）分离细胞体rna：当分离细胞体中的rna时，平放悬挂式细胞培养皿，用移液枪吸去悬挂式细胞培养皿里的培养基，然后用浸有总rna抽提试剂trizol的细胞刮铲来搜刮悬挂式细胞培养皿内侧的细胞体。所述的步骤（2）与步骤（3）之间还包括以下步骤：a、将肝癌细胞进行饥饿过夜处理，用0.5%胰酶edta溶液对贴壁的肝癌细胞进行消化分离，待显微镜下观察到细胞收缩变圆后，吸走胰酶，接着用含有10%胎牛血清的新鲜dmem培养基终止消化；b、经1500rpm离心10min，将肝癌细胞和培养基去除上清液后用无血清培养基重悬混匀。本发明的有益效果是：本发明提供了一种改良的肝癌转移细胞胞体和突出的分离方法，利用boyden小室分离肝癌转移细胞的突出与胞体，从亚细胞结构出发，运用改良的boyden小室法分离肝癌转移细胞胞体和突出，利用western-blot、rna染色、免疫荧光等技术验证分离结果。可用于研究hcclm3肝癌细胞胞体与突出中差异表达的情况、筛选出与hcc浸润转移过程有关的微小rna，为后续hcc肿瘤生物标记物的研究、相关临床诊疗提供新的思路。附图说明图1为hcclm3细胞株免疫荧光实验结果图。图2为hcclm3细胞株etbr染色实验结果图。图3为boyden细胞培养皿结构示意图。图4为免疫荧光和免疫印迹法检验boyden培养皿分离法有效性荧光图。图5为ladder质检峰图。图6为hcclm3肝癌转移细胞突出质检峰图。图7为hcclm3肝癌转移细胞胞体质检峰图。具体实施方式现结合具体内容对本发明进行进一步说明，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。材料和方法实验试剂与仪器细胞系：高转移肝癌细胞系hcclm3为本实验室液氮中保存，最初均购于中国科学院上海细胞库。试剂（1）dulbecco’smodifiedeagle’s培养基（dmem）；（2）胎牛血清来自lifetechnologies公司（美国）；（3）蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂来自罗氏生物公司（中国）；（4）细胞培养用胰酶细胞消化液、细胞培养用青霉素/链霉素溶液（100x）、depc水(dnase、rnasefree)(500ml)、免疫染色固定液、抗荧光淬灭封片液、1mtris-hcl，ph6.8、1.5mtris-hcl，ph8.8细胞培养用磷酸盐缓冲液（pbs）来自碧云天生物技术公司（上海）；（5）i型胶原蛋白来自sigmaaldrich公司（中国）；（6）boyden悬挂式细胞培养皿（透明pet膜1.0um孔径）来自millicell公司（美国）；（7）anti-histoneh3抗体、tubulin抗体、β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔igg(h+l)、rnasea来自碧云天生物技术公司（上海）；（8）血细胞计数板来自上海求精生化试剂仪器有限公司；（9）细胞刮刀来自美国corning公司；（10）盖玻片来自江苏世泰实验器材有限公司；（11）表面带正电荷粘附载玻片来自江苏世泰实验器材有限公司。试剂配置（1）细胞培养液：以10%体积比将胎牛血清加入到dmem或rpmi-1640培养基中，混合均匀，置4℃冰箱中保存；（2）10×pbs缓冲液：分别称取2gkcl，80gnacl，2.36gna2hpo4·12h2o，2gkh2po4，加入800ml超纯水中进行溶解。溶解后，将ph调至7.2-7.4，然后补加超纯水至1000ml，高压蒸汽灭菌后置于4℃冰箱中保存；（3）1×tris-glycine电泳缓冲液：量取100ml的10×tris-glycine电泳缓冲液，加去离子水定容至1l，室温中保存；（4）10×tris-glycine电泳缓冲液：称取30.2gtris，188gglycine，10gsds。加入约800ml的去离子水，搅拌混匀溶解。加去离子水定容至1l，室温保存；（5）5×sds-page上样缓冲液：量取1.25ml1mtris-hcl（ph6.8），2.5ml甘油，称取0.5gsds，25mg溴酚兰，加入去离子水混匀溶解后定容至5ml。分成小份（500μl）分装后，于室温保存。使用前加入终浓度为500mm的dtt。（6）1×转膜缓冲液：量取100ml的10×转膜缓冲液，200ml的无水甲醇，加去离子水定容至1l，室温中进行保存；（7）10×转膜缓冲液：称取24.22gtris，112.6gglycine，加去离子水定容至1l，室温中进行保存；（8）10×tbs：称取24.23gtris，80.6gnacl，加入约800ml的去离子水，调节ph至7.6，加去离子水定容至1l，室温中进行保存；（9）1×tbst：量取100ml的10×tbs，2.5ml的tween-20，加去离子水定容1l，室温中进行保存；（10）0.3%pbst：量取适量的1×pbs把30%tritonx-100溶解成0.3%的tritonx-100溶液就是0.3%pbst溶液；（11）3%（w/v）bsa：称取3gbsa，加入100ml1×pbs，0.5mltritonx现用现配；（12）5%（w/v）bsa：称取2.5gbsa，加入50ml1×tbst，现用现配；（13）细胞固定a液：量取2ml10×pbs，18ml4%甲醛，再加0.34ml30%tritonx-100溶液混匀，即配即用；（14）20ｘssc(ph=5.3)：nacl175.39g，枸橼酸钠88.29g，纯水900ml，体积1000ml，彻底混匀用1m的hcl室温下调整ph为5.3，0.45μm的滤器除菌；（15）2ｘssc/50%甲酰胺：20ｘssc，ph5.3~5ml，纯水20ml；（16）甲酰胺：25ml，终体积50ml，彻底混匀，室温下用1m的naoh调整ph到7.54~0.2，0.45μm的滤器除菌；（17）pbs缓冲液：医用无菌注射器量取10×pbs缓冲液50ml，用0.22μm滤器过滤除菌，加入超纯水400ml。调ph至7.2-7.4后，补加超纯水至500ml，高压蒸汽灭菌后置于4℃冰箱中进行保存。实验仪器本文中使用仪器如表2所示表实验仪器表hcclm3细胞培养1.1hcclm3细胞的传代培养（1）关闭紫外，打开风机，点燃酒精灯；（2）75%酒精擦拭超净工作台、双手以及所用器械、试剂瓶、细胞培养皿；（3）细胞用2mlpbs洗2遍；（4）加入胰酶2~3ml消化1.5min；（5）弃掉胰酶，加入2ml全培终止消化，吹下贴壁的细胞，并吹打20次；（6）根据需要留适量的细胞悬液在新的培养皿，加入完全培养基7~10ml，吹打混匀；（7）放入co2培养箱继续培养。1.2hcclm3细胞的换液（1）弃掉旧的培养液；（2）用2mlpbs洗1~2遍；（3）加入完全培养基7~10ml，吹打混匀；（4）放入co2培养箱继续培养；1.3细胞冻存：（1）观察并取融合率达到80-90%的肝癌贴壁细胞，按照传代方法对细胞进行处理；（2）待去血清加胰酶消化作用后加入新鲜培养基终止消化，1500rpm离心10min后去除培养基上清液；（3）加入事先配置好的细胞冻存液1ml，用移液器缓慢吹打几次，将吹匀的细胞悬液转移至冻存管中，并放入冻存盒中；（4）将冻存盒放入-80°c冰箱过夜，12h后放入液氮罐中保存。细胞复苏：（1）将从液氮罐中取出的冻存管立刻放入到装有37°c去离子水的烧杯中；（2）不断缓慢晃动冻存管，直至里面冻存物全部融化；（3）用移液器把细胞液从冻存管转移到离心管，1000rpm离心10min后去除冻存液；（4）加入1ml新鲜培养基，吹匀后移入含4ml培养基的100mm新培养皿中；（5）晃匀后，放入37℃恒温培养箱中培养。皿法分离突出和细胞体（1）六孔型1.0μm孔径的悬挂式细胞培养皿放入到浸润有浓度为10μg/mli型胶原蛋白的培养皿中，二氧化碳培养箱恒温静置2小时；（2）接着把孵有i型胶原蛋白的悬挂式细胞培养皿转移到不含i型胶原蛋白溶液的六孔板中，并置于4℃冰箱过夜处理；（3）肝癌细胞培养好后用无血清培养基进行饥饿过夜处理，用胰酶对贴壁肝癌细胞进行消化分离，待显微镜下观察到细胞收缩变圆后，吸走胰酶，接着用含有10%胎牛血清的新鲜dmem培养基终止消化；（4）1500rpm离心10min，去除上清液后用无血清培养基重悬混匀；（5）然后把细胞转移到孵有i型胶原蛋白的1.0μm孔径悬挂式细胞培养皿上，37℃二氧化碳培养箱中静置24~30小时；（6）分离细胞突出和细胞体rna，先用1×pbs洗涤，倒立boyden培养皿，用移液枪吸去boyden培养皿上侧的残留液体，接着用浸有trizol的细胞刮铲来搜刮boyden培养皿底部上侧的细胞突出；（7）当分离细胞体中的rna时，平放boyden培养皿，用移液枪吸去boyden培养皿里的培养基，然后用浸有trizol的细胞刮铲来搜刮boyden培养皿内侧的细胞体。（注意：每个boyden培养皿只能用来收集一次细胞突出或细胞体，以避免细胞突出和细胞体中的rna互相污染）。细胞预处理（1）细胞培养至70-80%的汇合度后，用移液器吸除去培养皿上的培养基，利用1×pbs溶液进行冲洗，然后去尽1×pbs残液；（2）用含有50mmtris-hcl（ph7.4），150mmnacl，0.1%np40的ripa细胞蛋白裂解液和适量的蛋白酶抑制剂组成的混合溶液来浸润皿底，再用细胞刮刮下；（3）超声3s，暂停10s，共3个循环；（4）冰上放置30min，每隔5min颠倒振荡数次。20000g，4ºc离心10min；（5）取上清转入ep管，置冰上待用；（6）若是测量对比细胞突出和细胞体中相应蛋白的含量，则用boyden皿法分离细胞突出和细胞体后，再用含细胞裂解液的细胞刮分别刮下收集于ep管中保存待用。细胞蛋白提取（1）取出预处理细胞（60mm细胞培养皿），吸去上清，用2ml1×pbs溶液洗涤3次；（2）加入200μlnp-40蛋白裂解液，置冰上裂解5min，用细胞刮刀提取细胞蛋白质；（3）14800r4℃离心30min，吸取上清液并记录上清体积；（4）取5μl上清液，用bca蛋白质定量试剂盒进行蛋白浓度定量，剩余蛋白分装后于-20°c冰箱中保存备用，避免反复冻融。在提取细胞全蛋白的整个过程中所有使用的物品及试剂都需要预冷，防止蛋白降解。细胞蛋白质浓度测定（1）根据样品的数目，每孔样品配置200μl的a-b混合液（a：b=49：1）；（2）利用pbs、0.5mg/ml的标准蛋白、bca工作液配置0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg/μl的标准蛋白浓度梯度及未知蛋白体系，置37℃恒温箱中孵育30min；（3）在酶标仪中测量562nm处的吸光度值，根据测量结果记录未知蛋白浓度。免疫印迹实验（westernblot）（1）根据bca法蛋白定量的结果等量上样（25～30μg），进行浓度为7.5–15%的tris-甘氨酸sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳，定压70v电泳30min左右至其过分离胶，定压110v电泳70min左右；（2）电泳结束后小心取出凝胶，同时剪裁与凝胶大小一致的pvdf膜，浸泡于无水甲醇中活化2min；（3）按照湿转方法利用转膜筛孔板制成海绵、滤纸、凝胶、pvdf膜、滤纸、海绵的“三明治”结构，全程用玻璃棒压平防止气泡产生，冰上300ma恒流转膜70min；（4）转膜结束后取出pvdf膜，接着浸泡于丽春红染色液中，观察转膜效果；（5）tbst洗涤pvdf膜，去除去丽春红，加入含5%脱脂牛奶中室温封闭2h；（6）封闭结束后，用tbst洗涤pvdf膜上残留封闭液，分别用相应一抗进行孵育，4°c过夜；（7）回收一抗并用tbst溶液洗涤pvdf膜5次，每次5分钟，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠或抗兔的抗体（1：2000稀释)，室温孵育1小时；（8）pvdf膜用tbst彻底清洗3次，每次10min，加入发光底物（claritytmwesterneclsubstrate试剂盒），用凝胶成像仪的化学发光系统进行曝光，如果条带不够清晰，可以适当延长曝光时间。提取（1）通过boyden培养皿法分离的细胞突出和细胞体分别提取rna，提分离的细胞突出rna时，倒立boyden培养皿，用移液枪吸去boyden培养皿底部上侧的残留液体，接着用浸有trizol的细胞刮铲来搜刮皿上侧的细胞突出；（2）当分离细胞体中的rna时，平放boyden培养皿，用移液枪吸去boyden培养皿里的培养基，然后用浸有trizol的细胞刮铲来搜刮皿内侧的细胞体；（3）将上述第1步搜刮的boyden培养皿上侧细胞突出和内侧细胞体的rna分别转移入无rnaseep管，加入氯仿(trizol：氯仿=5：1），迅速剧烈摇匀15s至其呈乳状，然后室温静置3min；（4）接着把ep管放到高速冷冻离心机中12000g，4℃离心15min；（5）吸上层液于另一1.5ml无rnaseep管，加入异丙醇（v：v=1：1)，混匀，使得rna充分沉淀，-20℃放置20min；（6）接着继续12000g，4℃离心10min，移去上清液，加入500μl75%乙醇洗涤管壁和沉淀；（7）12000g，4℃离心10min；（8）去除上清液，再瞬离，去尽上清液，将ep管倒置于纸巾并静置1~2min，待沉淀变至半透明状；（9）加入15~20μldepc水来溶解提取的rna；（10）在nanodrop2000多功能检测仪上测浓度检测所提rna质量，并于-80℃冰箱中进行保存。（注意：rna提取过程中要注意使用rna专用枪头（无rnase)，穿干净实验服，佩戴口罩和手套。）rna染色（试剂4℃保存）（1）细胞生长至80%-90%进行传代，取细胞悬液20μl，再加入500μl全陪吹打混匀，加入放有爬片的24孔板；（每孔共计细胞悬液520μl）；（2）用去酶pbs清洗三次，置于摇床上，每次5min；（3）用4%多聚甲醛室温固定20min（去酶pbs配置）；（4）用去酶pbs清洗三次，置于摇床上，每次5min；（5）500μl去酶pbs溶解稀释5-12.5μlrnase加入实验组，500μl去酶pbs加入对照组，30min；（6）用去酶pbs清洗三次，置于摇床上，每次5min；（7）0.5%tritonx-100每孔500μl通透10min；（8）用去酶pbs清洗三次，置于摇床上，每次5min；（9）etbr染液染色处理15min（去酶pbs溶解）；（10）用pbst和pbs清洗三次，置于摇床上，每次5min；（11）细胞核dapi染色，室温5min；（12）用去酶pbs清洗三次，置于摇床上，每次5min；（13）载玻片上滴加4μl抗荧光淬灭剂；（14）指甲油封片；（15）共聚焦显微镜观察染色结果，4℃避光保存。免疫荧光（1）细胞生长至80%-90%进行传代，取细胞悬液20μl，再加入500μl全陪吹打混匀，加入放有爬片的24孔板；（每孔共计细胞悬液520μl）；（2）用去酶pbs清洗三次，置于摇床上，每次5min；（3）用4%多聚甲醛室温固定20min（去酶pbs配置）；（4）用去酶pbs清洗三次，置于摇床上，每次5min；（5）0.5%tritonx-100每孔500μl通透15min；室温500μl（6）用去酶pbs清洗三次，置于摇床上，每次5min；（7）加入免疫染色封闭液（0.5%bsa封闭液），室温摇床封闭90min，200μl每孔；（8）封闭液稀释一抗（1:100）；（9）标记载玻片c（对照组）、t（实验组）；（10）免疫组化笔在载玻片上画圈后，加上相应稀释的一抗（对照组200μl稀释的山羊抗兔igg，实验组200μl稀释的兔源tubulin一抗）；（11）放入湿盒，4℃孵育过夜；（12）过夜后，回收一抗；（13）用pbst和pbs清洗三次，置于摇床上，每次5min，避免干燥；（14）避光，二抗稀释液（1:100）稀释二抗，每个爬片加250μl稀释过的二抗，避光室温孵育90min；（15）弃去二抗，用pbst和pbs清洗三次，置于摇床上，每次5min；（16）将爬片转入新孔，每孔应加10μldapi,正面朝下，扣上爬片，孵育5min;（17）pbs清洗3次，干净玻片上做标记，每片滴加5μl抗荧光淬灭剂，盖上爬片，指甲油封片，银光显微镜观察。结果检验肝癌细胞突出中的rna癌细胞在形成其转移侵袭能力之前会形成细胞突出，位于细胞突出里的rna常与转移侵袭的过程有关。为了能研究位于肝癌细胞突出部位的核苷酸，我们首先选取了肝癌高转移细胞株hcclm3来做免疫荧光实验，其中细胞质部分用α-tubulin来染色，细胞核部分用dapi来染色，结果如图1（a）、（b）和（c）所示。从上述高转移肝癌细胞株hcclm3的免疫荧光实验结果图可以看到，α-tubulin作为细胞骨架和细胞纤维的重要组成部分，广泛分布于肝癌细胞质当中，且能够较好地通过免疫荧光展现肝癌细胞的形态。从图1（a）和（c）观察到的细胞形态都有较为明显的细胞突出结构。此外，我们还通过加入rnase来设置对比实验来进行hcclm3肝癌细胞的etbr染色实验，实验结果如图2（a）和（b）所示。etbr对肝癌细胞的细胞质和细胞核都有较好的染色结果，包括在细胞体和细胞突出部位的核糖核酸和脱氧核糖核酸。图2（a）是未加rnase处理组，在etbr染色后展示了较完整的细胞形态；2（b）是加入了rnase后的对照组，可以观察到细胞质当中的etbr染色信号明显减弱，特别是细胞突出部位，表明细胞突出部位含有一定量的从细胞核运输过来的定位rna。分离肝癌细胞突出中的rna高转移癌细胞在转移过程中多具有细胞突起结构，细胞突出部位往往小于1μm，而细胞体部分的平均粒径大小为10~20μm，所以我们使用具有1.0μm孔径的悬挂式boyden细胞培养皿来分离细胞突出和细胞体。如图3所示，该boyden细胞培养皿包括两部分，上侧的细胞培养腔室和下侧的细胞培养腔室，中间由1.0μm孔径pet膜分隔，使得在上侧细胞培养腔室上培养的细胞仅有长出的细胞突出部分能够通过培养皿底层的pet膜孔径，从而便于后续的分离操作。在boyden细胞培养皿上侧传代培养细胞之前，先将1.0μm孔径的boyden悬挂式细胞培养皿放入到浸润有浓度为10μg/mli型胶原蛋白的培养皿中37℃恒温静置2小时，再过夜处理，使得培养皿pet膜的底层孵上胶原蛋白。细胞培养皿底层下侧孵育的胶原蛋白可以诱导肝癌细胞突出迁移到boyden细胞培养皿下侧培养腔室。我们用细胞质α-tubulin免疫荧光染色和细胞核dapi染色的方法来验证是细胞突出部位转移迁徙通过了pet膜上的小孔进入到boyden细胞培养皿下侧细胞培养腔室而不是整个细胞的转移。如图4（a）所示，boyden细胞培养皿上侧细胞体部分含有细胞质α-tubulin，而同样培养条件下的细胞培养皿另一侧被棉签抹去上侧细胞体后，在培养皿下侧仍然观察到了α-tubulin的染色（如图4（b）。但是相同培养条件下培养皿的细胞体被抹去后则在pet膜的下侧看不到有细胞核dapi染色的情况出现，如图4（c）和4（d）所示，表明了此boyden细胞培养皿能够较为有效地分离细胞体和细胞突出。此外，我们也通过westernblot实验来进一步证实了该boyden细胞培养皿法分离细胞突出和细胞体的有效性。组蛋白是由histoneh2a，h2b，h3和h4各两个分子组成的八聚体和与该八聚体相结合的dna构成了染色质的基本结构核小体(necliosome)。组蛋白的存在确保了基因组dna可以被相对致密而有序地堆放在细胞核中。在对分离的细胞突出和细胞体分别分别做histoneh3免疫印迹实验，发现只有在boyden细胞培养皿上侧的细胞体部分含有组蛋白h3（如图4（e）所示），再次佐证了细胞体在这个实验过程中没有发生从培养皿上侧到下侧的转移。分离细胞突出的过程中，先用1×pbs溶液洗涤boyden培养皿，接着把boyden培养皿倒立，用移液枪吸去boyden培养皿上侧的残留培养基，接着用浸有trizol的细胞刮铲来搜刮boyden培养皿上侧的细胞突出，转移到ep管中。当分离细胞体中的rna时，平放boyden培养皿，用移液器吸去boyden培养皿里的培养基，然后用浸有trizol的细胞刮铲来搜刮boyden培养皿内侧的细胞体，转移到ep管中。然后用agilent2100法对所提取的rna进行浓度和质量的检测，并构建文库上机测序。用该方法提取收集并检测高转移肝癌细胞株hcclm3的rna，所提rna质量都适合建库上机测序。所提rna样品检测结果序号样品名称样品类型浓度c(ng/μl)28s/18srin建库类型综合结果13hprna2141.79.3rna-seq等级123hbrna12001.89.5rna-seq等级1以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12