本发明属于内分泌学和分子药理学技术领域，具体涉及一种诱导小鼠胰腺导管细胞向胰岛β细胞分化的方法，特别涉及一种天然中药活性成分葛根素（puerarin）与exendin-4（一种glp-1r受体激动剂）联合应用在促进小鼠胰腺导管细胞向胰岛β细胞再生方面的新用途。
背景技术：
2型糖尿病与心血管疾病，肿瘤并列为发病率和死亡率最高的三大非传染性疾病。目前中国仅成年人中糖尿病患者数量已近1.14亿，是世界上糖尿病患者人数最多的国家。且中国存在大量未诊断人群和高比例糖尿病高危人群，估算糖尿病前期人群已达4.9亿，防治形势非常严峻。
β细胞衰竭是糖尿病致病机制的核心环节，促进β细胞再生、恢复患者的胰岛β细胞数量和功能是治疗糖尿病的有效策略。获得新生β细胞的方法主要有β细胞自身增殖、诱导胚胎干细胞或胰腺祖细胞分化、以及由胰腺组织其他细胞类型重分化等。研究表明胰腺组织中存在具有分化潜能的细胞，如胰腺导管细胞，此类细胞已被证实具有向β细胞分化的能力，是近年来糖尿病研究热点之一。建立有效诱导胰腺导管细胞向β细胞分化再生的技术方法具有重要意义。
中医药治疗糖尿病历史悠久，疗效确切。药食两用植物葛根被广泛应用于例如葛根芩连汤，玉泉丸等经典古方，用以治疗糖尿病及其并发症。葛根素是其主要活性成分，具有较好的降糖作用。我们在研究中发现，葛根素能够上调β细胞中胰高血糖素样肽受体（glp-1receptor，glp-1r）的表达水平。据此，我们进一步考察了葛根素与一种glp-1r受体激动剂exendin-4联用，是否具有诱导胰腺导管细胞向胰岛β细胞分化再生的作用，拟建立一种诱导小鼠胰腺导管细胞向胰岛β细胞分化的方法。
技术实现要素：
本发明的目的是建立一种诱导小鼠胰腺导管细胞向胰岛β细胞分化的方法。
本发明的技术解决方案：
一种以葛根素+exendin-4共培养小鼠胰腺导管细胞，从而诱导小鼠胰腺导管细胞向胰岛β细胞分化，实现β细胞再生的实验方法。本技术方案中葛根素+exendin-4共培养具有较好促进小鼠胰腺导管细胞向胰岛β细胞分化的作用，如表1及图1所示，其能够有效诱导胰岛β细胞特异转录因子pdx-1与胰岛素insulin基因在胰腺导管细胞中的表达，从而促进小鼠胰腺导管细胞向胰岛β细胞分化。
表1.葛根素对小鼠胰腺导管细胞中pdx-1与insulin表达的作用
本发明建立了一种诱导小鼠胰腺导管细胞向胰岛β细胞分化的实验方法，通过联合应用葛根素（50μm）+exendin-4（20nm）共培养，在实验室水平能够实现4%左右的胰岛素表达诱导率。exendin-4（艾塞那肽）是一种glp-1r激动剂类降糖西药，而我们的前期研究发现传统降糖中药葛根的主要活性成分葛根素具有增加glp-1r表达水平的作用。本发明证实两者联合应用能够有效地诱导小鼠胰腺导管细胞向胰岛β细胞分化，为中西药联合治疗糖尿病的合理性与有效性奠定基础。
附图说明
图1为荧光显微镜下培养的小鼠胰腺导管细胞团。在对照组（加入dmso）中，基本没有观察到pdx-1或insulin表达阳性的导管细胞。而在葛根素（50μm）+exendin-4（20nm）共培养7天的细胞中，能够观察到明显的pdx-1和insulin表达阳性的导管细胞，表明胰腺导管细胞向胰岛β细胞的成功分化。（ck19为导管上皮细胞标志性蛋白，染色为绿色；pdx-1或insulin染色为红色；dapi为细胞核染料，为蓝色）。
具体实施方式
实施例
1.小鼠胰腺导管细胞分离：采用histopaque1119密度梯度法分离小鼠胰腺导管细胞。spf级c57/bl6小鼠颈椎脱臼法处死，通过胆管向胰腺灌注预冷的胶原酶消化液（2mg/ml）约2ml，分离胰腺放入50mlfalcon离心管（预留2ml胶原酶消化液），37℃水浴振荡消化15分钟，当观察到胰腺组织已被分解为糜状，加入30ml预冷的hbss终止消化，hbss洗涤两次，4℃每次1200rpm离心2min。组织沉淀加入13ml的histopaque1119，振荡重悬沉淀，然后小心加入12ml预冷培养基，保持溶液界面清晰。4℃，2500rpm离心25min，离心设定无加速无骤停。离心结束后，离心管底部沉淀部分主要为胰腺导管细胞团。小心吸出胰腺导管细胞团，培养基洗涤两次后转移到6孔板中，置于5%二氧化碳细胞培养箱中培养。细胞培养基为dmem/f12培养基（10%胎牛血清）。
2.小鼠胰腺导管细胞培养分化实验：dmem/f12培养基中培养1-2天除去未贴壁死细胞。随后采用含葛根素50μm+exendin-4（20nm），1%胎牛血清的dmem/f12培养基诱导小鼠胰腺导管细胞分化，以dmso组为对照，每两天更换一次新鲜培养基。对照组与给药组各设3个复孔。培养7天后，采用免疫荧光染色实验方法检测小鼠胰腺导管细胞向胰岛β细胞分化的结果。
3.细胞免疫荧光染色鉴定小鼠胰腺导管细胞的分化：培养7天后，进行细胞免疫荧光染色实验签订细胞诱导分化的效果。步骤如下：
①培养细胞用pbs洗两次。
②加入新配置的4℃预冷的4%多聚甲醛pfa(inpbs)，4℃固定30min。
③在室温下，pbs洗去固定液，5min×3。④0.25%triton-100（inpbs)处理10min。
⑤室温下，pbs洗5min×2。
⑥在封闭液（blockingbuffer:5%ngs(normalgoatserum),1%bsa）中室温封闭1hr。⑦加入稀释过的一抗（1:50稀释），4℃冰箱中过夜。
⑧在室温下，pbst洗去一抗，10min×3。
⑨加入稀释过的二抗（1:200稀释），于湿盒中室温1小时。⑩在室温下，pbst洗去二抗，10min×3。
⑪加入含dapi的封片剂，避光4℃保存。
dapi为细胞核荧光染料。即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，能够与dna强力结合。阳性染色代表性图片见图1。分别计算每组3个复孔中pdx-1与insulin表达阳性细胞，通过dapi细胞核染色计数每孔总细胞数，以阳性细胞数/总细胞数计算比例。ck19抗体、pdx-1抗体、insulin抗体及荧光二抗均购自abcam公司，dapi染色试剂购自vectorlabs公司。