一种用于防治西洋参根腐病的多粘类芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明属于植物病害生物防治技术领域、微生物资源的开发与利用领域，特别涉及一种多粘类芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

西洋参(学名：panaxquinquefolius)是五加科人参属多年生草木植物，别名花旗参、洋参、西洋人参、americanginseng，原产于加拿大的大魁北克与美国的威斯康辛州，中国北京怀柔、山东文登与长白山等地也有种植。西洋参具有滋阴补气，宁神益智及清热生津，降火消暑的双重功效，应用广泛，市场需求很大。不过，西洋参连作障碍极其严重，同一块地连续种植西洋参时，往往病虫害严重，减产甚至绝产。研究发现，对西洋参威胁最大的根腐病主要是由镰刀菌(fusariumsp.)引起的，该菌同时也是香蕉、西瓜、黄瓜等作物的病原菌。

随着绿色农业理念的发展，国家对农作物农药残留的限量越发严格，西洋参种植管理过程中农药使用种类和范围受到极大限制，对镰刀菌最有效的含五氯硝基苯类农药已被禁用，在发生根腐病的时候缺乏特效药，给种植户带来重大经济损失。包括微生物菌剂在内的生防制剂研究很多，针对镰刀菌引起的其他作物的病害，报道的拮抗菌种类也很多，比如福建农林大学报道的《一株用于拮抗太子参专化型尖孢镰刀菌的枯草芽孢杆菌》已获得发明专利授权，但太子参为石竹科植物孩儿参pseudostellariaheterophylla(miq.)pax的干燥块根，与五加科的西洋参亲缘关系相去甚远，而且本研究分离的菌株与其相比来源不同，菌种也不同。

技术实现要素：

本发明从烟台渤海近海底泥中筛选到一株用于拮抗西洋参根腐病镰刀菌的多粘类芽孢杆菌。所述多粘类芽孢杆菌的发酵液可高效抑制西洋参根腐病镰刀菌，在该领域的应用前景广阔。

本发明提供的一株用于拮抗西洋参根腐病镰刀菌的多粘类芽孢杆菌，为多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)dn67，已于2017年12月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为：cgmccno.15112，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述多粘类芽孢杆菌dn67的发酵培养条件为28～37℃，时间为18～24h。

该菌的发酵培养基配方为：葡萄糖1～2％，酵母浸粉0.5～1.0％，磷酸氢二钾0.5～1.0％，氯化钠0.2～0.5％，硫酸铵0.5～1.0％，硫酸镁0.03～0.05％，调节ph至6.5～7.5。

本发明还提供所述多粘类芽孢杆菌dn67在防治西洋参根腐病镰刀菌药物中的应用。

本发明还提供一种含有所述多粘类芽孢杆菌dn67的生防菌剂。

进一步，所述生防菌剂中所述多粘类芽孢杆菌dn67的浓度为1×10⁸～1×10¹⁰cfu/ml或1×10⁸～1×10¹⁰cfu/g。

本发明还提供所述生防菌剂的制备方法，步骤包括：

(1)将所述多粘类芽孢杆菌接种于液体培养基中培养，至培养液20倍稀释后od600为0.3～0.8，获得种子液；

(2)将种子液接种于发酵培养基中扩大培养，至发酵液中的菌体浓度达到1×10⁹～1×10¹⁰cfu/ml，获得所述生防菌剂。

进一步，所述种子液的接种量的体积比为1～10％。

进一步，所述液体培养基的成分及终浓度:葡萄糖1.6％，氯化钠0.25％，硫酸镁0.05％，酵母浸粉1％，氯化铵0.7％，磷酸氢二钾0.1％，ph7。

进一步，所述发酵培养基的配方为：葡萄糖1～2％，酵母浸粉0.5～1.0％，磷酸氢二钾0.5～1.0％，氯化钠0.2～0.5％，硫酸铵0.5～1.0％，硫酸镁0.03～0.05％，调节ph至6.5～7.5。

进一步，所述扩大培养的温度为28～37℃。

本发明与现有技术相比的有益效果：

在西洋参种植前或种植过程中，将多粘类芽孢杆菌菌悬液均匀喷施在西洋参叶面或滴灌在土壤中，或将多粘类芽孢杆菌与其他菌或有机肥混合施用在农田中，所述多粘类芽孢杆菌菌悬液的浓度为1×10⁸～1×10¹⁰cfu/ml。能够高效抑制西洋参根腐病镰刀菌的滋生。

附图说明

图1为多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)dn67在lb培养基的菌落照片。

图2为多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)dn67对西洋参根腐病镰刀菌的抑菌效果。

图3为多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)dn67的基于16srrna序列的系统发育树。

保藏信息：多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)dn67，已于2017年12月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为：cgmccno.15112，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

具体实施方式

实施例1、多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)dn67的筛选

2016年7月2日从山东省烟台市近海海底表层沉积物采集样品，采用稀释涂布法对微生物分离纯化，称取10g泥样加入装有90ml无菌水的三角瓶中，180r/min振荡30min，所得悬液稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5等不同稀释度，分别涂布在lb平板培养基上，每个稀释度重复2次，于30℃培养箱倒置培养24h，挑取其中的单菌落，平板划线纯化3次，得到培养的纯菌株，分别接种到涂布西洋参根腐病真菌茄病镰刀菌的pda培养基上，于28℃培养2～3天，选取有明显抑菌圈的菌株进行纯化、保藏。

将上述菌种接入lb平板培养基30℃培养2～3天，用打孔器转接入pda培养基，同时将同样大小的西洋参根腐病真菌茄病镰刀菌置于同一块平板另外一端，进行平板对峙培养，抑菌效果见图2。筛选拮抗效果好的菌株进行鉴定，经形态学、生理生化分析(见表1)和16srrna分子生物学鉴定，确定为多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)dn67，基于16srrna序列的系统发育树见图3。

多粘类芽孢杆菌dn67在lb培养基上形成乳白色菌落，半透明，菌落光滑，中间略凸起，边缘不平整，挑起有黏性(见图1)。

表1菌株dn67的生理生化特征

多粘类芽孢杆菌dn67的16srrna序列：

gggctttgggcggaggccgctaatacatgcagtcgagcggggttaggttagaagcttgcttctaacctaacctagcggcggacgggtgagtaacacgtaggcaacctgcccacaagacagggataactaccggaaacggtagctaatacccgatacatccttttcctgcatgggagaaggaggaaaggcggagcaatctgtcacttgtggatgggcctgcggcgcattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatgggcgaaagcctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgccagggaagaacgcttgatagagtaactgctcttgaagtgacggtacctgagaagaaagccccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggctctttaagtctggtgtttaatcccgaggctcaacttcgggtcgcactggaaactggggagcttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctgggctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaatgctaggtgttaggggtttcgatacccttggtgccgaagttaacacattaagcattccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcagtggagtatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatccctctgaccggtctagagatagatctttccttcgggacagaggagacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatgcttagttgccagcaggtcaagctgggcactctaagcagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtactacaatggccggtacaacgggaagcgaaggagcgatgtggagccaatcctagaaaagccggtctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaattgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttacaacacccgaagtcggtgaggtaaccgcaaggagccagccgctcgtatagatgggatacgcagggc。

实施例2、多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)dn67的抑菌效果测定

本实施例提供一种生防菌剂，所述生防菌剂为多粘类芽孢杆菌dn67的发酵液，其制备方法如下：

(1)将所述多粘类芽孢杆菌dn67接种于液体培养基中培养，至培养液20倍稀释后od600为0.3～0.8，获得种子液；

所述液体培养基的成分及终浓度:葡萄糖1.6％，氯化钠0.25％，硫酸镁0.05％，酵母浸粉1％，氯化铵0.7％，磷酸氢二钾0.1％，ph7。

(2)将种子液按照体积比1～10％。的量接种于发酵培养基中扩大培养，扩大培养的温度为30℃，至发酵液中的菌体浓度达到1×10⁹～1×10¹⁰cfu/ml，获得所述生防菌剂。

所述发酵培养基的配方为：葡萄糖1～2％，酵母浸粉0.5～1.0％，磷酸氢二钾0.5～1.0％，氯化钠0.2～0.5％，硫酸铵0.5～1.0％，硫酸镁0.03～0.05％，调节ph至6.5～7.5。

将生防菌剂离心取上清，分别稀释1倍、10倍、100倍，分别取100微升用于西洋参根腐病真菌茄病镰刀菌的拮抗实验，结果如图2所示，发酵上清液稀释10倍仍然具有明显的抑菌效果，抑菌圈直径为21mm。

实施例3、多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)dn67对茄病镰刀菌孢子萌发的抑制作用

在2％蔗糖溶液、多粘类芽孢杆菌dn67发酵上清液中分别加入终浓度为10⁴个/ml的茄病镰刀菌的孢子悬液，每个处理组各取10μl孢子悬液置于载玻片上，置于保温保湿培养箱28℃静置培养10h，观察各处理组的孢子萌发情况，计算萌发率。镜检观察发现，多粘类芽孢杆菌dn67发酵上清液中的茄病镰刀菌孢子不能形成芽管，孢子出现畸形膨胀、破裂等现象，萌发率为0，而2％蔗糖溶液中的茄病镰刀菌孢子萌发率为98％。

实施例4、田间试验防治西洋参根腐病的效果

选取一块三年生西洋参大田，划分成同等大小的三块地，一块地为ck空白对照，用茄病镰刀菌孢子液灌根，不施用任何菌剂；第二块地为处理组1，先用多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)dn67的发酵液灌根，然后再用茄病镰刀菌孢子液灌根；第三块地为处理组2，先用茄病镰刀菌孢子液灌根，然后用多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)dn67的发酵液灌根，比较西洋参根腐病的发病率，结果发现施用多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)dn67发酵液的地块西洋参根腐病发病率显著低于未施用菌液的对照组。

表2不同处理组的发病率

序列表

<110>鲁东大学

<120>一种用于防治西洋参根腐病的多粘类芽孢杆菌及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1474

<212>dna

<213>多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)

<400>1

gggctttgggcggaggccgctaatacatgcagtcgagcggggttaggttagaagcttgct60

tctaacctaacctagcggcggacgggtgagtaacacgtaggcaacctgcccacaagacag120

ggataactaccggaaacggtagctaatacccgatacatccttttcctgcatgggagaagg180

aggaaaggcggagcaatctgtcacttgtggatgggcctgcggcgcattagctagttggtg240

gggtaaaggcctaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacact300

gggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatgg360

gcgaaagcctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctct420

gttgccagggaagaacgcttgatagagtaactgctcttgaagtgacggtacctgagaaga480

aagccccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggggcaagcgttgtccg540

gaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggctctttaagtctggtgtttaatcccgagg600

ctcaacttcgggtcgcactggaaactggggagcttgagtgcagaagaggagagtggaatt660

ccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactct720

ctgggctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccct780

ggtagtccacgccgtaaacgatgaatgctaggtgttaggggtttcgatacccttggtgcc840

gaagttaacacattaagcattccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaagg900

aattgacggggacccgcacaagcagtggagtatgtggtttaattcgaagcaacgcgaaga960

accttaccaggtcttgacatccctctgaccggtctagagatagatctttccttcgggaca1020

gaggagacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcc1080

cgcaacgagcgcaacccttatgcttagttgccagcaggtcaagctgggcactctaagcag1140

actgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatga1200

cctgggctacacacgtactacaatggccggtacaacgggaagcgaaggagcgatgtggag1260

ccaatcctagaaaagccggtctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagt1320

cggaattgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggtcttgtac1380

acaccgcccgtcacaccacgagagtttacaacacccgaagtcggtgaggtaaccgcaagg1440

agccagccgctcgtatagatgggatacgcagggc1474