一株降解小麦戊聚糖的枯草芽孢杆菌MXT‑1及其应用的制作方法

本发明涉及一株降解小麦戊聚糖的枯草芽孢杆菌mxt-1及其应用，属于微生物
技术领域：
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背景技术：
：戊聚糖是一种非均一性的非淀粉多糖(nsp)，是含有大量戊糖的聚合物。在谷物中含量较少，但对谷物的品质，加工和营养却起着非常重要的作用。戊聚糖具有高粘度，高吸水、持水及氧化凝胶等性质，可作为增稠剂和保湿剂，应用在饮料、调味品、乳制品、糖果等食品中，此外，戊聚糖是一种功能性多糖，具有十分重要的生理功能，润肠通便、降血脂、抗结肠、抗肿瘤、免疫增强等多种生理功能。小麦中戊聚糖既有水溶性，又有水不溶性。研究表明水溶性戊聚糖功能较优，为了降低小麦戊聚糖的聚合度，达到提高小麦戊聚糖水溶性，目前，商品化的戊聚糖降解酶是木聚糖酶，它针对底物是木糖为结构单元的木质素、半纤维素等物质，在小麦戊聚糖的降解方面效率较低。中国专利文献cn101343649a(申请号200810071343.1)公开了一种生物降解麦麸阿拉伯木聚糖的方法，该方法以药食两用草生食用真菌姬松茸(agaricusblazeimurill)作为生物降解益生菌，采用液体培养技术与特别筛选的培养基质，诱导该生物降解菌的胞外复合纤维降解酶系统对麸皮阿拉伯木聚糖降解以及转化利用效率，从而提高麦麸作为饲料资源利用的营养转化利用率。但该方法采用的真菌姬松茸(agaricusblazeimurill)的降解速率较慢，无法满足快速降解小麦戊聚糖的市场需求。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，提供一株降解小麦戊聚糖的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)mxt-1及其应用。本发明技术方案如下：一株降解小麦戊聚糖的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)mxt-1，该菌种2017年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号cgmccno.14925。该菌株具有典型的芽孢杆菌特征，其细胞呈杆状，革兰氏染色阳性，着色均匀。芽孢中生或近中生；菌落大，灰白色或略带一些黄色，表面典型的粗糙不规则，有很多皱褶。该菌株可以产生非诱导酶，在以木聚糖和小麦戊聚糖为唯一碳源的培养基上的产酶情况见图1。上述降解小麦戊聚糖的枯草芽孢杆菌菌株的培养方法，步骤如下：(1)取降解小麦戊聚糖的枯草芽孢杆菌菌株，接种于活化培养基中，在35～38℃进行活化培养22～26h，制得活化菌株；(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于种子培养基中，在35～38℃条件下进行种子培养10～14h，制得种子；(3)将步骤(2)制得的种子按体积百分比1～2％的比例接种于扩大培养基中，在35～38℃，150～300r/min条件下进行扩大培养22～26h，即得。根据本发明优选的，所述步骤(1)中，活化培养基组分如下，单位g/l：小麦戊聚糖20，磷酸二氢钾2.0，硝酸铵2.0，七水硫酸镁0.2，琼脂粉20，ph6.0；根据本发明优选的，所述步骤(2)中，种子培养基组分如下，单位g/l：酵母浸粉5.0，蛋白胨10，氯化钠10，ph6.0；根据本发明优选的，所述步骤(3)中，扩大培养基组分如下，单位g/l：小麦戊聚糖20，磷酸二氢钾2.0，硝酸铵2.0，七水硫酸镁0.2，ph6.0；上述降解小麦戊聚糖的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)mxt-1在降解天然不溶性小麦戊聚糖中的应用。有益效果本发明首次从小麦加工厂废水中筛选出可以高效降解小麦戊聚糖的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)mxt-1，该菌株可以提高小麦戊聚糖溶解性，从而使小麦戊聚糖具有更好的食品加工性能和保健功能，提高产品的经济附加值，对小麦戊聚糖的功能研究及应用有重要意义。附图说明图1筛选菌株对木聚糖和戊聚糖的降解对比照片；图2筛选菌株在戊聚糖培养基的降解透明圈照片；图3菌株mxt-1的16srna序列系统发育树；图4菌株mxt-1分泌小麦戊聚糖酶实验照片；其中，图a为菌株发酵液菌体部分牛津杯实验；图b为菌株发酵液上清液部分牛津杯实验，其中平板左侧牛津杯样本来自以小麦戊聚糖为唯一碳源的发酵液，平板右侧牛津杯样本来自以葡萄糖为唯一碳源的发酵发酵液；图5菌株mxt-1生长曲线图；图6发酵过程中阿拉伯木聚糖含量变化曲线图；图7发酵过程中小麦戊聚糖含量变化曲线图。具体实施方式下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。培养基分离培养基(g/l)：去皮土豆200，葡萄糖20，kh2po43，mgso41.5，琼脂15，微量vb10.1，ph6.0；筛选培养基(g/l)：kh2po42.0，nh4no32.0，mgso4·7h2o0.2，酵母膏5，小麦戊聚糖20，琼脂粉20，ph6.0；发酵培养基(g/l)：小麦戊聚糖20，酵母膏5，kh2po42.0，nh4no32.0，mgso4·7h2o0.2，ph6.0；lb培养基(g/l)：酵母浸粉5，蛋白胨10，nacl10，ph6.0；葡萄糖为唯一碳源培养基：葡萄糖20，kh2po42.0，nh4no32.0，mgso4·7h2o0.2，ph6.0；小麦戊聚糖为唯一碳源培养基(g/l)：小麦戊聚糖20，kh2po42.0，nh4no32.0，mgso4·7h2o0.2，ph6.0；菌株来源枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)mxt-1，该菌种2017年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号cgmccno.14925。实施例1菌株的分离筛选从山东安丘某小麦加工厂取小麦加工产生的戊聚糖废水，按10倍比例稀释，分别将稀释梯度为10-1、10-3、10-5、10-7的菌悬液涂布在分离培养基上，37℃培养2d。挑选分离平板上的单菌落接种至筛选固体培养基上，37℃培养2d，观察透明圈，结果如图2所示。配制发酵培养基50ml于250ml三角瓶中，115℃灭菌25min，挑选筛选得到的菌种，转接至培养基，37℃、200r/min，过夜培养，取灭过菌的40％甘油以及甘油管，用移液器取800μl甘油以及800μl发酵菌液，混合均匀，放置-20℃或者-80℃冰箱保藏。挑取菌落接种至发酵培养基中，摇床培养12h，取菌悬液至载玻片上，轻轻压下盖玻片，显微镜下观察。经观察，该菌在显微镜下为短杆状。经过染色观察，该菌革兰氏染色呈紫色，说明该菌为革兰氏阳性菌。根据菌株形态观察以及革兰氏染色，推断该菌为细菌，提取该菌株基因组dna，然后扩增其16srna序列，结果seqidno.1所示，最后与genbank上的序列进行比较。该菌16sdna的测序工作由上海生工完成，获得的序列在genbank上的序列blast比较，下载同源性高菌株序列，比对后采用nj邻位相接法用mega5.0软件构建系统进化树，分析菌株系统发育，确定该菌分类和地位，结果如图3所示。将该菌株命名为降解小麦戊聚糖的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)mxt-1，该菌种2017年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号cgmccno.14925。实施例2菌株分泌降解小麦戊聚糖酶的性质采用两种培养基，取两个250ml三角瓶，配制50ml培养基，一种以葡萄糖为唯一碳源，另一种以戊聚糖为唯一碳源，从甘油管中接所筛选菌种，200r/min，37℃培养过夜。将发酵液离心，得到两种培养基培养的菌体，菌体用无菌水洗涤三次，最后使用无菌水制成菌悬液，同时收集离心后的发酵的上清液。分别取200μl制备好的菌体样本转接至1个筛选平板上的两个牛津杯中，另取200μl离心得到的上清液样本分别转接至另1个筛选平板上的两个牛津杯中，28℃培养2d。由图4可以看出，使用不同碳源培养出的菌均产降解小麦戊聚的酶，说明该菌产的小麦戊聚糖酶为非诱导型酶，还可以看出，该菌产的小麦戊聚糖能够分泌到细胞外。实施例3芽孢杆菌mxt-1生长曲线的测定配制150ml发酵培养基，分别装至三个250ml三角瓶中，灭菌，从甘油管中取该菌接至培养几种，共做三个平行实验，每隔两小时取样测od600，绘制该菌株的生长曲线，结果如图5所示，该菌的生长基本呈现潜伏期、指数期、稳定期。接种后0～4h为菌体生长延滞期，4～10h为对数生长期，10～12h为稳定生长期。实施例4菌株mxt-1发酵前后小麦戊聚糖的分子量分析芽孢杆菌mxt-1发酵过程中小麦戊聚糖相对分子量的变化采用sphroase-cl6b层析柱分析相对分子量分布，不同相对分子量的多糖经过层析柱，吸附，洗脱所花的时间不同，所用的洗脱也体积不同，从而达到分离目的。将无水葡萄糖和葡聚糖系列标准品t-10、t-40、t-70、t-500、t-2000上样，分别用0.2mnacl溶液配成质量浓度为2mg/ml的溶液，按分子质量由小到大依次上样，根据苯酚-硫酸快速检测，得到各相对分子量葡聚糖的洗脱体积，作出标准曲线。a.发酵前戊聚糖的相对分子量测定：精密称取小麦戊聚糖0.01g，溶于10ml上样缓冲液，经sphroase-cl6b层析柱，0.2mnacl溶液洗脱，控制流速在1ml/min，苯酚-硫酸法快速检测确定洗脱体积，得到洗脱体积ve，代入标准曲线，可得到戊聚糖的相对分子量。b.发酵后戊聚糖相对分子量测定：从该菌发酵12小时后开始取样，以后每两小时的收集发酵菌液，直至发酵22小时为止。收集的发酵菌液离心处理后，进行sphroase-cl6b层析柱纯化，用0.2mnacl溶液洗脱，控制流速在1ml/min，苯酚-硫酸法快速检测确定洗脱体积，得到洗脱体积ve，代入标准曲线，可得到发酵的戊聚糖的相对分子量。结果如表1所示，未发酵的小麦戊聚糖的相对分子量为1730kda，经筛选的菌发酵不同时间，小麦戊聚糖相对分子量也不同，说明随着发酵的进行，小麦戊聚糖被该菌降解，相对分子量也慢慢降低。表1纯化后小麦戊聚糖相对分子量实施例5分别取200μl复苏的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)mxt-1菌液转接至1个筛选平板上的两个牛津杯中，该筛选平板一半为木聚糖培养基，一半为戊聚糖培养基。以芽孢杆菌mxt-1在木聚糖固体培养基的牛津杯实验为对照，同时做该菌株在戊聚糖固体培养基的牛津杯实验，相同培养条件下，经过24小时恒温箱培养后，该菌株优先在戊聚糖出现透明圈，在木聚糖培养基中未出现透明圈，因此说明了该菌株可优先降解戊聚糖。结果如图1所示。实施例6取复苏的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)mxt-1菌液，按照专利文献cn101343649a(申请号200810071343.1)中实例1的记载进行阿拉伯木聚糖降解试验。阿拉伯木聚糖降解曲线如图6所示。表1发酵降解阿拉伯木聚糖真菌姬松茸枯草芽孢杆菌mxt-1阿拉伯木聚糖含量(mg/ml)20.000.45对比例1中国专利文献cn101343649a(申请号200810071343.1)公开了一种生物降解麦麸阿拉伯木聚糖的方法，该方法以药食两用草生食用真菌姬松茸(agaricusblazeimurill)作为生物降解益生菌，在该专利中，在液体培养过程中，真菌姬松茸将含量为12.72g/l阿拉伯木聚糖经过7天发酵降解为0.37g/l。通过实施例6和对比例1的数据可以看出，本申请所述的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)mxt-1降解阿拉伯木聚糖的速度显著快于对比例1中的姬松茸(agaricusblazeimurill)。本申请中将枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)mxt-1接种到发酵戊聚糖培养基，摇床培养。经过36小时之后戊聚糖的含量由20g/l降为0.23g/l。由此可以说明枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)mxt-1对戊聚糖的降解效率也非常高。枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)mxt-1发酵过程中戊聚糖的含量变化情况如图7所示。sequencelisting<110>齐鲁工业大学<120>一株降解小麦戊聚糖的枯草芽孢杆菌mxt-1及其应用<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>1452<212>dna<213>bacillus<400>1gaatggcgcgtgcctataatgcagtcgagcggacagatgggaagctccgctccctgatgt60tcgcggcggacgggtgtagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccg120ggaaaccggggctaataccggatgcttgtttgaaccgcatggttcaaacataaaaggtgg180cttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggct240caccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagac300acggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctg360acggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttaggga420agaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggc480taactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgg540gcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccgctcaacccggg600gagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgta660gcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgt720aactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtcca780cgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaac840gcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgg900gggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttacca960ggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgaca1020ggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgag1080cgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtga1140caaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctaca1200cacgtgctacaatgggcagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccaca1260aatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctag1320taatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtc1380acaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttttggagccagccgcc1440gaagtgacagag1452当前第1页12