根际促生菌及其应用的制作方法

本发明涉及农业微生物领域，具体地说是一种降解苹果自毒物质根皮苷的根瘤菌及其应用。

背景技术：

苹果属于蔷薇科苹果属，是我国第一大水果品种，栽培面积约有200km²，栽培面积和产量占世界总量的40％。苹果连作障碍是苹果产业面临的一大难题，连作苹果幼苗成活率低，根系发育不良，严重制约苹果产量和品质。

目前普遍认可的连作障碍发生机制是：土壤肥力下降、微生物群落结构失衡、化感作用等综合作用的结果。对于连作障碍的应对措施主要有轮作、增施有机肥、消毒土壤、选育抗病品种等。基于我国苹果栽培面积大、生产周期长、抗病品种选育困难、管理粗放等特点，在其他粮食蔬菜等农作物上常用的轮作、大量增施有机肥、改换品种等措施，难以适应苹果连作障碍的克服。

越来越多的研究表明，自毒物质的累积是连作障碍的主要诱因。自毒作用是指某些植物可通过地上部淋溶、根系分泌和植株残茬腐解等途径，释放出的物质对同茬或下茬同种或同科植物生长产生抑制作用的现象。自毒物质包括有机酸、直链醇、简单酚类、酚酸、单宁、醛类、萜类、氨基酸和生物碱等。根皮苷是苹果属特征性酚类化合物，研究表明微量根皮苷(约0.001mmol/l)可促进幼苗的生长，但浓度达到1mmol/l时会抑制幼苗的生长，且随着浓度的增加，抑制作用加强。另外，根皮苷的降解产物根皮素、间苯三酚和肉桂酸等均能抑制果树生长。酚酸类化感物质主要通过以下方式产生自毒作用：

(1)影响细胞膜的功能，抑制植物对养分的吸收，酚酸类化感物质对细胞膜的破坏可能是化感物质所产生的自毒效应的起点；(2)影响各种酶的功能和活性；(3)影响植物的光合、呼吸作用和根尖的伸长。

微生物可以改变自毒物质的数量和种类，对缓解自毒作用具有重要作用。特定微生物能够利用根皮苷等酚酸类自毒物质作为唯一碳源，减弱或消除自毒作用；特定微生物能够抑制土壤中病原菌的数量或抑制病原菌对寄主植物的侵染，改善植株根际的生态环境，从而间接缓解自毒作用；植物根际的一些有益微生物通过产生的次级代谢产物，如植物激素和抗生素等，对作物有一定的促生和抗病作用。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种降解苹果自毒物质根皮苷的根瘤菌及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种根瘤菌，根瘤菌(rhizobiumpusense)yic4105，已于2017年11月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号为cgmccno.14852。

该根瘤菌从黄河三角洲盐碱土壤生长的田菁根基土壤中分离筛选获得。对分离所得的菌株进行持家基因reca序列进行分析，并通过在genbank中结果发现，本发明根瘤菌的reca基因与r.pusensenrcpb10t似性最高，为99.7％。从而确定分离出来的菌株为rhizobiumpusense，命名为rhizobiumpusenseyic4105。

一种根瘤菌的应用，所述根瘤菌在降解苹果自毒物质中的应用。

所述根瘤菌在降解苹果酚类自毒物质中的应用，其中苹果酚类自毒物质为根皮苷。

一种根瘤菌的应用，所述根瘤菌在作为苹果促生剂中的应用。所述根瘤菌在缓解苹果连作障碍中的应用。

一种根瘤菌的应用，所述根瘤菌在作为微生物菌肥中的应用。

一种促生剂，包括所述的根瘤菌(rhizobiumpusense)yic4105。

包括所述的根瘤菌(rhizobiumpusense)yic4105的菌株营养细胞或完整培养物。

包括所述的根瘤菌(rhizobiumpusense)yic4105的培养物浓缩物或细菌悬液或发酵液或发酵清液。

一种促生剂的应用，所述促生剂在促进苹果幼苗生长中的应用。

本发明所具有优点：

1.本发明得到的根瘤菌yic4105具有较高的根皮苷降解能力，并能够在苹果根际稳定定殖。

2.本发明的根瘤菌对苹果幼苗有一定的促生长作用。

3.利用本发明菌株生产的菌剂可有效防治因根皮苷积累导致的苹果连作障碍。

附图说明

图1为本发明实施例提供的菌株yic4105的菌落照片。

图2为根皮苷含量测定标准曲线。

图3为根皮苷标准品hplc色谱图(20mg/l)。

图4为本发明实施例提供的菌株yic4105降解72小时后根皮苷的hplc色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

实施例1:根瘤菌的获得

从黄河三角洲盐碱化土壤种植地选取地上、地下部生长旺盛的田菁，采集根瘤，将根瘤捣碎，并将浸出液涂布于yma平板上，28℃倒置培养3-5天，待长出边缘整齐、乳白色半透明、胞外多糖较多的圆形菌落时，挑取单菌落并反复划线直至纯化(参见图1)。

yma固体培养基(酵母提取物甘露醇琼脂培养基)配方为：甘露醇10g/l，酵母提取物3g/l，k2hp040.25g/l，kh2p040.25g/l，mgso40.2g/l，cac033g/l，nacl0.1g/l，去离子水定容至1000ml，并分别分装至三角瓶中，每瓶加入终浓度为20g/l的琼脂粉。

(1)根瘤菌的鉴定

革兰氏染色及形态鉴定：将上述纯化获得菌株经革兰氏染色结果为阴性，不产生芽孢，能运动，菌落湿润，中间隆起，边缘整齐；胞外多糖含量较高，为典型的根瘤菌特征。

分子鉴定：为了确定本实施根瘤菌菌株yic4105的系统进化地位，对其持家基因reca的序列进行测序分析。首先提取该菌株的总dna，然后使用持家基因reca的通用引物reca41f/reca640r进行pcr扩增，并将pcr产物进行分析。序列如列表的序列1所示，其与r.pusensenrcpb10相似性最高相似性为99.7％，从而确定分离出来的菌株yic4105为rhizobiumpusense。

rhizobiumpusenseyic4105的reca序列：

综合以上鉴定结果，将菌株yic4105命名为rhizobiumpusenseyic4105，已于2017年11月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc，北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为cgmccno.14852。

上述的根瘤菌菌株yic4105降解根皮苷能力强、未进行遗传改造。当菌体被释放入自然环境后，对人、动植物无害，不污染环境，并能有效促进苹果苗的生长。

所得rhizobiumpusenseyic4105根瘤菌菌株的实验室保藏方式：短期保藏方式为，将菌株接种至yma固体斜面，待菌株长好后保藏于4℃冰箱内，此保藏方式不超过3个月；长期保藏方式为：将根瘤菌菌体加入终浓度为20％甘油中混匀并保藏至-80℃冰箱中，此保藏方式可达到10年以上。

(2)根皮苷降解能力测定

用接种环从yma平板上刮取2环yic4105菌体接种到液体ty培养基中，配方为：酵母粉3g，胰蛋白胨5g，cacl2·2h2o0.7g，去离子水1l，ph6.8～7.2，28℃-32℃、180-200r/m摇瓶培养2-3天作为种子液。将种子液以体积比5％的接种量接种到含浓度为1000mg/l根皮苷的无机盐培养基(mm)中，配方为(nh4)2so42g/l，kh2po42g/l,na2hpo41.3g/l，fecl30.5mg/l，mgso47h2o0.5g/l，ph7.5，28-32℃、180-200r/m摇瓶培养3天，将培养液稀释1000倍，用0.45mm水相滤膜过滤杂质，用hplc进行测定，根据根皮苷标准曲线(参见图2)和建立的根皮苷浓度和吸收峰面积回归方程y(峰面积)＝79606x(浓度)-153663，得出培养液中根皮苷的浓度，经计算，yic4105菌株72小时后对根皮苷的降解率为100％(参见图4)。

实施例2根瘤菌yic4105对苹果幼苗的促生效果

(1)菌株活化

用灭菌后的接种环挑取yic4105菌落，并在yma固体培养基上划线，28℃-32℃倒置培养2-3天直至菌落长好。

(2)菌剂制备

用灭菌后的接种环挑取一到两环菌体，接种至200ml灭菌后的液体ty液体培养基中，28℃-32℃、180-200r/m振荡培养，培养至od600约为1.5。将菌液放至4℃冰箱中作为菌剂，待用。

(3)苹果种子4℃低温沙藏，保持沙粒湿润，约30天后种子萌发出芽，移栽入灭菌土中定苗，放置于人工气候室内培养。光照周期为光照12h/黑暗12h，光强为600μmol·m^-2·s^-1，光照和黑暗期间温度分别为25℃和18℃，空气湿度设定为70％。30天后，苹果幼苗用于后续试验。

取花盆60个，设为3个处理，即对照组1、对照组2和处理组；每个处理20个花盆。每个花盆装4±0.5kg，取生长一致的苹果幼苗移栽1棵/每盆。

对照组：每个花盆加4.7g的根皮苷，与土壤充分混匀，栽植苹果苗后，将灭活的20mlyic4105菌剂加水至1l浇灌，土壤中根皮苷的浓度达到5mmol/l(以土壤中水体积为参考量，土壤含水量约为25％)。

处理组：每个花盆加4.7g的根皮苷，与土壤充分混匀，移栽苹果苗后，将20mlyic4105菌剂加水定容至1l浇灌，土壤中根皮苷的浓度达到5mmol/l(以土壤中水体积为参考量，土壤含水量约为25％)。

生长2个月后，测定苹果苗的株高、植株生物量和叶片含水率(参见表1)。

表1根瘤菌yic4105生物制剂对根皮苷处理下苹果幼苗的保护效果。

结果显示：yic4105菌株对根皮苷引起生长抑制有明显缓解作用。见表1:比较对照组和处理组，处理组的平均株高、干重和叶片含水量明显高于对照组，说明yic4105菌株对含有根皮苷环境中的苹果苗有明显的生长促进作用。