一种枯草芽孢杆菌及其在水产养殖中的应用的制作方法

本发明属于水产微生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌及其在水产养殖中的应用。

背景技术：

随着水产养殖模式的逐渐转变，高密度、集约化的养殖加剧了水体恶化进程，养殖业对周边环境及海区的污染不断加重。养殖中的污染主要来源于过量投喂的饵料，水产动物的排泄物和生物遗骸溶出或分解产生的n、p营养盐和有机质，以及在养殖过程中所投放的化学或抗生素类药物残留等；因此，底泥净化成为保持水质优良的重要措施，对实现水产养殖的高产优质具有重要意义。净化分物理、化学和生物方法，其中，功能微生物具有效率高、针对性强和环境友好等特点，具有广阔的发展前途。

技术实现要素：

针对现有水产养殖模式中水体恶化的问题，本发明的目的在于提供一种可有效迅速净化水体，并具有杀藻、防治水产病原微生物的枯草芽孢杆菌。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

枯草芽孢杆菌，为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)nc108，于2017年4月10日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno:14010，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为青岛农业大学。

在上述方案的基础上，所述枯草芽孢杆菌16srrna的序列如seqidno:3所示。

在上述方案的基础上，所述枯草芽孢杆菌gyrb基因的序列如seqidno:6所示。

在上述方案的基础上，所述枯草芽孢杆菌分离于刺参养殖池底污泥。

在上述方案的基础上，所述枯草芽孢杆菌菌落圆形，边缘不整齐，不透明，污白色；单个细胞0.7～0.8×2.2～2.8微米，革兰氏阳性，芽孢形成后菌体不膨大，芽孢0.6～0.8×1.0～1.5微米，位于菌体中央或稍偏，柱状。

在上述方案的基础上，所述枯草芽孢杆菌具有如下特性：

能清除水体中的氨态氮和亚硝态氮；具有杀藻作用；对灿烂弧菌和假交替单胞菌具有抑制作用。

在上述方案的基础上，所述枯草芽孢杆菌在水质调控中的应用。

在上述方案的基础上，具体的应用是枯草芽孢杆菌nc108用于降低水体中氨态氮(nh4-n)、亚硝态氮(no2-n)含量和增加水体溶解氧、透明度。

在上述方案的基础上，所述枯草芽孢杆菌在溶藻中的应用。

在上述方案的基础上，所述的枯草芽孢杆菌在防治病原菌引起的水产动物病害中的应用。

在上述方案的基础上，所述病原菌包括灿烂弧菌和假交替单胞菌。

枯草芽孢杆菌菌剂，由保藏编号为cgmccno:14010的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)nc108制成。

在上述方案的基础上，所述枯草芽孢杆菌菌剂在水质调控中的应用，具体的应用是枯草芽孢杆菌nc108用于降低水体中氨态氮(nh4-n)、亚硝态氮(no2-n)含量和增加水体溶解氧、透明度。

在上述方案的基础上，所述枯草芽孢杆菌菌剂在溶藻中的应用。

在上述方案的基础上，所述的枯草芽孢杆菌菌剂在防治病原菌引起的水产动物病害中的应用，所述病原菌包括灿烂弧菌和假交替单胞菌。

本发明的有益效果：

本发明所述枯草芽孢杆菌nc108分离自刺参养殖池底泥。使用本发明所述枯草芽孢杆菌nc108，可以迅速降低水体中氨态氮、亚硝酸盐含量，对小球藻具有杀伤作用，并且对水产动物病原菌灿烂弧菌和假交替单胞菌具有显著的抑制作用，可用于防治刺参腐皮综合征。

本发明的枯草芽孢杆菌nc108不仅能够净化水体、去除杂藻，还可以减少化学农药的用量及其在水体中的累积，防止环境污染，有利于提高水产动物的质量和产量，经济效益和社会效益十分显著。

附图说明

图1菌株nc108的菌落形态；

图2不同添加量枯草芽孢杆菌nc108的杀藻性；

图3不同作用时间枯草芽孢杆菌nc108的杀藻性；

图4不同ph下枯草芽孢杆菌nc108的杀藻性；

图5枯草芽孢杆菌nc108对刺参病原菌-假交替单胞菌的抑制作用；

图6枯草芽孢杆菌nc108对刺参病原菌-灿烂弧菌的抑制作用。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

菌株的分离

采用10倍系列梯度稀释分离法在2216e营养平板上对2014年5月采集自山东省青岛市红岛刺参养殖池的底泥进行微生物分离，通过分区划线法纯化。

所用2216e培养基：蛋白胨5g，酵母提取物1g，磷酸高铁0.01克g，氯化钠30g，琼脂粉18g，调节ph至7.6，加热使其溶解，最后定容到1000ml，121℃灭菌20min。

在2216e平板上，纯化的菌株采用滤纸片法，分别与常见水产动物病原菌进行平板拮抗试验，最终筛选得到对常见水产动物病原菌具有强烈抑制作用的菌株nc108。

实施例2菌株nc108的鉴定

1、形态学鉴定和生理生化特性检测

将分离到的菌株接种到2216e平板上，25℃恒温培养48h，观察菌落生长情况，挑取菌体制备涂片，进行革兰氏染色，显微观察菌体形态和芽孢形成情况，进行形态学鉴定。采用常规方法进行生理生化特性检测(东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册，第一版.北京,科学出版社,2001)。

结果表明：菌株菌落形态如附图1所示：菌落圆形，边缘不整齐，不透明，污白色；单个细胞0.7～0.8×2.2～2.8微米，革兰氏阳性，芽孢形成后菌体不膨大，芽孢0.6～0.8×1.0～1.5微米，位于菌体中央或稍偏，柱状。该菌株硝酸盐还原、接触酶、淀粉水解、l-阿拉伯糖产酸、d-木糖产酸、d-甘露醇产酸实验、柠檬酸盐利用、酪朊水解实验反应均为阳性。

2、分子生物学鉴定

挑取菌株单菌落接种于2216e液体培养基中28℃、200rpm振荡培养18h，采用dna提取试剂盒(购自北京百泰克生物技术有限公司)提取细菌基因组。

2.116srrna基因序列的测定

利用细菌16srrna基因通用引物，进行16srrna基因的pcr扩增，引物序列如下：

27f：5′-agagtttgatcctggctcag-3′(seqidno:1)

1492r：5′-tacggytaccttgttacgactt-3′(seqidno:2)

pcr反应体系(50μl)：

pcr反应条件：94℃预变性4min；94℃变性0.5min、51℃退火0.5min、72℃延伸1.5min，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

pcr扩增产物在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，切胶回收目的条带，与pmd18-tvector连接，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，菌落pcr鉴定筛选阳性克隆测序，测序由上海生工生物工程有限公司完成。

获得菌株nc108的16srrna基因序列(1514bp)如seqidno:3所示：

seqidno:3：

该序列与枯草芽孢杆菌dsm10菌株的16srrna(bacillussubtilisstraindsm1016sribosomalrnagene，genbank：aj276351.1)序列相似性为99.60％。

2.2gyrb基因序列的测定

促旋酶亚基b基因(gyrasesubunitbgene，gyrb)扩增引物为：

gyrb1f：5'-caygcnggnggnaarttyga-3'(seqidno:4)

gyrb2r：5'-ccrtcnacrtcngcrtcngtcat-3'(seqidno:5)

pcr反应体系(50μl)：

pcr扩增条件为：95℃4min；94℃30s，48℃0.5min，72℃2min，35个循环；72℃10min。扩增结束后，取5μlpcr扩增产物在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳检测，回收目的条带后转化dh5α感受态细胞，挑取阳性克隆送由上海生工生物工程有限公司进行测序。

获得菌株nc108的gyrb基因序列(1114bp)如seqidno:6所示：

seqidno:6：

将测序所获得的gyrb序列与genbank数据库中的已有序列进行blast比对分析，发现该序列与枯草芽孢杆菌atcc19217菌株和枯草芽孢杆菌bs-916菌株的促旋酶亚基b基因序列相似性均为98％。

结合菌株的形态学特征、生理生化特性和基因序列比对结果，最终将菌株nc108鉴定为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。将筛选到的枯草芽孢杆菌nc108于2017年4月10日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno:14010，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为青岛农业大学。

实施例3枯草芽孢杆菌nc108净水作用。

种子液的制备：将枯草芽孢杆菌nc108接种到lb液体培养基中，28℃，150r/min，培养20h左右(od600大于1.0)。

发酵液的制备：将上述种子培养液接种于lb液体培养基进行发酵培养20h(菌液浓度≥10⁸cfu/ml)。

在72l养殖3天未换水的南美白对虾海水养殖池中加入1ml发酵液，对照组不添加任何物质，于接种后24h、48h，按照国标“海洋监测规范第四部分：海水分析gb17378.4-2007”中规范的方法检测水中亚硝酸盐氮、氨氮、硫化物、溶解氧、ph等指标，分析各指标的变化，其中氨-氮检测采用标准中的靛酚蓝分光光度法。去除率按下式计算：

去除率(％)＝(对照指标-处理指标)/对照指标×100

试验结果如表1所示：

表1枯草芽孢杆菌nc108的净水作用

结果表明：枯草芽孢杆菌nc108处理前后，南美白对虾海水养殖池中溶氧、ph、硫化物含量等其他指标没有明显变化；本发明的枯草芽孢杆菌nc108对南美白对虾海水养殖池水中亚硝态氮去除率95％以上、铵态氮去除率85％以上(表1)。

实施例4不同枯草芽孢杆菌nc108用量对小球藻的作用

将枯草芽孢杆菌nc108的发酵液，按5％、10％和15％的量加入到生长良好的100ml小球藻(chlorellavulgaris)(浓度＞10⁶个/ml)的培养液中，对照组为加等量的无菌水。20h后观察小球藻的生长情况，用血球计数板进行计数。计算其杀藻率。

杀藻率(％)＝(对照组的小球藻数量-处理的小球藻数量)/对照组的小球藻数量×100

结果如附图2所示：随着枯草芽孢杆菌nc108添加量的增加，杀藻率随之增加。当添加量为15％时，可以观察到处理组培养液变得混浊，有大量死亡的藻凝聚下沉、与对照相比绿色明显变浅，检测发现杀藻率高达47.83％。

实施例5枯草芽孢杆菌nc108处理后不同时间对小球藻的作用

将枯草芽孢杆菌nc108按15％的添加量加到装有100ml小球藻(浓度＞10⁶个/ml)的三角瓶中，对照组为不加菌的藻液，分别在6小时、12小时、18小时、24小时、36小时进行计数，计算其杀藻率。

结果如附图3所示：随着作用时间的增加，枯草芽孢杆菌nc108对小球藻的杀藻率呈先上升在下降的趋势，在枯草芽孢杆菌nc108处理的18h左右杀藻率最高，为42.8％。

实施例6不同ph下枯草芽孢杆菌nc108对小球藻的作用

将枯草芽孢杆菌nc108按照15％的添加量加到装有100ml小球藻(浓度＞10⁶个/ml)的三角瓶中，分别调ph为5、6、7、8、9并做好标记。对照组为不加益生菌的藻液，20h进行血球计数，最终计算其杀藻率。方法同实施例4。

结果如附图4所示：随着ph从5～9的升高，杀藻率呈先降低再升高再降低的趋势，在ph为6时，杀藻率最低为46.59％，ph为8时杀藻率最高为55.66％。

实施例7枯草芽孢杆菌nc108抑菌作用。

菌株的活化：将灿烂弧菌(vibirosplendidus)、假交替单胞菌(pseudoalteromonasnigrifaciens)和枯草芽孢杆菌nc108接种于2216e固体平板上，28℃培养48h。

发酵液的制备：分别挑取取上述各种菌的单菌落，接种到lb液体培养基中，28℃，150r/min，培养20h后，备用。

拮抗试验方法：采用滤纸片法，分别将灿烂弧菌、假交替单胞菌的5ml发酵液(od600大于1.3)混入100ml2216e培养基中，然后制成含菌平板，在每个含菌平板等距贴上3片灭菌的直径为6mm的滤纸片，2片滴加枯草芽孢杆菌nc108发酵液(10μl/片)，另1片滴加等量无菌水作为对照，设置3次重复。28℃培养48h后，测定抑菌圈直径(透明圈直径-6mm)的大小。

枯草芽孢杆菌nc108对假交替单胞菌的抑制作用如附图5所示，抑菌圈直径为12.5mm；对灿烂弧菌的抑制作用如附图6所示，抑菌圈直径为17.5mm。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110>青岛农业大学

<120>一种枯草芽孢杆菌及其在水产养殖中的应用

<130>2017

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

agagtttgatcctggctcag20

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tacggytaccttgttacgactt22

<210>3

<211>1514

<212>dna

<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilisnc108)

<400>3

agagtttgatcctggctcaggatgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgagc60

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<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilisnc108)

<400>6

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