本发明涉及黑臭水体治理技术领域，特别是涉及一种用于黑臭水体治理的复合微生物菌剂、其获得方法及其使用方法。
背景技术：
近年来，城市河道和城镇坑塘过量纳污导致水体供氧和耗氧失衡，水体缺氧乃至厌氧条件下污染物转化并产生氨氮、硫化氢、挥发性有机酸等恶臭物质以及铁、锰硫化物等黑色物质，出现黑臭现象，不仅破坏了水体原有生态功能，而且对周边居民健康和正常生活造成了严重影响。
治理黑臭水体主要通过物理曝气、生态工程修复(生态浮岛、浮床)、生物促生、微生物修复以及化学絮凝沉淀等技术。利用微生物代谢降解高浓度有机污染物并配合一定的物理手段是污水处理的常用方法，已广泛用于市政污水的处理。随着黑臭水体治理需求的增加，将微生物技术移植至河道、坑塘黑臭水的治理中是目前国内外采取的普遍做法，但由于河道、坑塘具有特殊封闭微环境系统，尤其是溶解氧水平较低，普通微生物菌剂的处理效率往往不高。
技术实现要素：
针对现有黑臭水体治理所用微生物菌剂处理效率不高、对河道和坑塘污水治理专一性较差的问题，本发明提供一种用于黑臭水体治理的复合微生物菌剂、其获得方法及其使用方法，以实现提高黑臭水体cod、氨氮(nh3-n)和总磷(tp)的去除率。具体技术方案如下：
本发明首先提供了一种用于黑臭水体治理的复合微生物菌剂，包括假单胞菌(pseudomonassp.aw0h4)、巨大芽孢杆菌(bacillusmegateriumaw0f5)、粪产碱杆菌(alcaligenesfaecalis)、短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)和嗜热脂肪土芽孢杆菌(geobacillusstearothermophilus)，其中核心菌株假单胞菌(pseudomonassp.aw0h4)和巨大芽孢杆菌(bacillusmegateriumaw0f5)已于2017年1月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号分别为cgmccno.13544和cgmccno.13543。
在一种优选实施方式中，上述的复合微生物菌剂，假单胞菌：巨大芽孢杆菌：短小芽孢杆菌：粪产碱杆菌：嗜热脂肪土芽孢杆菌的比例为2：2：(1-2)：1：1。此处所说的比例可以理解为菌落数的比例；具体可以通过将微生物量基本相同的各菌液等按体积比为2：2：(1-2)：1：1的比例配制而得。更为具体地，假单胞菌：芽孢杆菌：短小芽孢杆菌：粪产碱杆菌：嗜热脂肪土芽孢杆菌的比例为2：2：2：1：1或2：2：1：1：1。
一种用于黑臭水体治理的复合微生物菌剂，应用于城市河道或城镇坑塘黑臭水，7天内可将黑臭水中cod指标均降到v类水限值(40mg/l)以下，降解率约85％；氨氮在曝气条件下达到90％以上；水体中磷的去除率可以达到70％以上。
需要说明的是，上述的各菌诛可以通过商业化途径获得，但优选采用本发明所提供的筛选方法获得。
本发明还提供了上述复合微生物菌剂的制备包括以下步骤：
(1)使用lb培养基分别接种假单胞菌、巨大芽孢杆菌、粪产碱杆菌、短小芽孢杆菌和嗜热脂肪土芽孢杆菌的菌株进行培养活化，优选于30℃、110r/min条件下培养24h进行菌种的活化；
lb培养基：每1000ml水中，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，ph7.2-7.5。
(2)将各菌液于2000-3000r/min下离心，优选离心2min后去除悬液，将菌体与pbs溶液混合均匀，调整pbs溶液使用量，使菌液微生物量达到(0.8-1.2)×109cfu/ml，优选约1×109cfu/ml，得到各菌株的浓缩菌液；
pbs溶液：每1000ml水中，nacl8g，kcl0.2g，na2hpo4·12h2o3.58g，kh2po40.24g。
(3)将上述浓缩菌液混合，假单胞菌：芽孢杆菌：短小芽孢杆菌：粪产碱杆菌：嗜热脂肪土芽孢杆菌按照体积比2：2：(1-2)：1：1的比例混合，更具体地，按照2：2：2：1：1或2：2：1：1：1的比例混合，制成复合菌剂。
本发明还提供了复合微生物菌剂的保存方法，包括单菌株保存及复合菌剂的保存方法。对于单菌株保存，在上述复合微生物菌剂的制备方法的步骤(2)后，分别将得到各菌株的浓缩菌液与质量百分数为40％-60％，优选50％的甘油水溶液按照1：(0.5-1.5)，优选为1：1(体积比)比例混合；-30至-20℃，优选-20℃保存，使用前按照步骤(1)活化。
对于复合菌剂保存，在上述复合微生物菌剂的制备方法的步骤(3)后，将得到的复合菌剂与60-90％，优选为80％的甘油水溶液按照(3-1)：1，优选为2：1的比例混合，-90℃至-50℃，优选为-80℃保存，-80℃保存有效期为12个月。
本发明还提供了上述复合微生物菌剂的使用方法：将上述复合菌剂，优选在配制完成后1h内投加至黑臭水体中，投加量10-20ml/m3。对于大面积水域治理，优选将复合菌剂制成载体。
本发明还提供了从黑臭水体中获得上述各菌株的方法：
(1)利用特定筛选培养基从黑臭水体中筛选巨大芽孢杆菌和嗜热土芽孢杆菌，具体步骤：将污水或污泥菌种载体(来源于黑臭水体)与无菌水混合，制成10-4、10-5和10-6倍的菌悬液，分别加入至特定筛选培养基(液体)中，培养18-24h；将扩培菌液稀释稀释103、104、105和106倍，均匀涂布于特定筛选培养基(固体)平板上，培养12h；挑取单一菌落，对单菌株反复进行液体培养和划线分离，直到获得纯菌株；lb试管斜面冷冻保存。
特定筛选培养基(液体)：每1000ml水中，葡萄糖2g，淀粉5g，nacl0.5g，kno30.5g，nh4no30.5g，k2hpo4·3h2o0.5g，mgso4·7h2o0.5g，feso4·7h2o0.01g，ph7.2-7.5；
特定筛选培养基(固体)：每1000ml水中，葡萄糖2g，淀粉5g，nacl0.5g，kno30.5g，nh4no30.5g，k2hpo4·3h2o0.5g，mgso4·7h2o0.5g，feso4·7h2o0.01g，ph7.2-7.5，20g琼脂。
(2)利用yg、btb、缺磷培养基和反硝化培养基从黑臭水体中筛选脱氮除磷假单胞菌，具体步骤：将污水或污泥菌种载体(来源于黑臭水体)与无菌水混合，制成浓度梯度为10-4、10-5和10-6倍的菌悬液，涂布于yg培养基平板上，反复划线分离直至获得单菌株；将单菌株接种于btb培养基平板，28℃培养36-48h，挑取菌落周围出现蓝色的菌株；先后在缺磷培养基和反硝化培养基中培养，监测tp和tn(总氮)含量变化，最终获得高效脱氮除磷假单胞菌；lb试管斜面冷冻保存。
yg培养基：每1000ml水中，酵母浸粉1g，葡萄糖1g，k2hpo40.3g，kh2po40.25g,mgso40.2g,ph7.2-7.4，20g琼脂(固体培养基2％琼脂)。
btb培养基：每1000ml水中，kno31g，kh2po41g，fecl2·6h2o0.5g，cacl2·7h2o0.2g，mgso4·7h2o1.0g，丁二酸钠8.5g，1％btb1ml，ph7.0。
缺磷培养基：每1000ml水中，葡萄糖5g，cacl20.2g，mgso4·7h2o0.5g，(nh4)2so42.0g，kcl0.2g，ph7.0。
反硝化培养基：每1000ml水中，丁二酸钠3.0g，kno30.75g，mgso40.5g，kh2po40.2g，kh2po40.2g，cacl20.2g，ph7.0。
(3)利用高氨氮选择性培养基从黑臭水体中筛选具有硝化功能的假单胞菌和粪产碱杆菌，具体步骤为：将污水或污泥菌种载体(来源于黑臭水体)与无菌水混合，制成10-4、10-5和10-6倍的菌悬液，分别加入至lb培养基中，培养18-24h；将扩培菌液稀释将103、104、105和106倍，均匀涂布于高氨氮择性培养基上，培养24-48h；挑取单一菌落，在高氨氮择性培养基上划线培养，对单菌株反复划线分离，直到获得纯菌株；lb试管斜面冷冻保存。
高氨氮选择性培养基：每1000ml水中，葡萄糖5.0g，(nh4)2so42g，nacl2.0g，k2hpo41g，mgso4·7h2o0.5g，feso4·7h2o0.4g,ph7.2-7.4。
(4)使用反硝化选择性培养基从黑臭水体中筛选具有反硝化功能的短小芽孢杆菌，具体步骤为：将污水或污泥菌种载体(来源于黑臭水体)与无菌水混合，制成10-3、10-4和10-5倍的菌悬液，分别加入反硝化选择性培养基(液体)中，30℃下110r/m条件下培养24h；将菌液稀释103、104、105和106倍，涂布于反硝化平板培养基上，30℃培养至有明显菌落，挑取后反复划线分离，直到获得纯菌株；lb试管斜面冷冻保存。
反硝化选择性培养基：每1000ml水中，kno32g，柠檬酸钠5g，k2hpo41g，mgso4·7h2o0.2g，ph7.0-7.2。
本发明的优点是：
(1)本发明提供的用于黑臭水体治理的复合微生物菌剂，能够有效降解黑臭水体中各主要污染物。其中，巨大芽孢杆菌具备有机物降解和絮凝作用，假单胞菌和粪产碱杆菌能够在去除cod的同时有效进行脱n除p，具有反硝化功能的短小芽孢杆菌有效去除tp，嗜热脂肪土芽孢杆菌对污水中cod尤其是短链脂肪、小分子蛋白降解具有明显效果。
(2)菌株从黑臭水体或污泥中分离筛选，能够保证获得菌株对黑臭水体中有机物、氨氮(nh3-n)和磷(p)的高效专一性；
(3)发明中规定了所筛选菌株的属和种，菌株不涉及致病菌，可广泛应用至实际水体治理中。
当然，实施本发明的任一产品或方法必不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
具体实施方式
黑臭水体采集于天津市北辰区青光镇某坑塘黑臭水，对原水进行菌株分离筛选：
(1)特定筛选培养基筛选芽孢杆菌。将污水(来源于黑臭水体)静置24h，将上清液与无菌水混合，按10-4、10-5和10-6倍梯度稀释制成菌悬液，加至特定筛选培养基(液体)中，培养24h；将扩培菌液稀释103、104、105和106倍，均匀涂布于改进的特定筛选培养基(固体)平板上，培养12h；挑取单菌落，对单菌株反复进行液体培养和划线分离，获得纯菌株巨大芽孢杆菌f5和嗜热脂肪土芽孢杆菌f32；lb试管斜面冷冻保存。
特定筛选培养基：每1000ml水中，葡萄糖2g，淀粉5g，nacl0.5g，kno30.5g，nh4no30.5g，k2hpo4·3h2o0.5g，mgso4·7h2o0.5g，feso4·7h2o0.01g，ph7.2-7.5；(固体培养基2％琼脂)。
(2)利用yg、btb、缺磷培养基和反硝化培养基筛选脱氮除磷假单胞菌。将污水上清液与无菌水混合，按10-4、10-5和10-6倍梯度稀释制成菌悬液，涂布于yg培养基平板上，反复划线分离直至获得单菌株；将单菌株接种于btb培养基平板，28℃培养48h，挑取菌落周围出现蓝色的菌株；先后在缺磷培养基和反硝化培养基中培养，根据tp和tn含量变化取优秀菌株，最终获得假单胞菌h4；lb试管斜面冷冻保存。
所用yg培养基：每1000ml水中，酵母浸粉1g，葡萄糖1g，k2hpo40.3g，kh2po40.25g,mgso40.2g,ph7.2-7.4(固体培养基2％琼脂)。
btb培养基：每1000ml水中，kno31g，kh2po41g，fecl2·6h2o0.5g，cacl2·7h2o0.2g，mgso4·7h2o1.0g，丁二酸钠8.5g，1％btb1ml，ph7.0。缺磷培养基：每1000ml水中，葡萄糖5g，cacl20.2g，mgso4·7h2o0.5g，(nh4)2so42.0g，kcl0.2g，ph7.0。
反硝化培养基：每1000ml水中，丁二酸钠3.0g，kno30.75g，mgso40.5g，kh2po40.2g，kh2po40.2g，cacl20.2g，ph7.0。
(3)利用高氨氮选择性培养基筛选具有硝化功能的假单胞菌和粪产碱杆菌。将污水上清液与无菌水混合，按10-4、10-5和10-6倍梯度稀释制成菌悬液，分别加入至lb培养基中，培养20h；将扩培菌液稀释将103、104、105和106倍，均匀涂布于高氨氮择性培养基培养基平板上，培养48h；挑取单菌落，在高氨氮固体平板培养基上划线培养，对单菌株反复划线分离，获得粪产碱杆菌h5；lb试管斜面冷冻保存。
所用高氨氮选择性培养基：每1000ml水中，葡萄糖5.0g，(nh4)2so42g，nacl2.0g，k2hpo41g，mgso4·7h2o0.5g，feso4·7h2o0.4g,ph7.2-7.4。
(4)使用反硝化选择性培养基筛选具有反硝化功能的芽孢杆菌菌株。将污水上清液与无菌水混合，按10-4、10-5和10-6倍梯度稀释制成菌悬液，分别加入反硝化选择性培养基(液体)中，30℃下110r/m条件下培养24h；将菌液稀释103、104、105和106倍，涂布于反硝化平板培养基上，30℃培养至有明显菌落，挑取后反复划线分离，获得短小芽孢杆菌f31；lb试管斜面冷冻保存。
所用反硝化选择性培养基：每1000ml水中，kno32g，柠檬酸钠5g，k2hpo41g，mgso4·7h2o0.2g，ph7.0-7.2。
制备用于黑臭水体治理的高效微生物复合菌剂，该菌剂包括假单胞菌、巨大芽孢杆菌、粪产碱杆菌、短小芽孢杆菌和嗜热脂肪地衣芽孢杆菌。菌剂的制备包括以下步骤：
(1)使用lb培养基分别接种上述菌株，于30℃、110r/min条件下培养24h进行菌种的活化；
(2)将各菌液于2000-3000r/min下离心2min后去除悬液，将菌体与pbs溶液混合均匀，调整pbs溶液使用量，使菌液微生物量达到约1×109cfu/ml；
(3)将上述浓缩菌液混合，假单胞菌：芽孢杆菌：短小芽孢杆菌：粪产碱杆菌：嗜热脂肪土芽孢杆菌按照2：2：2：1：1或2：2：1：1：1混合，制成复合菌剂；
保存方法涉及单菌株保存或复配菌剂的保存。单菌株保存时，将上述步骤(2)的浓缩菌液与50％甘油水溶液按照1：1比例混合，-20℃保存，使用前按照步骤(1)活化；混合后的复合菌剂保存时，与80％甘油水溶液按照2：1比例混合-80℃保存，有效期为12个月。
复合菌剂的使用方法：复合菌剂配制完成后1h内投加至黑臭水体中，投加量10-20ml/m3。非曝气条件下7天内可将黑臭水中cod指标均降到v类水限值(40mg/l)以下，降解率约85％；未实施除磷工艺条件下对黑臭水中磷具有明显吸附作用，水体中磷的去除率可以达到70％以上；氨氮在曝气条件下降解率达到90％以上。
以上对本发明所提供的一种用于黑臭水体治理的复合微生物菌剂、其获得方法及其使用方法进行了详细介绍。本文中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其中心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护。