一株果香型酿酒酵母及其在北京地区葡萄酒酿造中的应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域。本发明具体涉及一株果香型酿酒酵母及其在北京地区葡萄酒酿造中的应用。

背景技术：

葡萄酒的酿造离不开酿酒酵母，酿酒酵母不仅通过发酵作用将葡萄醪中的糖转化为酒精，还能通过一系列代谢作用对葡萄酒的风味、香气甚至结构产生影响。然而，目前我国几乎所有的葡萄酒生产企业在酿造时选用进口商业酿酒酵母，且各酒厂选择的商业酿酒酵母品牌类型比较集中，只通过区分红、白葡萄酒选择两种不同的商业酵母，对依据不同产地，不同酿酒葡萄品种、不同最终产品及目标产品香气、口感等特征选择不同酿酒酵母的意识薄弱，导致我国葡萄酒品质相对单一，缺乏特色，尤其是风土特色。我国地大物博，有着分布广泛而风格各异的葡萄酒产区，其中蕴藏着巨大葡萄酒酵母资源，及时开发我国多类别、有针对性、有产区及品种特色的本土酵母资源有助于我国各葡萄酒产区本土特色的形成，也有助于保护我国本土酿酒酵母资源的多样性。

北京的葡萄酒生产历史悠久，最早可以追溯到1910年(宣统二年)，法国圣母天主教会沈蕴璞修士在北京创建的上义洋酒厂。虽然生产历史较久，但北京市的葡萄酒产业发展十分缓慢，随着中国葡萄酒产业的迅速发展，近十几年，北京的房山、延庆、密云、通州等区上百个大小酒庄兴起。但针对北京地区的本土酿酒酵母的研究工作尚未开展。及时筛选出北京地区本土优质酿酒酵母，将有助于北京地区葡萄酒地域特色的形成，对推动北京地区葡萄酒产业又好又快地发展具有重要意义。目前尚无筛选自北京的酿酒酵母相关专利。

技术实现要素：

因此，本发明的目的是提供一株发酵性能好的筛选自北京地区的本土酿酒酵母，弥补我国市场上缺少本土酿酒酵母选择的不足。

本发明的另一目的是提供一株发酵性能好的酿酒酵母在酿造干红葡萄酒中的应用。

针对上述目的，本发明提供的技术方案如下：

本发明提供的酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)，名称为lh39，属于酵母属(saccharomycessp.)，分离自北京市房山区波龙堡酒庄葡萄园采摘成熟的红色酿酒葡萄品种——“赤霞珠”(cabernetsauvignon)葡萄果实。该菌株已于2017年9月4日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏地址：北京市朝阳区大屯路3号中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmccno.14592，建议分类命名为：酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)。

除非特别指明，酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)lh39cgmccno.14592，在本文中简称酿酒酵母lh39。

本发明提供的酿酒酵母lh39可用于葡萄酒酿造。利用酿酒酵母lh39酿造葡萄酒的优点在于：在北京地区本土葡萄醪当中，lh39表现出更好的果香，以其酿造出的葡萄酒果香突出，口感平衡，品质很高。因此，对于北京地区本土酿酒葡萄原料，接种酿酒酵母lh39，可以获得较好的果香，相较于进口商业酿酒酵母，能更好地呈现北京地区葡萄酒的特色，从而帮助北京地区葡萄酒产业形成自己的本土特色，促进整个产区葡萄酒产业发展。

附图说明

图1菌株lh39在wl培养基上的菌落形态。

图2对比样酿酒酵母f15中试试验发酵记录。

图3本发明的酿酒酵母lh39中试试验发酵记录。

具体实施方式

为了更好地理解与实施，下面结合实施例及附图详细说明本发明；所举实施例仅用于解释本发明，并非用于限制本发明的范围。

除非特别指明，以下实施例中所用的方法均为常规方法。

除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级别的试剂，且可从正规渠道商购获得。

除非特别指明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取统计平均值。

实施例中涉及的培养基配方如下：

ypd固体培养基(每1l)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂20g。

葡萄酒酵母wln鉴别培养基(每1l)：酵母粉4g，胰蛋白胨5g，葡萄糖50g，kh2po40.55g，kcl0.425g，cacl20.125g，mgso40.125g，fecl32.5mg，mnso42.5mg，琼脂20g，溴甲酚绿22mg。

实施例1酿酒酵母lh39的分离、纯化及其鉴定

本发明一株酿造性能好的的酿酒酵母，是从北京地区波龙堡酒庄葡萄园中赤霞珠葡萄品种中得到，筛选过程如下：

挑选摘取完整成熟、无霉果烂果的成串葡萄样品，样品设置三个平行，每份葡萄样品约1kg，保存于无菌袋中，当天采集的葡萄当天处理，无菌条件下将葡萄样品除梗，挑选完整、成熟、无病变霉变的果粒收集于500ml三角瓶中，以药匙在三角瓶内破碎葡萄，葡萄破碎后每瓶葡萄醪约400ml，添加亚硫酸1ml/l，搅拌均匀后以无菌封口膜封口，葡萄醪置于25℃条件下自然发酵。

从自然发酵第0天(葡萄破碎时)开始，前7天每24h无菌条件下取样一次，每次取1ml葡萄汁，以无菌水梯度稀释至10^-7，选取合适的3个稀释浓度各0.1ml，涂布于wln鉴别培养基平板，28℃条件下倒置培养72h。之后在葡萄醪菌群动态和化学成分变化平缓的发酵后期，第10天、第12天和第20天再次取样。挑选出菌落数为30-300个的平板，根据wln鉴别培养基对酵母菌分类鉴别的方法，对不同特点的菌落进行分类、编号，记录各类菌落特点及数目，并拍照存档。菌落形态不同、出现时期不同的每类酵母中，挑选2-3株保存于ypd斜面培养基中，于4℃条件下保存。酵母初步筛选完成后，防止菌落不纯，对菌株进行纯化。挑取单菌落以平板划线法于wln鉴别培养基平板上纯化菌株，28℃条件下倒置培养72h，记录每次纯化后的菌落特点并拍照存档，结合显微镜观察菌株纯度，每个菌株纯化2-3次。纯化后的酵母使用40％甘油冻存管于-80℃条件下保存，待分子鉴定。

提前活化待测酵母，将其接种于ypd液体培养基，于28℃，150rpm条件下恒温振荡培养12h，离心后取酵母细胞待用。使用天根酵母基因组dna提取试剂盒提取待测酵母基因组dna。选用引物对its1(5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’)和its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)对酵母rdna基因5.8sits区进行pcr扩增。pcr反应条件：95℃预变性5min；95℃变性1min，52℃退火2min，72℃延伸2min，循环35次；72℃补充延伸10min。pcr反应体系：10×pcrbuffer(taqbufferwithkcl)5μl，25mmol/lmgcl26μl，10mmol/ldntps1μl，10μmol/l引物各2.5μl，taq酶2.0u，模板dna1μl，加双蒸水定容至50μl。取6μl扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

pcr产物测序由北京华大基因和北京擎科新业生物技术有限公司完成。

通过美国国家生物技术信息中心(ncbi)网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)中的blast工具搜索待测菌株目的序列，进行相似序列搜索，根据同源序列的相似性初步确定lh39菌株的种属地位，同时校正测序图谱。比较lh39与已知酵母菌对应序列的相似程度，相似度超过99％，并通过lh39在wln鉴别培养基上的菌落形态和细胞显微形态最终鉴定待测菌株的种属地位。

其中，酿酒酵母lh39(保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为cgmccno.14592)的5.8sitsrdna的测序结果如seqidno.1所示。

与相关模式菌株酿酒酵母yjm271相似性：99.30％，鉴定为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)。

实施例2酿酒酵母lh39和商业酿酒酵母小型酿酒比较试验

将成熟美乐品种酿酒葡萄除梗破碎，以1l玻璃广口瓶作为葡萄酒发酵容器，lh39及来源酒庄使用的商业酿酒酵母共两组分别设置3个平行。酵母经活化后，接种于ypd液体培养基中，于28℃，150rpm条件下恒温振荡培养10h。向每个广口瓶中加0.8l葡萄醪，0.8ml亚硫酸。酵母按3％接种量接入葡萄醪。用蘸有亚硫酸的纱布清理广口瓶口、瓶盖，瓶盖倒放，置于25℃下发酵。葡萄醪开始发酵后，每天进行温度、糖度和比重的检测并记录。根据发酵情况适时搅拌。当葡萄酒比重不再下降时，取上层清液灌装，密封置于4℃冰箱中保存。

通过高效液相色谱法(hplc)对葡萄酒中还原糖、甘油、乙醇及部分有机酸含量进行测定，测定结果如表1所示。并根据gb/t15038-2006对葡萄酒基本理化指标进行检测。

表1测试菌株小型酿酒试验后酒样基本糖酸含量

小型酿酒试验结果显示，lh39的发酵性能稳定，酒样乙醇含量高于11(v/v％)，总糖不高于4g/l，挥发酸低于1.2g/l，符合gb15038-2006对干型葡萄酒相关指标的要求。另外，与商业酵母相比，lh39乙醇转化能力和甘油产量较高。

参照gb10220-2012中描述性检验步骤及gb15038-2006中的葡萄酒评分细则，邀请10位专业葡萄酒品评师对试验酒样进行盲品打分。依据葡萄酒品质的四个部分进行评分：外观和颜色(10分)，香气(30分)，口感和风味(40分)，总体评价(20分)，共计100分。葡萄酒感官评分表参照葡萄酒评价比赛中的感官分析用表(sensorialanalysistastingsheetforwinejudgingcompetitions)。感官品评分析结果见表2。

表2测试菌株小型酿酒试验感官品评试验结果

感官品评试验结果显示，以酿酒酵母lh39酿制的葡萄酒在外观、香气、口感、总体质量以及总分上均优于商业酿酒酵母，尤其果香表现突出，其酿造的干红葡萄酒香气丰富，回味也更有层次感。

实施例3酿酒酵母lh39和商业酿酒酵母的中试规模发酵试验

酿酒酵母lh39和法国laffort公司生产的商业酵母f15进行对照，用于酿造中试试验。中试试验在lh39对应的来源酒庄进行。发酵过程记录分别如图2和图3所示。

lh39经湖北安琪酵母公司实验室扩培制成冻干酵母粉后，采用赤霞珠葡萄进行酿造中试试验。由发酵记录可知，酿酒酵母lh39表现出了较强的发酵性能，在发酵中后期，lh39试验组发酵速度明显快于对照组f15。另外，与商业酵母比较，桶样品尝结果显示，lh39发酵的葡萄酒表现出了优异的果香，可与橡木香气平衡，而商业酵母发酵的葡萄酒则完全被橡木香气掩盖。

综上所述，优选野生酿酒酵母菌株lh39在酿造干红葡萄酒过程中，不但表现出优秀的发酵性能，而且以其酿造的葡萄酒果香突出，口感较好，是能够发挥出本土干红葡萄酒特色的优质酿酒酵母菌株，具备商业化应用的潜力。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一株果香型酿酒酵母及其在北京地区葡萄酒酿造中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>739

<212>dna

<213>saccharomycessp.

<400>1

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