本发明涉及一株酿酒酵母及其在发酵食品中的应用，属于工业微生物技术领域。
背景技术：
β-苯乙醇是一种具有玫瑰风味的芳香醇，天然存在于茉莉、玫瑰等植物精油中，同时作为一种重要的香精香料成分，在化妆品、烟草及日化用品中也广泛应用。β-苯乙醇作为微生物的次级代谢产物，在黄酒、料酒、酿造食醋、酱油、白酒等发酵产品中含量较高，同时作为发酵产品中特征的风味物质，可以提高发酵产品风味和整体品质。
苯乙醇是是苯丙氨酸前体物质苯丙酮酸脱羧过程中合成的。对于酿酒酵母，合成芳香族氨基酸的起始物是由磷酸烯醇式丙酮酸和4-磷酸赤癣糖二者缩合形成的3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(dahp)。dahp合成酶由两个亚基组成，一个亚基对苯丙氨酸的反馈抑制敏感(由aro3基因编码)，另一个对酪氨酸的反馈抑制敏感(由aro4基因编码)。芳香族氨基酸的合成步骤有七步是共同的，亦即从dahp到分支酸的合成步骤，分支酸是芳香族氨基酸合成途径的分支点，与苯丙氨酸合成有关，在分支酸变位酶(aro7基因编码)的作用下生成预苯酸，然后经过预苯酸脱水酶(pha2基因编码)生成苯丙酮酸，苯丙酮酸随后在氨基转移酶的作用下转氨生成苯丙氨酸，苯丙氨酸在丙酮酸脱羧酶以及焦磷酸硫胺素为辅酶的脱羧酶作用下脱羧生成苯乙醛，苯乙醛在乙醇脱氢酶的作用下脱水最终生成β-苯乙醇。
从上面我们可以看到β-苯乙醇代谢途径太长，支路太多，存在多种抑制作用，最终得到的产量并不高。但菌种发酵始终是发酵工业的前提和关键，通过对β-苯乙醇合成机理的研究从而提高菌种的耐受性，仍然是进一步提高β-苯乙醇产量的关键。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了一株pha2基因自发有义突变的高产β-苯乙醇特性且产酒精特性良好的酿酒酵母菌株，及其在黄酒、料酒、酿造食醋、酱油、白酒中的应用。
本发明的第一个目的是提供一株高产β-苯乙醇的酿酒酵母，所述酿酒酵母表达了氨基酸序列如seqidno.1所示的预苯酸脱水酶pha2p。
在本发明的一种实施方式中，所述的预苯酸脱水酶是在氨基酸序列如seqidno.2所示的序列上发生有义突变所得。
在本发明的一种实施方式中，预苯酸脱水酶是在如seqidno.2所示的氨基酸序列基础上，第161位的异亮氨酸突变为赖氨酸，第239位的亮氨酸突变为脯氨酸，以及第250位的谷氨酰胺突变为组氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述预苯酸脱水酶相对于亲本预苯酸脱水酶，其催化能力提高了22％。
在本发明的一种实施方式中，所述预苯酸脱水酶受到l-苯丙氨酸的反馈抑制。
在本发明的一种实施方式中，所述的酿酒酵母于2017年9月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为cctccno:m2017488。
在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母的菌落为白色，圆形或者椭圆形，边缘整齐。
在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母是从黄酒发酵醪液中筛选出来的。
本发明的第二个目的是提供所述的酿酒酵母在发酵食品中的应用。
本发明的第三个目的是提供所述的酿酒酵母在酒类、食醋或酱油酿造中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述酒类为白酒、黄酒、料酒或果酒。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是用于黄酒酿造，使用所述酿酒酵母作为酒母。
在本发明的一种实施方式中，所述黄酒酿造是将所述酿酒酵母作为酒母，按照5％-10％的添加量添加到蒸煮或糊化好的原料中，经发酵、压榨、煎酒、陈酿、过滤、灭菌灌装得到黄酒。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是用于料酒酿造。
在本发明的一种实施方式中，所述料酒酿造是先利用所述酿酒酵母作为酒母酿造得到黄酒，再利用得到的黄酒制备成料酒。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是用于酿造食醋。
在本发明的一种实施方式中，所述酿造食醋是先利用所述酿酒酵母作为酒母酿造得到黄酒，再利用得到的黄酒作为醋酸发酵原料来酿造食醋。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是用于酿造白酒。
在本发明的一种实施方式中，所述酿造白酒，是在白酒发酵入池发酵时额外添加所述酿酒酵母。
在本发明的一种实施方式中，所述酿造白酒时酿酒酵母额外添加量为1％。
本发明的第四个目的是提供含有所述酿酒酵母的微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂为固态菌剂或液态菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂含有所述酿酒酵母菌体的活细胞、冷冻干燥得到的所述酿酒酵母干菌体、固定化的所述酿酒酵母细胞、所述酿酒酵母的液体菌剂、所述酿酒酵母的固体菌剂，或者以其他任何形式存在的酿酒酵母菌株。
本发明的第五个目的是提供所述微生物菌剂在发酵食品中的应用。
本发明有益效果：
(1)本发明获得了一株高产β-苯乙醇特性且产酒精特性良好的酿酒酵母菌株。
(2)本发明获得了一株在β-苯乙醇合成途径中pha2基因编码的预苯酸脱水酶自发突变，不同于其他酿酒酵母的高产苯乙醇的酵母菌株。对此株酵母的预苯酸脱水酶的酶学特性进行研究，我们发现此株酿酒酵母的预苯酸脱水酶其催化能力增强了22％。并且发现此株酿酒酵母pha2p受到l-苯丙氨酸的反馈抑制。
(3)本发明的酿酒酵母菌株可以用于黄酒、料酒、食醋、酱油、白酒的酿造；应用于这些产品的酿造时，可以产生高浓度的β-苯乙醇、具有较高的酒精生产能力。
生物材料保藏
酿酒酵母11-1saccharomycescerevisiae11-1，于2017年9月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为cctccno:m2017488。
附图说明：
图1是黄酒工艺流程图。
具体实施方式
实施例1：高产β-苯乙醇酵母菌株筛选及序列比对
本发明所述酿酒酵母菌株是从黄酒发酵醪液中筛选出来的，添加酒药制作的黄酒发酵醪工艺流程见图1，酒度可达到13°，苯乙醇含量约120mg/l，此黄酒发酵醪液酒精特性良好且耐苯乙醇。吸取黄酒醪液，逐级稀释，涂布ypd培养基，通过划线纯化，对此黄酒发酵醪液中微生物进行筛选，我们最终得到一株高产且耐受苯乙醇的酿酒酵母11-1，于2017年9月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为cctccno:m2017488。
我们通过高保真dna聚合酶扩增酿酒酵母模式菌株s288c和筛选出来的酿酒酵母11-1菌株，上述参与β-苯乙醇合成的基因的编码区，进行测序及比对，我们成功找到了有差异的编码基因或调控序列。我们对其β-苯乙醇代谢途径中的关键基因进行了pcr扩增，连接t载体，并且送由南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序，并且成功得到测序结果。
序列比对步骤：在ncbi上与酿酒酵母模式菌株s288c比对blast，成功得到此途径中不同于其他酿酒酵母的关键基因pha2基因。使用dnaman操作软件绘制，序列比对结果发现相对于酿酒酵母模式菌株s288c的pha2基因编码的氨基酸序列seqidno.2，第161位的异亮氨酸突变为赖氨酸，第239位的亮氨酸突变为脯氨酸，以及第250位的谷氨酰胺突变为组氨酸。
实施例2：预苯酸脱水酶pha2p酶学性质
与模式酵母菌株s288c-pha2基因比对发现，以酿酒酵母11-1基因组为模板，pcr扩增得到了自然突变基因(i161k、l239p、q250h)，用融合表达载体pet-28a进行野生型和突变体蛋白的原核表达，在非变性条件下用histraptmhp进行亲和层析纯化，成功得到电泳纯的目的蛋白，大小与预期相符。
酶活测定反应体系：0.4毫升测定体系
加水补齐体积，45℃保温5min，加入800ul1.5mol/lnaoh终止反应，反应终止后，离心5min去除蛋白沉淀，移取200ul到酶标仪测定96孔板中，测定320nm光吸收值，用苯丙酮酸做标准曲线，计算反应酶活性。
温度对酶活的影响：分别设置30、40、50、60、70、80℃这6个梯度，加入酶液后在此温度下放置20min，然后在45℃下加入预苯酸鋇反应5min，添加1.5m氢氧化钠终止反应，测得苯丙酮酸生成量。分别以在最适反应条件下的酶活为100％。
外源添加苯丙氨酸对酶活力的影响：配置100mmol/l苯丙氨酸母液。使苯丙氨酸的浓度分别为0，1.0，5.0，10.0，15.0，20.0，40.0mmol/l(总体系0.4ml)，加入酶液，以未加入的苯丙氨酸的酶活性为100％，测定并计算相对酶活。
表1pha2重组子酶活性测定
表2温度对预苯酸脱水酶(pha2p)酶活性影响
表3外源添加苯丙氨酸对预苯酸脱水酶酶活性
对纯化后的野生型和突变型酶蛋白的热稳定性、催化活性、抗苯丙氨酸反馈抑制的能力进行测定。结果表明：野生型突变菌株比酶活高出野生菌株22.60％，突变菌株热稳定型较模式菌株也提高了，但两者均受到苯丙氨酸的反馈抑制。
实施例3：高产β-苯乙醇酵母在黄酒中的应用
分别采用模式酵母菌株s288c和酿酒酵母11-1制作酒母，然后用于黄酒发酵，并采用液相色谱仪进行检测，苯乙醇检测方法(采用watersxbridgec18柱子，流动相甲醇：水＝1：1，流速0.8ml/min，柱温30℃)。
(1)酒母制作：50mlypd摇瓶接种酵母菌株，30℃、200r/min培养24h。1kg蒸熟米饭(含水率为70％)中加入水1l、麦曲0.05kg，搅拌均匀，60℃保温4h，冷却后按5％接种酵母菌液，30℃、200r/min培养16h；
(2)蒸熟米饭(含水率为70％)，加入等重量清水，2％麦曲、5％酒母，搅拌均匀。
(3)发酵与搅拌：发酵温度为28℃，落料完成后开始计时，每隔8h进行搅拌，至48h时共搅拌6次。发酵5-7天，检测酒精度指标不再升高时结束发酵。
(4)压榨：发酵结束后，发酵醪液过板框过滤机进行压榨得到清酒。
(5)煎酒：清酒过煎酒灭菌机85℃灭菌30min。
(6)陈酿：煎酒后清酒入陈酿罐陈酿6个月。
(7)过滤：陈酿后清酒用硅藻土过滤机和膜过滤机过滤除去杂菌及杂质。
(8)灭菌灌装：过灭菌机，85℃灭菌30min，热灌装。
所得产品用高效液相法检测β-苯乙醇含量，发现β-苯乙醇的产量结果见表4。酒精度含量见表5。
表4黄酒发酵醪液β-苯乙醇产量结果
表5黄酒发酵醪液酒精度产量结果
实施例4：高产β-苯乙醇酵母在料酒中的应用
按实施例3中酿造工艺获得黄酒，加入食盐10％，过灭菌机85℃灭菌30min热灌装。所得产品用高效液相法检测到模式菌株发酵组的料酒中，苯乙醇含量为40mg/l，酒精度为7°，而酿酒酵母11-1发酵组中β-苯乙醇含量高达125mg/l，酒精度为13％(v/v)。
实施例5：高产β-苯乙醇酵母在酿造食醋固态发酵中的应用
以实施例3中工艺发酵黄酒，作为醋酸发酵原料。
醋酸发酵采用固态发酵工艺：将大糠、麸皮、黄酒按照1:4:10的比例拌匀，接入5％醋醅，接种后1-2天内每天从物料表面翻醅，温度为35-40℃。到6-8天时翻到物料底部。第8-12天，每天从底部翻醅，温度自然下降。从醋醅中分离后得生醋，在经过85℃灭菌30min后陈酿12个月。在灌装前经过高温灭菌后热灌装。
所得固态发酵酿造食醋中模式菌株发酵组醋酸含量为29g/l，β-苯乙醇含量小于20mg/l，酿酒酵母11-1发酵组醋酸含量为60g/l，β-苯乙醇含量高达70mg/l。
实施例6：高产β-苯乙醇酵母在酿造酱油高盐稀态发酵中的应用
酿造酱油选用高盐稀态法发酵，豆粕和小麦按1:1比例混匀蒸熟。米曲霉接种量为10％，控制温度为30℃，加入2倍物料质量的盐水，酱醪含盐量为18％、含水量为65％，搅拌混匀。酿酒酵母11-1用ypd摇瓶培养，按5％接种量接入部分蒸熟冷却后的豆粕和小麦中，加入2倍体积清水，30℃、200r/min培养24h制成酿酒酒母11-1酒母，等待加入酱醪中。酱醅起始发酵温度为15℃，随着发酵进行温度升高为15-35℃，在温度升高到20℃时接入酿酒酵母11-1酒母。发酵时间为5个月。
发酵结束后的酱醪经过板框压榨，去除酱醅。压榨结束后进行硅藻土过滤和膜过滤，去除沉淀。过滤澄清的酱油经过85℃灭菌30min热灌装。高产β-苯乙醇酵母用于高盐稀态法发酵，所得酱油产品中含有β-苯乙醇50mg/l。
实施例7：高产β-苯乙醇酵母在白酒中的应用
采用两轮发酵法，第一轮发酵时高粱蒸熟后，风冷降温至28℃，添加4％米曲霉，28℃培养24h。添加稻壳10％、曲15％、麸皮8％、按1％接入ypd摇瓶培养的酿酒酵母11-1，密闭发酵30天后蒸酒。二次发酵时添加中温大曲10％、按1％接入ypd摇瓶培养的cctccm2017488酵母，发酵15天后蒸酒。两种酒勾兑成酒精度60％(v/v)，β-苯乙醇含量为40mg/l。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110>江南大学
<120>一株酿酒酵母及其在发酵食品中的应用
<160>2
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>334
<212>prt
<213>人工序列
<400>1
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