一株枯草芽孢杆菌菌株及其应用的制作方法

本发明涉及菌株培育
技术领域：
，更为具体地说，涉及一株枯草芽孢杆菌菌株及其应用。
背景技术：
：土传病害是指病原体如真菌、细菌、线虫和病毒随病残体生活在土壤中，条件适宜时从作物根部或茎部侵害作物而引起的病害。包括立枯、纹枯、青枯、枯萎、疫病、猝倒、根腐、软腐、根结线虫、胞囊线虫等众多植物的土传病害。这些病害通常侵染植物根部或茎部，从而引起作物根茎部乃至全株发病，造成重大经济损失。目前主要是通过化学药剂对土传病害进行防控，而化学药剂的长期使用，会造成水源土壤污染、生态平衡被破坏、农药残留、次要病害猖獗和使病源微生物产生抗药性等一系列严重的后果。随着人们环保意识的增强，对食品安全问题的重视，以及对生态环境建设，保护生物多样性和农业可持续发展的要求，使得生物防控土传病害成为当前研究和开发的热点。芽孢杆菌(Bacillussp.)是一类产芽孢的革兰氏阳性细菌，好氧或兼性厌氧生活，能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和抗有机溶剂的内生孢子，所产芽孢可制成粉剂、可湿性粉剂等各种剂型，且与化学农药混用后不失活，是理想的生防菌筛选对象。在芽孢杆菌中，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种具有广谱抑菌活性的细菌，该枯草芽孢杆菌具有较强的代谢产物产生能力，能够产生多种抑菌物质，因而具有较好的应用前景。技术实现要素：本发明的目是在于提供一株枯草芽孢杆菌IBFCBF-4及其在防治真菌病害中的应用，使用本发明提供的枯草芽孢杆菌及其所生产的发酵液能够有效防治植物土传真菌病害。为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一株枯草芽孢杆菌菌株，所述枯草芽孢杆菌菌株为枯草芽孢杆菌IBFCBF-4，且所述枯草芽孢杆菌IBFCBF-4保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.11233。所述枯草芽孢杆菌IBFCBF-4的菌落呈微黄色，不透明，圆形或不规则形，边缘不整齐，表面粗糙褶皱。所述的枯草芽孢杆菌IBFCBF-4的制备方法，包括以下步骤：步骤1，采集土样，土样要求盐碱地pH值9.5～10.5，盐碱度0.60～0.70％；步骤2，将土样制成不同浓度的土壤悬浮液；步骤3，将所述土壤悬浮液加入到NA培养基平板上进行涂布处理，培养得到菌落；步骤4，挑选形态不一的单菌落进行划线保种，培养得到分离菌；步骤5，将病原菌菌块接种到PDA培养基平板的中心，在距平板中心等距离处接种所述分离菌，培养后选择抑菌圈最大的为枯草芽孢杆菌IBFCBF-4。所述病原菌菌块为油茶炭疽病原菌菌块。在一个具体实施方式中，步骤3培养温度为28～32℃，步骤5培养温度为23～27℃。所述的枯草芽孢杆菌IBFCBF-4的应用，所述枯草芽孢杆菌IBFCBF-4及所述枯草芽孢杆菌IBFCBF-4的发酵液应用于防治真菌病害。进一步的，所述真菌病害为土传菌病害。优选的，所述土传菌病害为油茶炭疽病原菌、立枯丝核菌、亚麻炭疽菌、尖镰孢亚麻专化型、辣椒疫霉菌、番茄灰霉菌、尖孢镰刀菌、禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌、禾谷丝核菌、早疫病菌、禾顶囊壳菌或核盘菌。在一个具体实施方式中，所述解枯草孢杆菌IBFCBF-4的发酵液的制备包括：将枯草芽孢杆菌IBFCBF-4接种在液体发酵培养基中，在25-30℃进行发酵培养，摇床震荡2-4天，得到枯草芽孢杆菌IBFCBF-4的发酵液。在一个具体实施方式中，所述液体发酵培养基按照浓度包含以下组分：8～12g/L的胰蛋白胨，2～4g/L的牛肉粉，15～25g/L的葡萄糖，4～6g/L的NaCl，液体发酵培养基的pH为7.2-7.4。本发明提供的枯草芽孢杆菌菌株IBFCBF-4具有抗真菌范围广、拮抗效果显著的特性，因而具有良好的工业化应用前景。同时，本发明提供的枯草芽孢杆菌菌株IBFCBF-4对农作物具有很好的促生长效果。尤其是，IBFCBF-4对油茶炭疽病原菌具有明显的抑制作用，田间试验表明IBFCBF-4对油茶炭疽的防治效果显著高于IBFCBF-1。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌IBFCBF-4的制备流程图；图2是本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌IBFCBF-4的菌落形态图；图3是本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌IBFCBF-4的革兰氏染色图；图4是本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌IBFCBF-4的芽孢染色图；图5是本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌IBFCBF-4的PCR产物琼脂糖电泳图；图6是本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌IBFCBF-4的16S序列构建的系统发育树图；图7是本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌IBFCBF-4与IBFCBF-1平板拮抗油茶炭疽病原菌对比示意图；图8是本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌IBFCBF-4防治辣椒疫病的示意图。具体实施方式本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌菌株，使本发明提供的枯草芽孢杆菌及其所生产的发酵液能够有效防治植物土传真菌病害。为了使本
技术领域：
的人员更好地理解本发明实施例中的技术方案，并使本发明实施例的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明实施例中的技术方案作进一步详细的说明。本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌菌株为枯草芽孢杆菌IBFCBF-4，所述枯草芽孢杆菌IBFCBF-4于2015年8月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCCNo.11233。请参考附图1，附图1示出了本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌IBFCBF-4的制备流程图。本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌IBFCBF-4的制备步骤为：S01：通过多点采样法采集土样，并将采集到的土样研细，本发明实施例中的土样取自吉林长岭，盐碱地pH值10.0，盐碱度0.65％。；S02：将研细的土样放入装有无菌水的离心管中充分震荡，制成浓度为10-1的土壤悬浮液；S03：将所述土壤悬浮液梯度稀释，得到不同浓度的土壤悬浮液；S04：选取浓度为10-5、10-6和10-7的土壤悬浮液，并加入到NA培养基平板上进行涂布处理，放到30℃的培养箱中培养，得到菌落；S05：挑选形态不一的单菌落进行划线保种，培养24小时，得到分离菌，将所述分离菌置于4℃的冰箱中保存备用；S06：用直径0.5cm的打孔器将亚麻立枯、辣椒疫酶、油茶炭疽病原菌菌块分别接种于不同的PDA培养基平板中心(亚麻立枯、辣椒疫酶菌块是作为对比)，在距平板中央2.5cm十字交叉处等距离接种不同的分离菌，以不接种分离菌为对照(CK)，每次处理进行3次重复实验，在温度为25℃条件下培养，当对照组(CK)长满全部器皿时，记录抑菌圈的大小，选择对油茶炭疽病原菌抑菌圈最大的为枯草芽孢杆菌IBFCBF-4。其中，NA培养基为营养琼脂培养基，该营养琼脂培养基的组成按照浓度包括10g/L的胰蛋白胨，3g/L的牛肉粉，5g/L的NaCl，20g/L的琼脂。NA培养基在制备时的pH值为7.2～7.4，并经过20min的灭菌处理，且灭菌时的温度为121℃。PDA培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基。本发明实施例提供了枯草芽孢杆菌IBFCBF-4和IBFCBF-1(专利申请号201510867702.4)拮抗油茶炭疽病原菌的对比示意图，示意图请参考附图7(左侧为IBFCBF-4)。从附图7中能够看出，当对照组全部长满器皿时，接种有枯草芽孢杆菌IBFCBF-4分离菌的PDA培养基上出现了明显的抑菌圈，且抑菌圈的直径均在2.0cm以上，其抑菌圈大小显著高于IBFCBF-1对油茶炭疽的抑菌圈大小1.2cm。由抑菌圈的出现能够说明本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌IBFCBF-4对油茶炭疽病原菌具有明显的抑制作用，因而能够很好的应用于防治真菌病害，田间试验表明IBFCBF-4对油茶炭疽的防治效果达74.40％，显著高于IBFCBF-1的防治效果40.69％。表1：IBFCBF-1与IBFCBF-4处理后油茶炭疽病发生情况处理施药前病情指数施药后14d病情指数防治效果(％)清水对照20.63±1.45a38.52±2.42a—IBFCBF-122.13±1.33a32.74±2.27b40.69±4.69bIBFCBF-419.27±0.88a23.85±2.18c74.40±2.23a其中防治效果％＝[(对照组施药前病情指数-对照组施药后病情指数)-(处理组施药前病情指数-处理组施药后病情指数)]/(对照组施药前病情指数-对照组施药后病情指数)×100。本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌IBFCBF-4的发酵液的制备包括：将枯草芽孢杆菌IBFCBF-4接种在液体发酵培养基中，在25-30℃进行发酵培养，摇床震荡2-4天，得到枯草芽孢杆菌IBFCBF-4的发酵液。其中，摇床震荡的转速为180r/min。液体发酵培养基按照浓度包含以下组分：10g/L的胰蛋白胨，3g/L的牛肉粉，20g/L的葡萄糖，5g/L的NaCl。液体发酵培养基在制备时的pH值为7.2～7.4，并经过20min的灭菌处理，且灭菌时的温度为121℃。本发明对本发明实施例提供的菌株进行了鉴定，该鉴定包括以下内容：1、形态学鉴定将本发明实施例提供的菌株划线到NA培养基平板上，然后将平板倒转，在温度为30℃的条件下培养24h，观察并记录平板上菌落的生长情况。本发明实施例提供的菌株的菌落形态图请参考附图2。从附图2中能够看出，本发明实施例提供的菌株的菌落呈微黄色，不透明，圆形或不规则形，边缘不整齐，表面粗糙褶皱。进一步，用试剂盒对本发明实施例提供的菌株进行革兰氏染色和芽孢染色，并在油镜下观察菌株和对菌株进行拍照。该菌株的革兰氏染色和芽孢染色请参考附图3和附图4。从附图3中能够看出，经革兰氏染色后，本发明实施例提供的菌株为杆状，且呈蓝紫色，为革兰氏阳性菌。从附图4中能够看出，经芽孢染色后，本发明实施例提供的菌株菌体显蓝色，芽孢显红色，由此说明本发明提供的菌株能够产生芽孢。2、生理生化鉴定(1)接触酶实验在菌株的液体培养液中直接滴加3％的过氧化氢，立即观察。若有大量气泡产生，则为阳性；若不产生气泡，则为阴性。本发明提供的菌株立即产生大量气泡，实验结果为阳性。(2)氧化酶实验取白色洁净滤纸一角，蘸取少量的菌株菌落，加入浓度为1％的盐酸二甲基对苯二胺水溶液一滴，阳性者立即呈粉红色，且颜色会逐渐加深。在此次实验中，菌落呈粉红色，颜色逐渐加深，实验结果为阳性。(3)淀粉水解实验将菌株的菌种点接到淀粉培养基上，在温度为37℃的条件下培养24h，滴加少量碘液在淀粉培养基平板上，轻轻旋转，使碘液均匀分布在淀粉培养基平板上，观察菌落周围的情况。若菌落周围出现无色透明圈表明有水解淀粉的能力，反之，则没有。本菌株菌落的周围有透明圈产生，由此能够说明本菌株具有水解淀粉的能力。(4)甲基红MR实验挑取少量的本菌株，并接种于通用培养基上，在温度为30℃的条件下培养3～5天，培养结束后取培养液1ml，并加入甲基红指示剂1～2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。在此次实验中，菌液变黄，所以为阴性。(5)VP实验挑取少量的本菌株，并接种于通用培养基，在温度为30℃的条件下培养4天，培养结束后取培养液2.5ml先加入a萘酚纯酒精溶液0.6ml，再加入浓度为40％的氢氧化钾水溶液0.2ml，摇动2-5min，阳性菌通常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或30℃的恒温箱中，若2h内仍不显现红色，则可判定为阴性。在此次实验中，菌液立即变红，所以为阳性。(6)明胶液化实验取本菌株，穿刺接种于明胶中，并使本菌株位于明胶深度的2/3处。在温度为20℃的条件下培养5-7d。每天观察结果本菌株是否被细菌液化，若被液化，则为试验阳性；若不被液化，则为阴性。在此次实验中，明胶被液化，因此本菌株为阳性。(7)硝酸盐还原实验将本菌株接种于硝酸盐肉汤中，在温度为28℃的条件下摇床培养3d，然后取5mL培养液，按试剂盒(海博生物技术有限公司硝酸盐还原试剂盒)说明加入显色剂，变黄为阳性，反之，不变色为阴性。在此次实验中，菌液变黄，说明本菌株为阳性。(8)产硫化氢实验将本菌株穿刺接种于醋酸铅培养基中，在温度为35℃的条件下培养24～48h，并观察结果。若培养基变黑，则为阳性；不变黑，则为阴性。在此次实验中，培养基变色，说明本菌株为阳性。(9)柠檬酸盐利用实验挑本菌株在西蒙斯氏柠檬酸盐培养基斜面上划线接种,在温度为37℃的条件下培养3-7天。若培养基为碱性者，即指示剂蓝色或桃红色的为阳性；若培养基不变色，则为阴性。在此次实验中，培养基未变色，说明本菌株为阴性。(10)卵磷脂酶活性实验用75％的乙醇将新鲜鸡蛋的表面进行消毒，并用灭菌的镊子将鸡蛋打个孔，倾去蛋清，然后用无菌吸管吸出卵黄，加入到融化后冷却至50℃左右的NA培养基中，混和均匀后放倒平板，点接本菌株，在温度为30℃的条件下培养24h，并进行观察。若菌落边缘出现浑浊圈者为酶阳性。在此次实验中，菌落边缘出现明显的浑浊圈，说明本菌株为阳性。(11)丙二酸盐利用实验挑取培养12h菌苔接种于丙二酸盐培养基，在温度为35℃的条件下培养24-48h，培养基由绿变蓝者为阳性，反之为阴性。在此次实验中，培养基变色，说明本菌株为阳性。(12)葡萄糖发酵实验挑取少量本菌株穿刺接种于葡萄糖氧化发酵培养基，在温度为30℃的条件下培养3d，观察培养基颜色的变化。若无颜色变化，则需要继续观察7d，培养基变黄者为发酵型。在此次实验中，培养基变黄，说明本菌株为阳性。(13)纤维素分解实验涂布平板于羧甲基纤维素钠固体培养基上，待有明显菌落时，向平板中滴入一滴管刚果红染液，并使刚果红染液均匀的分布在平板上。15分钟后加入1ml氯化钠溶液，浸泡15分钟后，洗去染色，观察是否产生透明圈。若有透明圈产生，则为阳性。在此次实验中，有透明圈产生，说明本菌株为阳性。(14)半乳糖利用实验阳性将本菌株接种在半乳糖培养基中，在温度为30℃的条件下培养2d，观察菌落生长情况，若菌落形成，则可以利用半乳糖，反之，不行。在此次实验中，菌体生长，说明本菌株可以利用半乳糖。(15)阿拉伯糖利用实验将本菌株接种于阿拉伯糖培养基中，在温度为30℃的条件下培养2d，观察菌落生长情况，若菌落形成，则可以利用阿拉伯糖，反之，不行。在此次实验中，菌体不生长，说明本菌株不可以利用阿拉伯糖。(16)甘露糖利用实验将本菌株接种于甘露糖培养基中，在温度为30℃的条件下培养2d，观察菌落生长情况，若菌落形成，则可以利用甘露糖，反之，不行。在此次实验中，菌体生长，本菌株可以利用甘露糖。(17)D-果糖利用实验将本菌株接种于D-果糖培养基中，在温度为30℃的条件下培养2d，观察菌落生长情况，若菌落形成，则可以利用D-果糖，反之，不行。在此次实验中，菌体生长，本菌株可以利用D-果糖。(18)D-木糖利用实验将本菌株接种于D-木糖培养基中，在温度为30℃的条件下培养2d，观察菌落生长情况，若菌落形成，则可以利用D-木糖，反之，不行。在此次实验中，有菌落形成，本菌株可以利用D-木糖。综上，生理生化鉴定结果如表2。表2：本菌株的生理生化鉴定结果表性特征反应特征表性特征反应特征接触酶测定+柠檬酸盐利用+氧化酶测定+卵磷脂酶活性测定+淀粉水解测定+丙二酸盐利用+甲基红MR测定—纤维素分解+VP实验+半乳糖利用+明胶液化测定+阿拉伯糖利用—硝酸盐还原测定+甘露糖利用+葡萄糖发酵+D-果糖利用+产硫化氢测定—D-木糖利用+其中，+表示为本菌株有反应或可以利用，-表示为本菌株没有反应或不可以利用。3、16SrDNA序列分析本发明实施例采用康为世纪生物科技有限公司基因组提取试剂盒提取本菌株中的DNA。其中，上述提取试剂盒包括50μL的PCR反应体系，而PCR反应体系包括25μL的2×MasterMix；2.5μL的上游引物；2.5μL的下游引物；18μL的ddH2O；2μL的模板DNA。PCR反应条件为：在温度为94℃预变性5min；94℃变性0.5min；53℃退火0.5min；72℃延伸1min；30个循环，72℃延伸5min，4℃保存。请参考附图5，附图5示出了本发明实施例提供的芽孢杆菌IBFCBF-4的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测的电泳图。PCR产物由长沙维世尔生物科技有限公司进行测序，测序结果参见附表中的核苷酸序列。将所得序列通过NCBI—BLAST进行同源性序列比对分析，得到相似性较高的序列。运用MEGA6.06软件构建系统发育树，本菌株的16SrDNA序列与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的同源性达到100％，本菌株的发育树图请参考附图6。综合上述形态学观察、生理生化鉴定及16SrDNA序列分析结果，能够确定本菌株IBFCBF-4为枯草芽孢杆菌科芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，其被命名为枯草芽孢杆菌IBFCBF-4。本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌IBFCBF-4及其发酵液能够应用于防治真菌病害，该真菌病害为土传菌病害为立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、亚麻炭疽菌(Colletotrichumlinicola)、尖镰孢亚麻专化型(FusariumoxysporumSchltdl.exSnyderetHansenf.sp.lini)、辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)、番茄灰霉菌(Botrytiscinerea)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、禾谷镰刀菌(F.graminearum)、串珠镰刀菌(F.verticillioides)、禾谷丝核菌(R.cerealis)、早疫病菌(Alternariasolani)、禾顶囊壳菌(Gaeumannomycesgraminis)或核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)等的土传菌病害。本发明实施例以辣椒疫霉菌为例进行了枯草芽孢杆菌IBFCBF-4及其发酵液对真菌病害的研究，研究内容如下。(1)培养基的选用枯草芽孢杆菌IBFCBF-4的培养采用NB液体培养基(即牛肉膏蛋白胨液体培养基)，该NB液体培养基的制备包含10g的蛋白胨，3g的牛肉粉和5g的NaCl，上述物质使用去离子水定容至1000ml，并调节pH值为7.2-7.4，然后在1×105Pa的压力下灭菌20min，制得NB液体培养基。辣椒疫酶病原真菌采用PDA液体培养基，该PDA液体培养基的制备包括200g的去皮马铃薯，20g的葡萄糖，上述物质使用去离子水定容至1000mL，然后在1×105Pa的压力下灭菌20min，制得PDA液体培养基。(2)辣椒品种的选择辣椒选用湖南省农业科学院蔬菜研究所提供的甜椒品种茄门。将茄门的种子用浓度为10％的双氧水进行表面消毒20min，然后用无菌水冲淋3遍，并放置于的培养皿中，在温度为30℃的条件下恒温暗光催芽。选取芽长为0.5cm的种子播于9孔钵中，基质为市售营养土，辣椒置于30±1℃的人工气候室中进行培养，此时光照的强度为12000Lux，光照周期为L︰D＝14︰10，RH＝80％±10％。(3)具体实验设计实验共分为3组：CK1：NB培养基；CK2：清水；T：枯草芽孢杆菌IBFCBF-4菌液。其中，枯草芽孢杆菌IBFCBF-4在温度为30℃，转速为180r/min的条件下培养48h，然后用无菌水将菌液稀释至105CFU/mL。辣椒疫酶病原菌在温度为30℃，转速为180r/min的条件下培养7d，然后用无菌水将菌液稀释至105CFU/mL。在实验时，9孔钵中每孔播种出芽的辣椒种子一粒，保证9钵辣椒苗存活，并将9钵辣椒苗分为三组，每组三钵,待辣椒培养至3-4叶期时，在辣椒的根际施加辣椒疫酶病原菌菌液2.5mL，然后向分为三组的株苗中分别添加2.5mL的NB培养基、清水和枯草芽孢杆菌IBFCBF-4菌液。每隔2d每孔施加5mL营养液，以保证基质较为湿润，辣椒能够正常生长。观察辣椒生长态势，60d后对辣椒进行株高、茎粗、节间距、叶片叶绿素含量、上半部分鲜重及干重和根系鲜重及干重等生长指标的测定，统计每组辣椒疫病发病株数。(4)测量方法测量时从辣椒植株基部至主茎顶部即主茎生长点之间的距离为株高，植株近根结的第一节茎的直径为茎粗。随机每株选三片叶子,用叶绿素计测量其叶绿素含量。植株每小节茎的长度为节间距，本实验选取近根结的前三节。将辣椒植株从近根结的第一个节点剪断，分别称取上半部分和根系部分的重量，记为鲜重，然后放置到85℃的烘箱中烘干至恒重，再次分别称取其重量，记为它们的干重。实验结果请参考表3、表4和附图8。表3：三种不同处理方法对辣椒生长的影响表4：用三种不同方法处理的辣椒疫病发生情况处理发病株数(株)发病率(％)防治效果(％)T1.67±0.33b18.52±3.7b64.45±2.22aCK13.67±0.33a40.74±3.7ab17.78±9.69aCK24.67±0.88a51.85±9.8a—其中，发病株率％＝发病株数/调查总株数×100；防治效果％＝(1-处理组发病株率/对照组发病株率)×100。从表2中能够看出，T组的处理使辣椒具有更高的株高、更粗的茎，且第二节节距、第三节节距、叶绿素含量、上半部分鲜重、上半部分干重、根鲜重和根干重数据都比其余两组的数据要大。同时，从附图8中能够看出辣椒植株长势良好，因而，本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌IBFCBF-4及其发酵液能够有效的促进植株的生长。从表3中能够看出，T组的处理使辣椒的发病率明显低于另外两组的发病率，且防治效果更是明显大于另外两组的防治效果，由此能够说明本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌IBFCBF-4及其发酵液具有显著的拮抗效果。以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3